本發(fā)明涉及分子生物學(xué)和分子遺傳學(xué)及細(xì)胞生物學(xué)領(lǐng)域，特別涉及到dna的提取和純化方法。

背景技術(shù)：

近十幾年來，分子生物學(xué)和細(xì)胞遺傳學(xué)發(fā)展迅速，涉及dna的測(cè)序、克隆、功能分析及鑒定的技術(shù)在醫(yī)學(xué)、農(nóng)林業(yè)、環(huán)境、海洋、法醫(yī)學(xué)等領(lǐng)域得到廣泛而深入的應(yīng)用。bac(bacterialartificialchromosome)克隆是當(dāng)前存儲(chǔ)、擴(kuò)增dna大片斷，特別是基因組dna大片斷的主要方法。bac克隆長(zhǎng)度一般在100kb至300kb不等。由于bac克隆插入dna片斷較大，轉(zhuǎn)染大腸桿菌后所產(chǎn)生的拷貝數(shù)較低。無(wú)論是現(xiàn)有的離子交換柱法，還是手工方法提取均有一些缺陷和難于克服的困難。

現(xiàn)有提取與純化方法仍主要采用離子交換柱分離方法。如qiagen公司的plasmidmaxikit(catno.12163)、omegabio-tek公司的bac/pacdnamaxikit(d2154-01)，這些商用化試劑盒一般能夠滿足日常試驗(yàn)中低于10ug和片斷大小低于100kb的提取需要。離子交換柱提取法所收獲的dna產(chǎn)量一般較低，特別在大片斷dna提取過程中，有時(shí)很不理想。同樣，大容量的商業(yè)化提取試劑盒價(jià)格一般較高昂。有些試劑盒在某種程度上也存在可靠性與穩(wěn)定性的問題。

為克服柱法提取的問題，同時(shí)為了節(jié)省成本，不少研究與應(yīng)用技術(shù)人員采用了手工操作的方法提取dna，但其中多數(shù)方法中應(yīng)用了酚、氯仿等有毒有害的有機(jī)溶劑，對(duì)實(shí)驗(yàn)人員和環(huán)境危害很大。同時(shí)，手工提取過程也極易導(dǎo)致dna產(chǎn)物被有機(jī)溶劑污染，直接影響下游實(shí)驗(yàn)。

采用傳統(tǒng)的手工抽提，dna的降解程度高，一般從500ml培養(yǎng)液中其dna產(chǎn)物量遠(yuǎn)低于10ug。dna降解后的小分子片段也會(huì)影響dna計(jì)量的準(zhǔn)確性。圖1為應(yīng)用堿性裂解法，然后用苯酚-氯仿-異戊醇(25:24:1)混合物提純，最后用異丙醇(isopropylalcohol)沉淀出的dna結(jié)果。從圖1中可以很明顯地觀察到在低于100bp的位置存在了大量的dna降解后的小分子片斷。這些小分子片斷會(huì)造成260nm處核酸吸光值超常放大，從而在分光光度計(jì)位于260nm處的吸光值呈現(xiàn)出異常高的數(shù)值，使260/280及260/230的比值呈現(xiàn)出遠(yuǎn)大于正常量的情況。這種不正常的260讀數(shù)會(huì)導(dǎo)致dna計(jì)量的錯(cuò)誤。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于克服上述大片段dna提取過程存在的dna易水解、數(shù)量少、易污染、成本高的問題，提供一種從大體積bac克隆細(xì)菌培養(yǎng)液中提取質(zhì)量高、數(shù)量充分、無(wú)毒、無(wú)污染、成本低的dna的提取技術(shù)，從根本上解決bac克隆大片斷dna的提取純化問題，同時(shí)提供了自動(dòng)化純化大片斷dna的可能性。

本發(fā)明是采用以下的技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的：

一種bac克隆dna的提取方法，其主要步驟包括：

(1)bac克隆大腸桿菌培養(yǎng)：于2ml的lb培養(yǎng)液中加入微量e.coli(大腸桿菌)bac克隆的凍存原液并進(jìn)行初始培養(yǎng)4至6小時(shí)，從初始培養(yǎng)液中制作克隆平盤，從過夜培養(yǎng)的平盤中挑取克隆并植入500ml含相應(yīng)抗生素的lb培養(yǎng)液中過夜培養(yǎng)；

