一種樟芝萃取物制備及分析方法
【專利摘要】本發(fā)明是提供一種樟芝萃取物優(yōu)化的制備及分析方法。通過數(shù)學(xué)及統(tǒng)計學(xué)的實驗設(shè)計，分析影響該萃取物的萃取率重要參數(shù)，并搭配核磁共振圖譜定量法及高效液相層析串聯(lián)質(zhì)譜法，以量化及鑒定樟芝萃取物及其特定三萜類化合物。通過前述技術(shù)，可以分析/檢測/量化藥品、保健食品或其他商品中是否含有麥角甾烷及/或羊毛甾烷三萜類化合物及其總含量及各別含量。
【專利說明】
_種樟芝萃取物制備及分析方法
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本案關(guān)于一種樟芝萃取物制備及分析方法，尤其，本案關(guān)于一種樟芝萃取物制備 及分析的優(yōu)化，以及該樟芝萃取物中麥角留烷三萜類化合物及/或羊毛留烷三萜類化合物 的準(zhǔn)確量化的分析方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 樟芝(Androdia cinnamomea)又稱樟燕、牛樟燕、牛樟芝等，為臺灣特有的真菌菌 種，生長于海拔400至2000公尺特有的牛樟樹(Cinnamomum kanehirai)樹干腐朽的心材內(nèi) 壁，或枯死倒伏的牛樟木材陰暗潮濕的表面。因此，要尋找到野生的樟芝子實體或確認(rèn)此多 孔菌目（Aphyllophorales)真菌菌株的外觀并不容易，也由于其生物活性成分具潛在的醫(yī) 藥價值，因此樟芝的價格居高不下。
[0003] 由于樟芝子實體不易被發(fā)現(xiàn)及以人工方式培養(yǎng)，目前市面上多為樟芝菌絲體產(chǎn) 品，其宣稱具有抗癌、減少治療引起的癥狀及其他副作用。此外，樟芝菌絲體產(chǎn)品也被發(fā)現(xiàn) 具有抗氧化、抗過敏、免疫刺激效果。這些產(chǎn)品宣稱具有與樟芝子實體相似的主要成分，包 括具有細(xì)胞毒殺效果的三萜類、類固醇及具有免疫刺激性的多醣體等。
[0004] 傳統(tǒng)上，樟芝被應(yīng)用于健康食品，以避免發(fā)炎、過敏、皮膚癬、肝癌的發(fā)生，因此，樟 芝菌絲體及子實體萃取物被認(rèn)為是具有潛力的化學(xué)治療藥物，以對抗肝癌、前列腺癌、膀胱 癌、肺癌細(xì)胞等，但各類有效成分的活性機制與抑制癌癥能力并未被完整厘清及探討。
[0005] 樟芝三萜類成分為其主要的二次代謝物，也是最受注目的活性成分。目前大部分 用以評估樟芝三萜類量化標(biāo)準(zhǔn)分為兩種方法，第一種是以重量也就是萃取率為依據(jù)，并以 乙醇作為萃取溶劑，設(shè)定不同萃取時間作為調(diào)控參數(shù)，以獲得的重量評估萃取率。但并無法 分析所得的萃取物中總?cè)祁惡?，以及麥角留烷與羊毛留烷三萜類各別含量。第二種則 是分光光度測定法，根據(jù)樟芝三萜類特有的官能基團（羧基-C00H)與特定試劑在特定條件 下反應(yīng)所成的復(fù)合物顏色，以比色法完成樟芝總?cè)祁惡康臏y定。
[0006] 此外，大多數(shù)三萜類分子結(jié)構(gòu)中含有雙鍵，在光譜的紫外光波長區(qū)段有吸收峰，因 此，可由紫外分光光度法于特定波長處測定吸收系數(shù)相近的總?cè)祁惡俊＠?，齊墩果酸 (oleanolic acid)為三萜類有機酸，因為齊墩果酸和待測成分的化學(xué)結(jié)構(gòu)相似，使用典型 的三砲類成分顯色劑（香草醛-冰醋酸-高氯酸（vanillin-glacial acetic acid-perchloric acid) 與其反映顯色 ，再以比色法測定其含量 。其具體的 顯色原理主要是使羧 基脫水，增加雙鍵結(jié)構(gòu)，再經(jīng)雙鍵位移，雙分子縮合等反應(yīng)生成共輒雙烯系統(tǒng)，并在酸作用 下形成陽離子而顯色，該方法為總?cè)祁惓煞值膶傩燥@色方法。不過此方法易造成偽陽 性，若待測樣品中其他成分結(jié)構(gòu)帶有羧基也會與特定顯色劑反應(yīng)而發(fā)生誤判。上述兩種方 法為常用于檢測樟芝總?cè)祁惖姆椒?，但其?zhǔn)確性不佳，要作為量化標(biāo)準(zhǔn)仍有改善空間。此 外，中國臺灣專利公開號TW 201416673 A揭露了牛樟芝三萜類成分的定量方法，其是以層 析方法取得牛樟芝指紋圖譜，再計算指定區(qū)間吸收峰與外部標(biāo)準(zhǔn)品的積分面積比值，進(jìn)一 步計算三萜類含量，但該發(fā)明公開案并未揭露樣品萃取方法以及樣品中包含麥角留烷及羊 毛甾烷三萜類的總含量及各別含量。此外，中國臺灣專利號1407100揭露了利用高效液相層 析分析牛樟芝三萜類的方法，但未揭露樟芝子實體所含有的三萜類的量化方法。
[0007] 本案
【申請人】鑒于現(xiàn)有技術(shù)中的不足，經(jīng)過悉心試驗與研究，并本著鍥而不舍的精 神，終構(gòu)思出本案"一種樟芝萃取物制備及分析方法"，能夠克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，以下為本 案的簡要說明。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0008] 為了克服現(xiàn)有技術(shù)無法有效量化樟芝萃取物的萃取率及其所含特定三萜類化合 物，以及建立樟芝萃取最佳工藝以更能確保及管控其所含總?cè)祁惖暮?，本發(fā)明對樟芝 源頭的萃取工藝進(jìn)行分析，開發(fā)三萜類成分準(zhǔn)確的量化標(biāo)準(zhǔn)來確保及管控樟芝來源的質(zhì) 量。本發(fā)明通過數(shù)學(xué)及統(tǒng)計學(xué)的實驗設(shè)計，分析影響該萃取物的萃取率重要參數(shù)，并搭配核 磁共振圖譜定量法及高效液相層析串聯(lián)質(zhì)譜法，以量化及鑒定樟芝萃取物及其特定三萜類 化合物。通過前述技術(shù)，可以分析/檢測/量化藥品、保健食品或其他商品中是否含有麥角甾 烷及/或羊毛留烷三萜類化合物及其總含量及各別含量。
[0009] 本文用語"樟芝萃取物"是指萃取自樟芝子實體、菌絲體或前二者的組合的萃取 物，意即樟芝子實體萃取物、樟芝子實體萃取物或樟芝子實體/菌絲體萃取物。較佳地，本文 內(nèi)容是以醇類萃取樟芝子實體、菌絲體或前二者的組合所獲得的萃取物。本文所揭示的醇 類較佳地為甲醇、乙醇或前二者的組合。較佳地，本文所揭示的醇類、甲醇及/或乙醇的濃度 為醇類、甲醇及/或乙醇與水調(diào)和后的濃度。本文的"樟芝"及"樟芝萃取物"含有麥角留烷三 萜類及/或羊毛留烷三萜類，其合稱為三萜類。各種麥角留烷三萜類及各種羊毛留烷三萜類 分別總稱為總麥角留烷三萜類及總羊毛留烷三萜類?？傷溄橇敉槿祁惣翱傃蛎敉槿?類的總稱為總?cè)祁悺４送?，實際上含有或者宣稱含有前述麥角留烷三萜類及羊毛留烷三 萜類的單方藥物、復(fù)方藥物、處方藥物、非處方藥物、健康食品、飲品、嗜好品或諸如此類均 落入本案"樟芝萃取物"的定義。
[0010] 本發(fā)明提供一種藥物組合物，其包括如后文所揭示的有效劑量的麥角留烷三萜類 (式I~式X)及羊毛留烷三萜類(式XI~式XIV)的組合物的其中之一。
[0011] 麥角留燒三砲類組合物包括于后文所揭示的antcin K(式I、式II)、antcin C(式 III、式IV)、樟芝酸C(式V、式VI)、樟芝酸B(式VII)、樟芝酸A(式VIII、式IX)及/或antcin A (式X)的組合物（或稱為立體異構(gòu)純化合物）；而羊毛留烷三萜類組合物包括去氫硫色多孔 菌酸(dehydrosulphurenic acid，式XI)、硫色多孔菌酸（sulphurenic acid，式XII)、去氫 齒孔酸(dehydroeburicoic acid，式XIII)及/或?qū)涌拙?eburicoic acid，式XIV) 〇
[0012] 本發(fā)明提供一種檢測樟芝中至少一麥角留烷三萜類組合物的含量的方法，包括下 列步驟：以醇類萃取樟芝子實體及/或菌絲體，獲得樟芝萃取物，以 1Η核磁共振圖譜儀檢測 樟芝萃取物，確定樟芝萃取物中是否具有至少一麥角留烷三萜類組合物。
[0013] 進(jìn)一步而言，前述檢測步驟還包括以1Η核磁共振圖譜儀檢測該至少一麥角留烷三 萜類組合物的第28位置亞甲基信號。
[0014] 再者，該檢測方法還用以同時檢測樟芝中至少一羊毛留烷三萜類組合物的含量， 包括步驟：以咕核磁共振圖譜儀檢測樟芝萃取物，確定樟芝萃取物中是否具有至少一羊毛 甾烷三萜類組合物。再以咕核磁共振圖譜儀檢測該至少一羊毛留烷三萜類組合物的第28位 置亞甲基信號。
[0015] 本發(fā)明另提出一種檢測一待測萃取物中的麥角留烷三萜類組合物的總含量的方 法，包括下列步驟：以特定麥角留烷三萜類化合物為標(biāo)準(zhǔn)品，配制為不同濃度并制作該標(biāo)準(zhǔn) 品的核磁共振圖譜及檢量線；以核磁共振圖譜儀分析待測萃取物中的麥角留烷三萜類組合 物的第28位置亞甲基信號；以及對比檢量線及第28位置亞甲基信號，由第28位置亞甲基信 號的積分面積比，計算待測萃取物中的麥角留烷三萜類組合物的總含量。
[0016] 參照前述檢測方法，本發(fā)明另提出一種檢測待測萃取物中的羊毛留烷三萜類組合 物的總含量的方法，包括下列步驟：以特定羊毛留烷三萜類化合物為標(biāo)準(zhǔn)品，配制為不同濃 度并制作該標(biāo)準(zhǔn)品的核磁共振圖譜及檢量線；以核磁共振圖譜儀分析待測萃取物中的羊毛 甾烷三萜類組合物的第28位置亞甲基信號；以及對比檢量線及第28位置亞甲基信號，由第 28位置亞甲基信號的積分面積比，計算待測萃取物中的羊毛留烷三萜類組合物的總含量。
[0017] 進(jìn)一步而言，該檢測待測萃取物中的麥角留烷三萜類組合物及羊毛留烷三萜類組 合物的總含量的方法還包括：以吡嗪(pyrazine)為該 1Η核磁共振圖譜的內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)品；檢測該 待測萃取物是否具有第28位置亞甲基信號于SH4.82(2H，br d);檢測該待測萃取物是否具 有第28位置亞甲基信號于δΗ 4.63(lH，s)以及4.70(lH，s)。而出現(xiàn)第28位置亞甲基信號分 別于δΗ 4.82(2H，br (1)、δΗ 4.63(lH，s)以及4.70(lH，s)表示該待測萃取物具有至少一麥角 甾烷三萜類組合物及羊毛留烷三萜類組合物。
[0018] 本發(fā)明另提供一種萃取樟芝中至少一麥角留烷三萜類組合物及至少一羊毛甾烷 三萜類組合物的方法，包含下列步驟:提供樟芝子實體及/或菌絲體并將其研磨為細(xì)粉;使 用醇類為萃取溶劑并設(shè)計不同萃取參數(shù)進(jìn)行萃取，獲得該樟芝子實體及/或菌絲體醇類萃 取物。其中該萃取物包括至少一麥角留烷三萜類組合物(立體異構(gòu)純化合物)及至少一羊毛 甾烷三萜類組合物。