(2)細(xì)菌裂解：將500ml的大腸桿菌培養(yǎng)液進(jìn)行離心，獲取細(xì)菌沉淀物，細(xì)菌沉淀再經(jīng)過懸浮，裂解，中和，離心，去除大部分裂解后的雜質(zhì)，抽取其中上清；

(3)dna沉淀：將含有dna的上清液與一定體積的異丙醇混合并離心，獲取dna粗制沉淀物；

(4)第一次抽提、清洗：dna粗制沉淀物經(jīng)te緩沖液懸浮后與一定比例的磁珠混合，清洗磁珠，獲取較純dna；

(5)第二次抽提、清洗：將步驟(4)獲得的dna再經(jīng)一定比例的磁珠純化；

(6)dna再純化及濃縮：經(jīng)磁珠提取的dna進(jìn)一步通過10kd超濾離心管濃縮，去除微量鹽、低分子量核酸與蛋白雜質(zhì)，最終獲取高質(zhì)量高純度dna產(chǎn)物。

上述技術(shù)方案，進(jìn)一步地，在進(jìn)行步驟(5)第二次抽提、清洗之前，將步驟(4)得到的dna加入蛋白酶消化液，經(jīng)酶反應(yīng)消化殘存蛋白質(zhì)。

上述技術(shù)方案，進(jìn)一步地，所述步驟(2)將500ml大腸桿菌培養(yǎng)液平均倒入兩只500ml離心管中，4℃在7000xg離心力下離心10分鐘；向細(xì)菌沉淀物中加入6ml細(xì)菌懸浮緩沖液,在高速振蕩器上用移液管將菌體沉淀攪散，最后用移液槍與10ml移液管徹底將菌體打散、懸浮，將打散后的菌體轉(zhuǎn)移至兩只50ml離心管中；向離心管中加入6ml細(xì)菌裂解液，輕輕反轉(zhuǎn)4至5次，于室溫靜置3至5分鐘，立即向裂解中的菌體加入6ml中和液，輕輕反轉(zhuǎn)混勻4至5次，放置于冰上，3至5分鐘后至菌體絮狀物完全由棕色轉(zhuǎn)為白色，將離心管安置于離心轉(zhuǎn)子，于4℃以12000xg離心10分鐘。

上述技術(shù)方案，進(jìn)一步地，所述步驟(2)去除裂解后的雜質(zhì)的具體方法為：將離心后的離心管置于冰上，用移液管抽取離心管中的上清液，將所有上清液逐次轉(zhuǎn)移到過濾管中，上清液在重力作用下經(jīng)過過濾管底部的棉紗過濾后自然流到50ml離心管中，直至所有上清全部收集于離心管中；所述過濾管的制作步驟為：取10ml注射器，用剪刀剪出5平方厘米的醫(yī)用滅菌脫脂棉紗，并用注射器推塞填塞于注射器內(nèi)底部，然后拔掉推塞；所述過濾管固定設(shè)置在50ml離心管內(nèi)，噴口朝向50ml離心管。

上述技術(shù)方案，進(jìn)一步地，所述步驟(3)獲取dna粗制沉淀物的具體方法為：計(jì)算離心管中的上清液體積，按照上清液體積的0.7倍向離心管中加入純異丙醇，將離心管安置于離心轉(zhuǎn)子，于4℃以4000xg離心15分鐘，將離心后的dna沉淀?xiàng)壢ド锨逡汉?，再?000xg離心1分鐘，棄去上清液，獲得半透明狀dna初步提取后的沉淀物，立即向dna沉淀物中加入500μlte緩沖液并用移液槍將沉淀物懸浮溶解于te緩沖液中。

上述技術(shù)方案，進(jìn)一步地，所述步驟(4)將dna懸浮液轉(zhuǎn)移至900μl(1.8x)agencourtxp磁珠中，反轉(zhuǎn)并充分混勻后于室溫下靜置5分鐘，使dna與磁珠充分結(jié)合；輕輕離心后放置于磁力架，靜置3至5分鐘；用移液槍或負(fù)壓棄去所有上清液，加入1ml70％的酒精，合上離心管蓋，在磁力架上旋轉(zhuǎn)3至4次離心管，使磁珠充分于酒精中清洗，棄去酒精，再次加入新鮮的1ml70％酒精，重復(fù)一次清洗過程；磁珠清洗2次后，棄去酒精，將磁珠離心后再次安放于磁力架，用移液槍徹底棄去殘存酒精；于室溫下靜置30分鐘，或于37℃加熱盤中加溫5分鐘再靜置于磁力架，直到磁珠團(tuán)塊因干燥開始出現(xiàn)出細(xì)小的裂縫；向干燥后的磁珠加入200μl65℃預(yù)熱的te緩沖液，充分混勻、離心后置于磁力架5分鐘，抽取上清，轉(zhuǎn)移至1.5ml實(shí)驗(yàn)管，其中含有洗提出的dna；再次加入200μl65℃預(yù)熱的te緩沖液抽提磁珠，充分混勻、離心后置于磁力架5分鐘，抽取上清，合并提取的dna上清液。