[0019]較佳地，該萃取方法還包括:設(shè)定第一參數(shù)(溫度）、第二參數(shù)(時間）以及第三參數(shù) (例如乙醇濃度)為各別獨立的萃取參數(shù);接著將所得萃取物以核磁共振圖譜測定其麥角甾 烷三萜類組合物及羊毛留烷三萜類組合物第28位置亞甲基信號的積分面積值，該值即為萃 取反應(yīng)值;再設(shè)計不同萃取參數(shù)進(jìn)行萃取，依照所得的實驗結(jié)果，分析各別獨立的萃取參數(shù) 或參數(shù)與參數(shù)間的相互關(guān)系及其顯著水平，得到至少一麥角留烷三萜類組合物及至少一羊 毛甾烷三萜類組合物適當(dāng)?shù)妮腿?shù)，并通過多元回歸分析來計算獨立的萃取參數(shù)與萃取 反應(yīng)值的變化，如以下式I表示：
[0020] J廠=J。+ 為A].屮 J2.X.2: + 43:而 + + .為3'太03. + 423.:#，.Χ3. +. + + J33X32 (式 I)
[0021]其中y為萃取反應(yīng)值，六(0，1，2,3，12，13,23，11，22,33)代表常數(shù)，以1，2,3)為獨立 控制參數(shù)。
[0022]本發(fā)明另提出一種檢測一待測萃取物中至少一麥角留烷三萜類組合物各別含量 的方法，包括下列步驟：以醇類萃取樟芝子實體、菌絲體或子實體及菌絲體的混合物，獲得 醇類萃取物，以1Η核磁共振圖譜儀檢測醇類萃取物，確定醇類萃取物中是否具有至少一麥 角甾烷三萜類組合物。當(dāng)出現(xiàn)該至少一麥角留烷三萜類組合物時，以高效液相層析儀檢測 醇類萃取物中該至少一麥角留烷三萜類組合物(立體異構(gòu)純化合物)的含量。
[0023]再者，該檢測方法還用以同時檢測該待測萃取物中至少一羊毛留烷三萜類組合物 的各別含量，包括步驟：以1Η核磁共振圖譜儀檢測醇類萃取物，確定醇類萃取物中是否具有 至少一羊毛留烷三萜類組合物。當(dāng)出現(xiàn)該至少一羊毛留烷三萜類組合物時，以高效液相層 析儀檢測醇類萃取物中該至少一羊毛留烷三萜類組合物的含量。而高效液相層析技術(shù)使用 了全波長檢測器及/或串聯(lián)式質(zhì)譜儀所組合的檢測器。
[0024]進(jìn)一步而言，該檢測方法還包括:計算至少一麥角留烷三萜類組合物及至少一羊 毛甾烷三萜類組合物的pKa值;調(diào)整分離溶媒的pH值;于同一層析圖譜分析至少一麥角甾烷 三萜類組合物及至少一羊毛留烷三萜類組合物。
[0025]進(jìn)一步而言，該檢測方法還包括:層析醇類萃取物及對應(yīng)至少一麥角留烷三萜類 組合物及至少一羊毛留烷三萜類組合物的標(biāo)準(zhǔn)品；比較醇類萃取物及標(biāo)準(zhǔn)品的高效液相層 析圖譜；當(dāng)醇類萃取物的高效液相層析圖譜出現(xiàn)至少一麥角留烷三萜類組合物及至少一羊 毛甾烷三萜類組合物，進(jìn)一步使用串聯(lián)式質(zhì)譜儀進(jìn)行分析、建立至少一麥角留烷三萜類組 合物及至少一羊毛留烷三萜類組合物標(biāo)準(zhǔn)品的母離子(假性離子峰）、第一強度子離子及第 二強度子離子，作為判斷待測的醇類萃取物中是否具有至少一麥角留烷三萜類組合物及至 少一羊毛留烷三萜類組合物的依據(jù);配制各別標(biāo)準(zhǔn)品不同濃度并制作檢量線，以串聯(lián)式質(zhì) 譜儀分析待測醇類萃取物中至少一麥角留烷三萜類組合物及至少一羊毛留烷三萜類組合 物的標(biāo)準(zhǔn)品信號；及對比各別標(biāo)準(zhǔn)品檢量線得到積分面積比，計算待測醇類萃取物中的至 少一麥角留烷三萜類組合物及至少一羊毛留烷三萜類組合物的各別含量。
[0026]根據(jù)上述構(gòu)想，本發(fā)明可用以檢測含有至少一麥角留烷三萜類組合物及至少一羊 毛甾烷三萜類組合物的復(fù)方藥物中其總含量及各別含量、含有至少一麥角留烷三萜類組合 物及至少一羊毛留烷三萜類組合物的單方藥物中其總含量及各別含量，或其他中草藥樣品 中是否存在至少一種前述兩類化合物或是存在至少一種前述兩類化合物中特定化合物的 總含量及各別含量。進(jìn)一步地，再檢測這兩類化合物或兩類化合物中特定化合物在復(fù)方藥 物、單方藥物或中草藥樣品中的比例。
【附圖說明】
[0027]圖1為本發(fā)明中以加熱回流萃取法萃取樟芝乙醇萃取物總?cè)祁惖墓痉薘圖譜 (DMS0-d6,400MHz)。
[0028] 圖2為本發(fā)明中以超聲波震蕩萃取法萃取樟芝乙醇萃取物總?cè)祁惖?H NMR圖譜 (DMS0-d6,400MHz)。
[0029] 圖3為總麥角留烷三萜類化合物與總羊毛留烷三萜類化合物的最佳萃取條件預(yù)期 值的示意圖。
[0030] 圖4為本發(fā)明中樟芝子實體乙醇萃取物的優(yōu)化高效液相層析圖。
[0031]圖5為本發(fā)明中高效液相層析串聯(lián)質(zhì)譜儀內(nèi)部標(biāo)準(zhǔn)品靈芝酸A(ganoderic acid A)的化學(xué)結(jié)構(gòu)式。
【具體實施方式】
[0032]本案所提出的"一種樟芝萃取物制備及分析方法"將可由以下的實施例說明而得 到充分了解，使得本領(lǐng)域的技術(shù)人員可以據(jù)以完成之，然而本案的實施并非可由下列實施 例而被限制其實施方式，本領(lǐng)域的技術(shù)人員仍可依據(jù)除已揭露的實施例的精神推演出其他 實施例，這些實施例皆當(dāng)屬于本發(fā)明的范圍。
[0033] 實施例
[0034]本發(fā)明萃取的麥角留烷三萜類組合物E1~E12的結(jié)構(gòu)式(式I至式X)詳列如下。


[0039] 本發(fā)明萃取的羊毛留烷三萜類組合物L(fēng)1~L4的結(jié)構(gòu)式(式XI至式XIV)詳列如下。
[0040]

[0042]實驗1、核磁共振圖譜分析
[0043]三萜類化合物為樟芝的主要二次代謝物，分為麥角留烷以及羊毛留烷兩類。本發(fā) 明利用核磁共振圖譜分析法進(jìn)行樟芝萃取物（以樟芝子實體乙醇萃取物為例，但不以此為 限）中總麥角留烷三萜類化合物與總羊毛留烷三萜類化合物的絕對含量分析。
[0044]檢測實驗流程如下。首先選擇適當(dāng)?shù)碾軇又x擇此兩類化合物的標(biāo)準(zhǔn)品， 分別以不同濃度制作檢量線，并添加一定量的內(nèi)部標(biāo)準(zhǔn)品于欲分析的標(biāo)準(zhǔn)品中，計算各標(biāo) 準(zhǔn)品特征信號與內(nèi)部標(biāo)準(zhǔn)品目標(biāo)信號的積分面積比值，并利用線性回歸將此積分值與濃度 作圖，即可得到兩類化合物標(biāo)準(zhǔn)品的檢量線。再配置一定濃度的樟芝子實體乙醇萃取物，加 入等量的氘代溶劑以及內(nèi)部標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行核磁共振圖譜分析，在積分兩類化合物的標(biāo)準(zhǔn)品的 特征信號與內(nèi)部標(biāo)準(zhǔn)品的目標(biāo)信號后計算積分比值，再通過檢量線求得兩類化合物于樟芝 子實體乙醇萃取物中的絕對總含量。
[0045]本發(fā)明利用核磁共振圖譜分析法進(jìn)行樟芝子實體乙醇萃取物中總麥角留烷三萜 類化合物與總羊毛留烷三萜類化合物的絕對含量分析。實驗條件如下，配置不同濃度的兩 類化合物的標(biāo)準(zhǔn)品，分別為麥角留烷三萜類的樟芝酸A以及羊毛留烷三萜類的去氫齒孔酸， 并加入0.132mg的內(nèi)部標(biāo)準(zhǔn)品吡嗪(pyrazine)，同時溶于0.6mL的DMS0-d6溶液作為進(jìn)行核 磁共振圖譜分析的測試溶劑，核磁共振儀為Varian UNITY plus 400MHz圖譜儀，掃描次數(shù) 為10次(7分鐘），圖譜寬度為6002.4Hz，強度脈沖寬度為6.3ys。前述測試溶劑可為但不限于 DMS0-d6溶液、CDC13以及C5D5N等。請參閱表1與表2，再使用手動選擇兩類化合物標(biāo)準(zhǔn)品第28 位置亞甲基特征信號的起點及終點，計算其波峰積分面積以及與內(nèi)部標(biāo)準(zhǔn)品吡嗪目標(biāo)信號 (δΗ 8.66)的積分面積比值，麥角留烷三萜類標(biāo)準(zhǔn)品樟芝酸A的特征質(zhì)子(第28號位置亞甲 基)吸收信號在4.82(2H，br d)，羊毛留烷三萜類標(biāo)準(zhǔn)品去氫齒孔酸的特征質(zhì)子(第28號 位置亞甲基)吸收信號在知4.63(lH，s)以及4.70(lH，s)。前述試驗進(jìn)行三重復(fù)并計算相對 標(biāo)準(zhǔn)偏差的數(shù)值(RSD%)。
[0046]請參閱表3,其利用線性回歸將此積分比值與濃度作圖，得到兩類化合物標(biāo)準(zhǔn)品的 檢量線(標(biāo)準(zhǔn)曲線、回歸分析的決定系數(shù)），作為此定量分析方法的依據(jù)。
[0047]實驗2、樟芝子實體中麥角留烷及羊毛留烷三萜類組合物的萃取方式設(shè)計 [0048]將干燥樟芝子實體磨成細(xì)粉或剪成碎片，以1:10~1:20比例（重量/體積)置于75 °(：的95%乙醇溶液，回流及/或超聲波震蕩2小時。萃取物冷卻后再置于4°C隔夜沉淀。再以 濾紙過濾萃取物的上清液，以3,000rpm離心30分鐘以去除沉淀物，將萃取物冷凍干燥并儲 存于-70°C，即為樟芝子實體乙醇萃取物。
[0049]由實驗1的核磁共振圖譜分析已知濃度的乙醇萃取物中總麥角留烷及總羊毛甾烷 三萜類組合物的積分比值，進(jìn)而計算出總麥角留烷及總羊毛留烷三萜類組合物的濃度。
[0050] 請參閱圖1及圖2,其分別為本發(fā)明中以加熱回流萃取法及超聲波震蕩萃取法萃取 樟芝乙醇萃取物總?cè)祁惖墓綨MR圖譜。本發(fā)明以此兩種不同萃取方法進(jìn)行預(yù)試驗，由核 磁共振圖譜分析得知這兩種萃取方法的總麥角留烷與總羊毛留烷三萜類化合物特征信號 的積分面積值無太大的差異性，證明以核磁共振圖譜分析樟芝子實體中總麥角留烷及總羊 毛甾烷三萜類組合物的濃度的適當(dāng)性。