上述技術(shù)方案，進(jìn)一步地，所述步驟(5)將第一次提取的dna溶液轉(zhuǎn)至650μl(1.6x)agencourtxp磁珠中，混勻后于室溫靜置5分鐘，使dna與磁珠充分結(jié)合；輕輕離心后放置于磁力架，靜置3至5分鐘；用移液槍或負(fù)壓棄去所有上清液，加入1ml70％的酒精，合上離心管蓋，在磁力架上旋轉(zhuǎn)3至4次離心管，使磁珠充分于酒精中清洗，棄去酒精，再次加入新鮮的1ml70％酒精，重復(fù)一次清洗過程；磁珠清洗2次后，棄去酒精，將磁珠離心后再次安放于磁力架，用移液槍徹底棄去殘存酒精；于室溫下靜置30分鐘，或于37℃加熱盤中加溫5分鐘再靜置于磁力架，直到磁珠團(tuán)塊因干燥開始出現(xiàn)出細(xì)小的裂縫；向干燥后的磁珠加入200μl65℃預(yù)熱的te緩沖液，充分混勻、離心后置于磁力架5分鐘，抽取上清，轉(zhuǎn)移至1.5ml實(shí)驗(yàn)管，其中含有洗提出的dna；再次加入200μl65℃預(yù)熱的te緩沖液抽提磁珠，充分混勻、離心后置于磁力架5分鐘，抽取上清，合并提取的dna上清液。

上述技術(shù)方案，進(jìn)一步地，所述步驟(6)將抽取的dna溶液轉(zhuǎn)移至0.5ml10kd超濾離心管中，于4℃以14000xg離心10分鐘，去掉濾過液，再次向柱芯中加入te緩沖液至400μl，上下輕搖混勻后再次離心10分鐘，觀察離心柱芯的體積刻度，直到液面水平低于100μl后停止離心；反轉(zhuǎn)離心內(nèi)芯于一新的收集管中，14000xg離心1分鐘收集dna濃縮液。

bac克隆dna的裂解與清洗過程是關(guān)鍵的環(huán)節(jié)。dna提取失敗往往是由于在此環(huán)節(jié)沒有掌握好所致。發(fā)明過程中發(fā)現(xiàn)，細(xì)菌懸浮液在加入堿性裂解液之后，裂解時(shí)間過長(zhǎng)，裂解反應(yīng)溫度過高，裂解出的dna被快速水解，反映在瓊脂糖凝膠中，存在大量的拖帶或小分子聚集帶。因此，在加入裂解液后的步驟中要盡可能縮短反應(yīng)時(shí)間。最后要用對(duì)dna有一定保護(hù)作用的te緩沖液徹底替換掉抽提過程應(yīng)用的試劑或產(chǎn)生的污染物，從而降低dna水解程度。

本發(fā)明采用了磁珠分離與分子篩過濾技術(shù)，結(jié)合蛋白酶消化技術(shù)，發(fā)明了bac克隆dna的穩(wěn)定提取方法。本發(fā)明涉及經(jīng)過優(yōu)化的提取緩沖液系統(tǒng)，磁珠結(jié)合，蛋白酶消化，小分子分離，濃縮等關(guān)鍵性步驟；利用優(yōu)化的懸浮、裂解、中緩沖液，配合離液劑、離子獲取粗制dna沉淀；經(jīng)重懸dna沉淀，在適宜的ph和離子濃度下，將dna多聚核苷酸大分子非特異性和可逆地結(jié)合到磁性納米材料的官能基團(tuán)，例如羧基、硅基，通過快速結(jié)合、清洗步驟，去除裂解過程的離子、蛋白、糖類等污染物和小分子等雜質(zhì)。