[0051] 實驗3、樟芝子實體中麥角留烷及羊毛留烷三萜類組合物濃度的萃取參數(shù)設(shè)計 [0052]本發(fā)明以數(shù)學(xué)及統(tǒng)計學(xué)設(shè)計實驗，分析影響樟芝子實體中麥角留烷及羊毛留烷三 萜類組合物濃度的萃取參數(shù)，作為控制或改良的參考依據(jù)。根據(jù)預(yù)試驗實際數(shù)據(jù)，建立參數(shù) 與參數(shù)間相互關(guān)系的數(shù)學(xué)模式，并通過該模式尋找出極值點的位置，包含極大值及極小值。 [0053]本發(fā)明實驗設(shè)計的模式建立了每種萃取參數(shù)的三個域值(_1、0、+ 1)，進(jìn)而找尋最 佳萃取條件，意即該范圍須包括極大值及極小值。本發(fā)明實驗中三種獨立的萃取參數(shù)分別 為第一參數(shù)(溫度）、第二參數(shù)(時間）以及第三參數(shù)（乙醇濃度），作為評估最佳萃取工藝的 控制參數(shù)。萃取條件相對反應(yīng)值即以核磁共振圖譜分析測定樟芝子實體乙醇萃取物中總麥 角甾烷及總羊毛留烷三萜類特征信號的積分面積值為依據(jù)。在預(yù)試驗中得知三種控制參數(shù) 各自的極大值與極小值，再通過數(shù)學(xué)及統(tǒng)計學(xué)的模式設(shè)計，設(shè)計出16種不同的萃取條件(域 值_1、〇、+1的組合），其中通過中心點6次(0)代表評估模式設(shè)計的缺適性及提供誤差的信息 (參閱表4、5)。
[0054] 值得注意的是，本發(fā)明以3種參數(shù)及其極大值、極小值以及介于極大值與極小值之 間的中間值作為樟芝最佳萃取工藝的控制參數(shù)，但本領(lǐng)域的技術(shù)人員均可充分理解，以多 種參數(shù)，例如2種、3種、4種或更多參數(shù)，作為控制參數(shù)亦是可行的。而且，多種參數(shù)也不限于 溫度、時間及乙醇濃度，凡涉及樟芝萃取的參數(shù)均可作為控制參數(shù)，例如壓力、樟芝碎裂研 磨程度、樟芝與溶液的重量體積比例等。除了參數(shù)的極大值、極小值以及介于其間的中間值 可作為樟芝最佳萃取工藝的控制參數(shù)之外，參數(shù)的極大值、極小值以及介于其間的任一數(shù) 值亦可作為樟芝最佳萃取工藝的控制參數(shù)。
[0055] 實驗4、樟芝子實體中麥角留烷及羊毛留烷三萜類組合物其濃度的最佳萃取參數(shù) [0056]分別秤取重量為70mg干燥樟芝子實體細(xì)粉，配置上述16種不同的萃取條件并使用 超聲波震蕩萃取法進(jìn)行萃取。將所得的16種條件的萃取物使用回旋濃縮機抽干，再取6mg的 各別萃取物加入等量的氘代溶劑以及內(nèi)部標(biāo)準(zhǔn)品（〇.132mg的內(nèi)部標(biāo)準(zhǔn)品吡嗪，溶于0.6mL 的DMS0-d6)進(jìn)行核磁共振圖譜分析，以核磁共振圖譜分析評估不同條件所得樟芝乙醇萃取 物中總麥角留烷與總羊毛留烷三萜類的特征信號其積分面積值。
[0057] 請參閱表6,其為以核磁共振圖譜測定16種不同萃取條件所得的反應(yīng)值。由表6可 知溫度、時間以及乙醇濃度分別于50 °C、60分鐘以及95 %乙醇溶液的萃取條件下，可得到總 麥角留烷與總羊毛留烷三萜類化合物最佳的積分面積值，分別為40.33及13.59。
[0058] 將上述的結(jié)果通過多元回歸分析來計算獨立的萃取參數(shù)與萃取反應(yīng)值的變化，如 以下式I表示：
[0059] y = A0 + Al.xl + A2x2 4- Α,.χ, + Aaxtx2 + + Α23χ2χ3 + Αηχ'~ + Λ?2.χ^ + Λ?3χ；(式 1)，：
[0060] 其中y為萃取反應(yīng)值，六(0，1，2,3，12，13,23，11，22,33)代表常數(shù)，以1，2,3)為獨立 控制參數(shù)。多元回歸分析的線性、二次和交叉乘積項和P值(顯著水平)請參閱表7。變異性分 析顯示出決定(判定）系數(shù)R 2皆大于0.90,分別是0.97以及0.94。此數(shù)據(jù)證明所建立的模式 可充分解釋約95%由獨立控制參數(shù)或參數(shù)與參數(shù)間所產(chǎn)生的反應(yīng)值(變異性）。而模式的缺 適性是反應(yīng)實驗設(shè)計的缺乏度，結(jié)果顯示P值大于0.05,分別是0.09以及0.61，表示本發(fā)明 的設(shè)計模式是足夠準(zhǔn)確的預(yù)測反應(yīng)的變異性。此外，由回歸分析可得知此模式所設(shè)計的條 件于總麥角留烷與總羊毛留烷三萜類的P值皆小于0.001(參閱表8)。因此，本發(fā)明的設(shè)計模 式顯示出一個非常適合且合理的代表數(shù)據(jù)。在本發(fā)明的實驗設(shè)計中，16種條件所得的反應(yīng) 值皆可使用多元回歸方程充分解釋，進(jìn)一步確定以所建立的回歸模式進(jìn)行預(yù)測不同的萃取 參數(shù)針對樟芝總麥角留烷與總羊毛留烷三萜類的含量變化是可行的。
[0061] 前述式(I)為以3種萃取參數(shù)進(jìn)行多元回歸分析的方程式。本領(lǐng)域的技術(shù)人員均理 解，當(dāng)以2種、4種或更多萃取參數(shù)進(jìn)行多元回歸分析時，式（I)方程式及其分析統(tǒng)計方法均 可適當(dāng)改寫及修飾，而前述改寫及修飾均落于本發(fā)明申請專利范圍之內(nèi)。
[0062] 除了評估由建立模式所得數(shù)據(jù)的合理性及缺適性外，也分析了獨立的控制參數(shù)及 各別參數(shù)間的相互影響關(guān)系（參閱表8)。在麥角留烷三萜類的獨立參數(shù)中，第三參數(shù)（乙醇 濃度）的P值小于〇.〇1;其余獨立參數(shù)中一次項的交叉乘積(溫度、時間及乙醇濃度)和獨立 參數(shù)的一次項的平方(溫度、時間及乙醇濃度）的P值大于0.05,因此表示乙醇的濃度于萃取 樟芝麥角留烷三萜類成分為主要的控制參數(shù)。相同的情況也發(fā)現(xiàn)于羊毛留烷三萜類的獨立 參數(shù)中，第三參數(shù)（乙醇濃度）的P值小于0.01。此外于第一參數(shù)(溫度）的平方(? 2)的P值小 于0.05,表示除了乙醇濃度的比例于萃取樟芝羊毛留烷三萜類成分為主要的控制參數(shù)，溫 度也是另一個顯著的控制參數(shù)。
[0063]本發(fā)明以樟芝子實體三萜類萃取工藝為驗證模式，搭配數(shù)學(xué)及統(tǒng)計學(xué)的方式模式 設(shè)計，進(jìn)而得到樟芝三萜類化合物最佳萃取工藝的三個獨立參數(shù)(溫度、時間及乙醇濃度） 預(yù)期值，分別為54.6度、58.9分鐘以及95% (參閱圖3)。而萃取工藝主要的控制參數(shù)為乙醇 濃度，于麥角留烷與羊毛留烷三萜類其P值皆小于0.05。由表8得知，羊毛留烷三萜類另一個 顯著的控制參數(shù)出現(xiàn)在第一參數(shù)(溫度）的平方，其P值為0.014。本發(fā)明以所設(shè)計的模式分 析出在最佳工藝54.6°C、58.9分鐘以及95%乙醇濃度的條件下可得到最大預(yù)期值。意即，當(dāng) 溫度在接近55度時，羊毛留烷三萜類可達(dá)到最高萃取率，但若溫度繼續(xù)上升或不足55度時， 其萃取率則會下降。而時間參數(shù)對于兩類化合物是最無統(tǒng)計差異的因素，因為超聲波萃取 方式可以提升萃取效率。本發(fā)明發(fā)現(xiàn)以超聲波萃取超過60分鐘即已達(dá)飽和。
[0064]因此，本領(lǐng)域的技術(shù)人員可以依照實驗3及實驗4的內(nèi)容先由萃取參數(shù)的設(shè)計來萃 取小量樟芝，通過小量樟芝萃取物的核磁共振圖譜分析及多元回歸分析，尋求最佳萃取工 藝參數(shù)或使用者所需的萃取工藝參數(shù)，再以該最佳萃取工藝參數(shù)或使用者所需的樟芝萃取 工藝參數(shù)來大量萃取樟芝。因此，所獲得的樟芝萃取物將含有優(yōu)化比例或最大量的總麥角 甾烷三萜類化合物與總羊毛留烷三萜類化合物，或者使用者所希望的總麥角留烷三萜類化 合物與總羊毛留烷三萜類化合物的含量或比例。
[0065]實驗5、總麥角留烷三萜類化合物與總羊毛留烷三萜類化合物的絕對含量分析 [0066]將最佳工藝的萃取物所得的兩類化合物積分比值帶入檢量線換算后，在lmg樟芝 子實體乙醇萃取物中，總麥角留烷三萜類化合物的絕對含量為513 ± 0.18yg/mg，總羊毛甾 烷三萜類化合物的絕對含量為187±0.25yg/mg。本發(fā)明以統(tǒng)計方式建立一快速、節(jié)能且有 效益的萃取工藝，以提高樟芝角留烷與羊毛留烷三萜類的萃取率。
[0067]實驗6、麥角留烷三萜類化合物與羊毛留烷三萜類化合物的高效液相層析分析 [0068]樟芝子實體特有的麥角留烷及羊毛留烷三萜類成分其結(jié)構(gòu)皆具有羧基，于酸性的 流動相會得到較好的層析效果，現(xiàn)有技術(shù)也由樟芝子實體乙醇萃取物的高效液相層析圖確 立樟芝麥角留烷及羊毛留烷三萜類成分于乙腈-水(0.1 %有機酸）或甲醇-水(0.1 %有機 酸)能得到較佳的層析圖譜。在此條件下，雖然可同時檢測麥角留烷及羊毛留烷三萜類化合 物的滯留時間，但并未能夠完全分離麥角留烷三萜類立體異構(gòu)混合物。為了得到更佳的分 離及分辨率，本發(fā)明進(jìn)一步分析三萜類化合物的解離常數(shù)，再使用在線"Sparc化學(xué)自動推 理軟件"（SPARC，全稱Sparc Performs Automated Reasoning in Chemistry)化學(xué)演算軟 件計算樟芝子實體各個麥角留烷以及羊毛留烷三萜類化合物(包含12種麥角留烷化合物 E1-E12及4種羊毛留烷三萜類化合物L(fēng)1-L4)的酸度系數(shù)(參閱表9)。此兩類三萜類化合物的 酸度系數(shù)范圍約在4.40~4.60。接著，配置五種不同pH值的流動相，分別為3.75、4.00、 4.25、4.50以及5.00,進(jìn)行高效液相層析的圖譜分析比較。針對層析優(yōu)化條件進(jìn)行探討，分 析結(jié)果的評估是以各層析圖譜中各三萜類化合物(E1-E12，L1-L4)的分辨率(Resolution， Rs)作為判定依據(jù)。
[0069]高效液相層析的條件如下：高效液相層析儀為安捷倫1200HPLC系統(tǒng)（Agilent Technologies);檢測器為API 4000 三重四級桿質(zhì)譜儀（triple quadrupole spectrometer) (Applied Biosystem,Foster City，CA,USA);高效液相層析管柱為安捷倫 EC-C18(150 X 4.6mm);流動相中的溶劑A為乙腈、溶劑B為純水并添加0.1 %醋酸混合10mM醋 酸銨并調(diào)整pH值分別為3.75、4.00、4.25、4.50以及5.00;流速為1.3ml/min;管柱溫度為室 溫、檢測波長為UV 254nm。溶媒系統(tǒng)條件如下:流動相包括溶劑A及B、線性梯度為0~15分鐘 (39%A ~44%A)、15 ~17.5分鐘（44%厶~45%厶）、17.5~22.5分鐘（45%厶~47%厶）、22.5~ 27.5分鐘（47%4~50%4)、27.5~30分鐘（50%4~53%4)、30~35分鐘（53%4~55%4)、35 ~45 分鐘（55%A ~65%A)、45 ~55 分鐘（65%A ~98%A)及 55 ~60 分鐘（98%A ~100%A)。流 速及管柱溫度如上所述。