本發(fā)明的方法能夠有效提取片斷大于10kb以上的dna，所處理的體積通常為常規(guī)100ml至500ml細(xì)菌培養(yǎng)液；可從大體積培養(yǎng)液中有效去除高鹽、蛋白、糖及小分子雜質(zhì)，在很大程度上提高了dna純化過程的穩(wěn)定性和產(chǎn)物質(zhì)量，有效地克服了提取過程dna的大量降解；提取的dna質(zhì)量高、數(shù)量充分，每500ml培養(yǎng)液可穩(wěn)定獲得50至100微克高純度dna；不采用酚、氯仿等有毒有害的有機(jī)溶劑，對(duì)實(shí)驗(yàn)人員和環(huán)境友好，不會(huì)對(duì)dna產(chǎn)物產(chǎn)生有機(jī)溶劑污染；操作簡(jiǎn)單穩(wěn)定、經(jīng)濟(jì)高效；具備優(yōu)良的擴(kuò)展性，能實(shí)現(xiàn)標(biāo)準(zhǔn)化的試劑盒套裝系列產(chǎn)品和全自動(dòng)化操作；從根本上解決了涉及dna分析，特別是基因組dna分析實(shí)驗(yàn)所面臨的一個(gè)亟需解決的bac克隆大片斷dna的提取純化問題，對(duì)于滿足dna分子探針標(biāo)記及其產(chǎn)業(yè)對(duì)大片斷dna的需求極有意義。

附圖說明

圖1是為應(yīng)用堿性裂解法提取的dna瓊脂糖凝膠電泳圖；

圖2是實(shí)施例簡(jiǎn)易過濾裝置的結(jié)構(gòu)示意圖；

其中，1、過濾管；2、離心管；3、脫脂棉紗；

圖3是實(shí)施例過濾裂解雜質(zhì)后得到的dna沉淀物的狀態(tài)圖；

圖4是磁珠珠團(tuán)塊因干燥開始出現(xiàn)出細(xì)小的裂縫時(shí)的狀態(tài)圖；

圖5是采用實(shí)施例的方法提取的bacdna瓊脂糖凝膠電泳圖。

具體實(shí)施方式

為了能夠更加清楚地理解本發(fā)明的上述目的、特征和優(yōu)點(diǎn)，下面結(jié)合附圖及實(shí)施例對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步說明。

實(shí)施例

1.主要設(shè)備與試劑材料

落地式離心機(jī)：thermosorvalrc6+離心機(jī)及轉(zhuǎn)子f12-6x500,f13-14x50cy

臺(tái)式4℃離心機(jī)：eppendorf5424r

常規(guī)袖珍離心機(jī)

37℃孵育箱

37℃細(xì)菌培養(yǎng)搖床

50ml離心管：thermoscientific，339653

1.5mleppendorf離心管，無(wú)dnase(脫氧核糖核酸酶)與rnase(核糖核酸酶)。

超濾離心管：merckmillipore,amiconultra0.5mlcentrifμgefilters,ultracel10k

lb細(xì)菌培養(yǎng)液：將下列試劑加入到800ml去離子純水中，10gbacto-tryptone，5gyeastextract，10gnacl，用naoh調(diào)整ph到7.5，然后加入去離子純水至1升。高溫消毒備用。

抗生素工作液：按照bac克隆相應(yīng)抗生素要求，稀釋抗生素粉劑至所需要濃度。如bac克隆一般使用氯霉素，可稱量一定量粉劑氯霉素抗生素用100％酒精稀釋至50mg/ml，常規(guī)培養(yǎng)液中加入至終濃度為12.5μg/ml。

細(xì)菌懸浮緩沖液(te緩沖液)：溶解6.06gtris和3.72gna2edta·2h2o于800ml去離子純水中，用hcl調(diào)整ph至8.0,然后加水至1升。加入100mgrnasea至終濃度為100μg/ml。加入rnasea后的懸浮緩沖液要置于4℃保存。

細(xì)菌裂解液：溶解8.0gnaoh顆粒至900ml去離子純水中,最后加入50ml20％sds(w/v)，最后加水至1000ml。

中和液：于500ml去離子純水中溶解294.5gpotassiumacetate，然后用約110ml冰醋酸調(diào)整ph至5.5，最后加水至1升。

核酸純化試劑盒：agencourtampurexp，60ml,a63881,beckmancoulter

蛋白酶k溶液：(20mg/ml)x5,rnagrade,25530049,thermofisher

2.bac克隆大腸桿菌培養(yǎng)