[0070]結(jié)果顯示當(dāng)流動相pH值為4.25時，各麥角甾烷以及羊毛甾烷三萜類化合物會得到 較佳的分辨率(參閱圖4)。本發(fā)明建立的優(yōu)化高效液相層析圖譜中，兩兩一對的麥角留烷三 萜類化合物具有較佳的分辨率及分離效果，可應(yīng)用于高效液相層析串聯(lián)質(zhì)譜儀定量分析 (如:三重四級桿質(zhì)譜儀）。再者，待測分析化合物包含12種麥角留烷以及4種羊毛留烷三萜 類化合物，雖然層析圖只顯示出兩個羊毛留烷三萜類化合物的信號，分別為去氫硫色多孔 菌酸(L1)及去氫齒孔酸(L3)，但化合物L(fēng)1與L2(硫色多孔菌酸)結(jié)構(gòu)相似，化合物L(fēng)3與L4(層 孔菌酸）結(jié)構(gòu)相似，結(jié)構(gòu)上皆僅有兩組雙鍵(于C7-C8以及C9-C11)與一組雙鍵(于C8-C9)的 差異。雖然于所建立的層析條件下，化合物L(fēng)1與L2的波峰重疊，L3與L4的波峰重疊，但其分 子量并不相同，可根據(jù)其分子量不相同的特性，利用高效液相層析串聯(lián)質(zhì)譜儀于上述優(yōu)化 高效液相層析條件下進(jìn)行羊毛留烷三萜類化合物的定性、定量測定。
[0071]實驗7、麥角留烷三萜類化合物與羊毛留烷三萜類化合物的各別含量分析 [0072]進(jìn)一步建立樟芝子實體乙醇萃取物中16個三萜類化合物(E1-E12，L1-L4)于高效 液相層析串聯(lián)質(zhì)譜儀的定量分析，檢測器亦選用定量準(zhǔn)確性高的三重四級桿質(zhì)譜儀并以 MRM為離子掃描模式進(jìn)行。本實驗中選擇了分子量516的靈芝酸A(參閱圖5)作為內(nèi)部標(biāo)準(zhǔn) 品，其理化及質(zhì)譜性質(zhì)皆與待測的16個三萜類化合物相似。所使用液相層析串聯(lián)質(zhì)譜儀為 安捷倫1200HPLC系統(tǒng)及API 4000三重四級桿質(zhì)譜儀，游離源為電噴灑游離(ESI)并搭配負(fù) 離子模式進(jìn)行檢測。
[0073]由16種三萜類化合物(E1-E12，L1-L4)及內(nèi)部標(biāo)準(zhǔn)品靈芝酸A分別取兩組子離子 對，第一強度離子對作為定量離子(Quantitation transitions)，第二強度離子對則用來 作為定性離子。其優(yōu)化質(zhì)譜參數(shù)與萃取離子層析圖（Extracted Ion Chromatogram,XIC)與 16個三萜類化合物子離子質(zhì)譜圖請參閱表10。為了同時檢測16個三萜類化合物，進(jìn)一步配 制各標(biāo)準(zhǔn)品五種不同濃度（l〇-l〇〇〇ng/ml)，計算每個濃度下各化合物與內(nèi)部標(biāo)準(zhǔn)品定量離 子的積分比值并繪制檢量線。表10的結(jié)果顯示16種三萜類化合物的線性回歸相關(guān)系數(shù)的平 方值(R 2)皆大于0.99。由高效液相層析串聯(lián)質(zhì)譜儀定量方法檢測樟芝乙醇萃取物中的16種 三萜類化合物的各別含量如表11所示。
[0074]本發(fā)明實屬難能的創(chuàng)新發(fā)明，深具產(chǎn)業(yè)價值，援依法提出申請。此外，本發(fā)明可以 由本領(lǐng)域技術(shù)人員做任何修改，但不脫離如所附申請專利范圍所要保護的范圍。
[0075]表1、不同濃度的麥角留烷三萜類標(biāo)準(zhǔn)品樟芝酸A第28位置亞甲基特征信號與內(nèi)部 標(biāo)準(zhǔn)品目標(biāo)信號的積分面積比值及相對標(biāo)準(zhǔn)偏差 [0076]
[0077]表2、不同濃度的羊毛留烷三萜類標(biāo)準(zhǔn)品去氫齒孔酸第28位置亞甲基特征信號與 內(nèi)部標(biāo)準(zhǔn)品目標(biāo)信號的積分面積比值及相對標(biāo)準(zhǔn)偏差
[0078]
[0079] 表3、樟芝酸A與去氫齒孔酸的檢量線
[0081 ]表4、樟芝三萜類萃取工藝的三種獨立的萃取參數(shù)及域值 [0082]
[0083]表5、以數(shù)學(xué)及統(tǒng)計學(xué)模式設(shè)計16種樟芝三萜類萃取工藝的條件
[0085]表6、以核磁共振圖譜分析測定16種不同萃取條件的總麥角甾烷與總羊毛甾烷三 萜類積分面積值
[0087]表7、溫度、時間與乙醇濃度于樟芝子實體乙醇萃取物中的變異性分析
[0089] DF:自由度
[0090] 表8、麥角甾烷與羊毛甾烷三萜類于各別控制參數(shù)的回歸分析及顯著水平值
[0092] a溫度(Xi)，時間(X2)及乙醇濃度％ (X3)
[0093] bP〈0.05表明統(tǒng)計上的顯著性
[0094] 表9、在線"Sparc化學(xué)自動推理軟件"化學(xué)演算軟件所計算的麥角甾烷以及羊毛甾 烷化合物酸度系數(shù)


[0098] 表10、樟芝乙醇萃取物中16個三砲類化合物于高效液相層析串聯(lián)質(zhì)譜法優(yōu)化質(zhì)譜 條件及其回歸相關(guān)系數(shù)
[0099]

[0102] 表11、由高效液相層析串聯(lián)質(zhì)譜儀檢測樟芝乙醇萃取物中16個三萜類化合物的各 別含量(yg/mg)
[0103]
【主權(quán)項】