(1)單克隆選擇平盤制備：在250ml的消毒瓶中加入2g瓊脂糖粉劑，再加入100mllb培養(yǎng)液，混勻；210℃高溫高壓消毒20分鐘后冷卻至50℃后，迅速加入終濃度為12.5ug/ml的氯霉素。在超凈工作臺(tái)混勻后迅速倒入約9個(gè)10ml培養(yǎng)平盤中，每個(gè)盤約倒入10ml，室溫下完全冷卻并存放于4℃冷藏箱備用。

(2)于10ml圓底細(xì)菌培養(yǎng)管中加入2mllb培養(yǎng)液，加入相應(yīng)氯霉抗生素至終濃度12.5ug/ml。

(3)將凍存于-80℃的bac克隆轉(zhuǎn)移至干冰上并始終保持冷凍狀態(tài)，用消毒后的200μl或1ml移液頭蘸取少量?jī)龃嬉?，并轉(zhuǎn)移至2mllb培養(yǎng)液中。

(4)將已加入bac克隆大腸桿菌的培養(yǎng)管移至37℃/每分250轉(zhuǎn)的搖床中培養(yǎng)約6-8小時(shí),培養(yǎng)至略有混濁的透明狀態(tài)。

(5)按1比10000比例用lb培養(yǎng)液稀釋bac克隆培養(yǎng)液。例如，先取10μl培養(yǎng)液加入到990μllb培養(yǎng)液中，混勻后再?gòu)闹腥?0μl加入到990μl新鮮的lb培養(yǎng)液中。

(6)將接種牙簽或接種環(huán)插入到稀釋后的克隆培養(yǎng)液中，然后用接種環(huán)在培養(yǎng)平盤的三個(gè)平分區(qū)域順次輕輕劃線。一次接種一個(gè)平盤。

(7)將接種后的平盤倒置后于37℃孵育箱中過夜培養(yǎng)20小時(shí)至單克隆菌落形成。單克隆菌落形成后的平盤用parafilm或保鮮膜密封，平盤要倒置于4℃冷藏冰箱保存。保存與使用期一般不超過5天。

(8)在容積為1000ml三角培養(yǎng)瓶中加入500mllb培養(yǎng)液，在培養(yǎng)液中并加入終濃度為12.5ug/ml氯霉素，輕搖后混勻。從bac克隆平盤中挑取單克隆菌落并接種至三角培養(yǎng)瓶中的lb培養(yǎng)液中。用錫箔紙封好三角培養(yǎng)瓶口。輕輕搖勻后固定于37℃、每分260轉(zhuǎn)的培養(yǎng)搖床中培養(yǎng)。細(xì)菌培養(yǎng)至呈淺白色約80％的融合態(tài)。培養(yǎng)時(shí)間通常不超過20小時(shí)。

3.細(xì)菌裂解與dna沉淀

將培養(yǎng)約20小時(shí)的500ml細(xì)菌培養(yǎng)物平均倒入兩只500ml離心管中，平衡后放置于離心轉(zhuǎn)子(f12-6x500lex)中，于離心機(jī)(sorvallrc6+,thermoscientific)4℃用7000xg離心10分鐘。

離心完成后，棄去上清，保留沉淀菌體。此時(shí)也可將沉淀物與離心管一起于-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

向離心后的菌體分別加入6ml細(xì)菌懸浮緩沖液,在高速振蕩器上用移液管將菌體沉淀攪散，最后用移液槍與10ml移液管徹底將菌體打散、懸浮。將打散后的菌體轉(zhuǎn)移至兩只50ml(thermofisher,339653)離心管中。

向離心管中加入6ml細(xì)菌裂解液，輕輕反轉(zhuǎn)4至5次，于室溫靜置不超過5分鐘。

立即向裂解中的菌體加入6ml中和液,輕輕反轉(zhuǎn)混勻4至5次，放置于冰上，約3至5分鐘后至菌體絮狀物完全由棕色轉(zhuǎn)為白色。

將離心管安置于離心轉(zhuǎn)子(f13-14x50cy)，于4℃以12000xg離心10分鐘。

在離心間隙，用10ml注射器和50ml離心管制作一只簡(jiǎn)易過濾裝置。用剪刀剪出約5平方厘米一小片醫(yī)用滅菌脫脂棉紗并用注射器推塞填塞于注射器內(nèi)底部，然后拔掉推塞，用膠帶紙將制作的過濾管裝置粘貼于50ml離心管中，注意注射器的噴口朝向離心管內(nèi)，如圖2所示。

將離心后的離心管小心置于冰上，用10ml移液管小心抽取2只離心管中的上清液，注意盡量不要取到絮狀沉淀物。將所有上清液逐次轉(zhuǎn)移到過濾管中，讓上清液在重力作用下通過注射器底部的棉紗過濾后自然流到50ml離心管中，直至所有上清全部收集于離心管中，棄去過濾裝置。經(jīng)過本裝置過濾后能夠去除大部分裂解后肉眼所見的雜質(zhì)。

計(jì)算離心管中的上清液體積，按照上清液體積的0.7倍向離心管中加入純異丙醇。比如，如過濾后的上清液總體積為25ml,應(yīng)加入100％的異丙醇17.5ml，最終異丙醇含量為41％，最后總體積為42.5ml。

將離心管安置于離心轉(zhuǎn)子(f13-14x50cy)，于4℃以4000xg離心15分鐘。

離心間隙，向一只2mllowbinding離心管中加入渦旋混勻的900μlagencourtxp磁珠，桌面離心器輕輕離心后，置于室溫下備用。應(yīng)至少在使用前10分鐘準(zhǔn)備好。

將離心后的dna沉淀小心棄去上清液后，再以4000xg離心1分鐘，用移液器盡量棄去上清。此時(shí)離心管底部側(cè)壁有半透明狀dna初步提取后的沉淀物，如圖3所示，箭頭所指為dna初步提取后的沉淀物。此時(shí)要特別注意不能將離心管長(zhǎng)時(shí)間置于室溫下，以免dna降解。

4.第一次抽提、清洗

立即向dna沉淀物中加入500μlte緩沖液并用1000μl移液槍將沉淀物懸浮溶解于te緩沖液中。

將500μldna懸浮液轉(zhuǎn)移至已經(jīng)于室溫下備好的900μl(1.8x)agencourtxp磁珠中，反轉(zhuǎn)并充分混勻后于室溫下靜置5分鐘，使dna與磁珠充分結(jié)合。

用常規(guī)袖珍離心機(jī)離心2秒鐘，后放置于磁力架(dynamagtm-2magnet，thermofisher,12321d)，靜置3至5分鐘。

用移液槍或負(fù)壓棄去所有上清液，加入1ml70％的酒精，合上離心管蓋，在磁力架上旋轉(zhuǎn)3至4次離心管，使磁珠充分于酒精中清洗。最后棄去酒精，再次加入新鮮的1ml70％酒精，重復(fù)一次清洗過程。

磁珠清洗2次后，棄去酒精，將磁珠離心后再次安放于磁力架，用移液槍徹底棄去殘存酒精。于室溫下靜置30分鐘以上，或于37℃加熱盤中加溫5分鐘再靜置于磁力架，直到磁珠團(tuán)塊因干燥開始出現(xiàn)出細(xì)小的裂縫，如圖4所示。

向干燥后的磁珠加入200μl65℃預(yù)熱的te緩沖液，充分混勻、離心后置于磁力架5分鐘，小心抽取上清，轉(zhuǎn)移至1.5ml實(shí)驗(yàn)管，其中含有洗提出的dna。再次加入200μl65℃預(yù)熱的te緩沖液抽提磁珠，充分混勻、離心后置于磁力架5分鐘，抽取上清。合并提取的dna上清液，總體積為400μl。

5.蛋白酶消化

本步驟可作為選項(xiàng)。由于dna抽提液中仍可能存在一定量的組蛋白、酶、糖等殘留，為后續(xù)實(shí)驗(yàn)考慮，可作進(jìn)一步的蛋白酶消化處理以去除殘余蛋白質(zhì)。