1. 一種精芝的萃取方法，包括步驟： (a) 選擇第一參數(shù)、第二參數(shù)及第Ξ參數(shù)，其中該第一、該第二及該第Ξ參數(shù)各具有極 大值、極小值W及介于該極大值與該極小值之間的數(shù)值，并將各該極小值、該數(shù)值及該極大 值分別給定域值-1、域值0及域值1; (b) W該域值-1、該域值0及該域值1組合出多個萃取條件來萃取少量的精芝，獲得多個 精芝萃取物； (C)使用式I方程式評估各該多個精芝萃取物的萃取反應(yīng)值： '、' =/," + /!1'Υ? + /1^2 f -l· '·?ι:Α-術(shù) + 一玉?'Λ-; + /Ι?Α) + (式1)， 其中y為該萃取反應(yīng)值，Α(0,1，2...)為常數(shù)，x(l，2,3)為該第一、該第二及該第Ξ參 數(shù)； (d) 對該多個精芝萃取物進(jìn)行核磁共振圖譜分析，獲得各該多個精芝萃取物中總麥角 醬燒Ξ祗類與總羊毛醬燒Ξ祗類的特征信號的積分面積值；W及 (e) 依據(jù)該萃取反應(yīng)值、該積分面積值及使用者的需要，使用該第一、該第二及該第Ξ 參數(shù)的該極大值、該極小值、介于該極大值與該極小值之間的該數(shù)值W及介于該極大值與 該極小值之間的任一數(shù)值的其中之一對大量的精芝進(jìn)行萃取，W獲得精芝萃取物。2. 如權(quán)利要求1所述的萃取方法，其中該精芝為精芝子實體、精芝菌絲體或其組合，且 該第一參數(shù)、第二參數(shù)及第Ξ參數(shù)分別為溫度、時間及醇類濃度。3. 如權(quán)利要求2所述的萃取方法，其中該溫度的極大值、極小值W及介于該極大值與該 極小值之間的數(shù)值分別為75°C、25°C及50°C。4. 如權(quán)利要求2所述的萃取方法，其中該時間的極大值、極小值W及介于該極大值與該 極小值之間的數(shù)值分別為90分鐘、30分鐘及60分鐘。5. 如權(quán)利要求2所述的萃取方法，其中該醇類濃度為醇類與水調(diào)制的濃度，且該醇類為 甲醇及乙醇的其中之一。6. 如權(quán)利要求5所述的萃取方法，其中當(dāng)該醇類為該乙醇時，該乙醇與水調(diào)制為乙醇濃 度，該乙醇濃度的極大值、極小值W及介于該極大值與該極小值之間的數(shù)值分別為95%、 35% 及 65%。7. 如權(quán)利要求1所述的萃取方法，其中在54.6°C的該溫度、58.9分鐘的該時間及95%的 該乙醇濃度的條件下，該精芝的該總麥角醬燒Ξ祗類與總羊毛醬燒Ξ祗類的萃取量最高。8. -種分析方法，用于優(yōu)化精芝的萃取工藝參數(shù)，包括步驟： (a) 選擇第一參數(shù)、第二參數(shù)及第Ξ參數(shù)，其中該第一、該第二及該第Ξ參數(shù)各具有極 大值、極小值W及介于該極大值與該極小值之間的數(shù)值，并將該極小值、該數(shù)值及該極大值 分別給定域值-1、域值0及域值1; (b) W該域值-1、該域值0及該域值1組合出多個萃取條件來萃取精芝，W獲得多個精芝 萃取物； (C)使用式I方程式評估各該多個精芝萃取物的萃取反應(yīng)值： J 卡 Λ-、? + + '4八,+ .4。；\-而 + 4;王1'(3 + 卡少2了2: + （式I)， 其中y為該萃取反應(yīng)值，A(0,1,2...)為常數(shù)，x(l，2,3)為該第一、該第二及該第Ξ參 數(shù)； (d)對該多個精芝萃取物進(jìn)行核磁共振圖譜分析，w獲得各該多個精芝萃取物中總麥 角醬燒Ξ祗類與總羊毛醬燒Ξ祗類的特征信號的積分面積值，并由該積分面積值及該萃取 反應(yīng)值決定該精芝的最佳萃取工藝參數(shù)。9. 如權(quán)利要求8所述的分析方法，更包括:步驟(e)W高效液相層析串聯(lián)質(zhì)譜儀分析該 總麥角醬燒Ξ祗類中各麥角醬燒Ξ祗類W及該總羊毛醬燒Ξ祗類中各羊毛醬燒Ξ祗類的 母離子、第一強度子離子及第二強度子離子，W計算各麥角醬燒Ξ祗類及各羊毛醬燒Ξ祗 類的含量。10. -種分析方法，用于優(yōu)化精芝的萃取工藝參數(shù)，包括： (a) 選擇多個參數(shù)，其中各該參數(shù)具有極大值、極小值W及介于該極大值與該極小值之 間的數(shù)值，并將該極小值、該數(shù)值及該極大值分別給定域值-1、域值0及域值1; (b) W該域值-1、該域值0及該域值1組合出多個萃取條件來萃取精芝，W獲得多個精芝 萃取物；W及 (C)使用多元回歸計算各該多個精芝萃取物的萃取反應(yīng)值，并據(jù)W決定該精芝的最佳 萃取工藝參數(shù)。11. 如權(quán)利要求10所述的分析方法，其中步驟k)更包括： (cl)對該多個精芝萃取物進(jìn)行核磁共振圖譜分析，W獲得各該多個精芝萃取物中總Ξ 祗類的特征信號的積分面積值;W及 該積分面積值W及萃取反應(yīng)值決定該精芝的該最佳萃取工藝參數(shù)。
【文檔編號】B01D11/02GK106093260SQ201610278762
【公開日】2016年11月9日
【申請日】2016年4月28日 公開號201610278762.7, CN 106093260 A, CN 106093260A, CN 201610278762, CN-A-106093260, CN106093260 A, CN106093260A, CN201610278762, CN201610278762.7
【發(fā)明人】吳永昌, 呂美津, 吳東穎, 杜英齊
【申請人】吳永昌