向抽提出的400μldna抽提液中加入10μl濃度為20mg/ml的proteinasek溶液，混勻后于37℃水浴箱中溫浴4小時(shí)。

6.第二次抽提、清洗

于2mllowbinding離心管中加入650μl(1.6x)agencourtxp磁珠,室溫靜置備用。

將第一次提取的dna溶液或proteinasek處理后的dna抽提液轉(zhuǎn)至650μl磁珠中,混勻后于室溫靜置5分鐘。

將靜置后的磁珠輕輕離心后放置于磁力架，靜置3至5分鐘。

用移液槍或負(fù)壓棄去上清，加入1ml70％的酒精，合上離心管蓋，在磁力架上旋轉(zhuǎn)3至4次離心管，使磁珠充分于酒精中清洗。棄去酒精，再次加入新鮮的1ml70％酒精，重復(fù)一次清洗過程。

磁珠清洗2次后，棄去酒精，將磁珠離心后再次安放于磁力架，用移液槍徹底棄去殘存酒精。于室溫下靜置30分鐘以上，或于37℃加熱盤中加溫5分鐘再靜置于磁力架，直到磁珠團(tuán)塊因干燥呈現(xiàn)出細(xì)小的裂縫。

向干燥后的磁珠加入200μl65℃預(yù)熱的te緩沖液，充分混勻，離心后置于磁力架5分鐘，小心抽取上清，轉(zhuǎn)移至1.5ml實(shí)驗(yàn)管，其中含有洗提出的dna。再次加入200μl65℃預(yù)熱的te緩沖液抽提磁珠，充分混勻，離心后置于磁力架5分鐘，抽取上清。合并提取的dna上清液約400μl。

7.dna再純化及濃縮

將抽取的dna溶液轉(zhuǎn)移至millipore公司生產(chǎn)的amiconultra0.5mlcentrifugalfilter(10kd,ufc501024)中，按照廠家要求，于4℃臺(tái)式離心機(jī)14000xg離心10分鐘。去掉濾過液，再次向柱芯中加入te緩沖液至400μl，上下輕搖混勻后再次離心10分鐘。觀察離心柱芯的體積刻度，直到液面水平低于100μl后停止離心。

反轉(zhuǎn)離心內(nèi)芯于一新的收集管中，14000xg離心1分鐘收集dna濃縮液。

8.質(zhì)量檢查

nanodrop2000c測(cè)定dna產(chǎn)物量(quantity)和品質(zhì)(quality)。取1.5μldna溶液加入nanodrop2000c測(cè)定平臺(tái)，所獲dna的260nm與280nm的比值應(yīng)介于1.80與1.90之間。比值高于1.90以上可能仍存有核酸小分子污染物。260nm與230nm的比值應(yīng)等于或略高于2.0，如果高于2.2以上提示仍然存在鹽類分子的污染物。

瓊脂糖凝膠觀察dna的完整性(integrity)。將0.4克瓊脂加入到預(yù)裝有40mltae緩沖液的加熱瓶中，混勻后于微波爐中加熱約1分鐘至充分溶解，小心不要沸騰出瓶口。加入約5μl濃度為10mg/ml的溴化乙錠溶液，輕搖混勻后迅速倒入瓊脂膠制備裝置,排除膠體表面氣泡后插入孔梳，室溫下冷卻30分鐘至完全凝固。取1μldna溶液與上樣液混合后上樣，同時(shí)上樣時(shí)加入正、負(fù)對(duì)照樣品和合適的dnaladder(梯帶)。按照5v/cm約在100v電壓下跑膠約30分鐘后于365nm紫外光下檢查dna結(jié)果。圖5所示2、3道為bacdna結(jié)果，應(yīng)在10kb以上位置。

本發(fā)明能夠從大體積bac克隆細(xì)菌培養(yǎng)液中有效提取質(zhì)量高、數(shù)量充分、無(wú)毒、無(wú)污染、低成本的dna；本發(fā)明操作簡(jiǎn)單穩(wěn)定、經(jīng)濟(jì)高效、無(wú)毒無(wú)污染。本發(fā)明具備優(yōu)良的擴(kuò)展性，能實(shí)現(xiàn)標(biāo)準(zhǔn)化的試劑盒套裝系列產(chǎn)品和全自動(dòng)化操作。

以上所述的實(shí)施例僅是對(duì)本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式進(jìn)行描述，并非對(duì)本發(fā)明的范圍進(jìn)行限定，在不脫離本發(fā)明設(shè)計(jì)精神的前提下，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員對(duì)本發(fā)明的技術(shù)方案作出的各種變形和改進(jìn)，均應(yīng)落入本發(fā)明權(quán)利要求書確定的保護(hù)范圍內(nèi)。