一種抗pd-1的單克隆抗體及其獲得方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及抗體工程技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及全人源的抗ro-i的單克隆抗體、及其獲 得方法與應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 免疫調(diào)節(jié)在機體免疫應(yīng)答過程中起著極其重要的作用，而免疫活性細胞的活化對 整個免疫應(yīng)答的調(diào)節(jié)極其關(guān)鍵。研究表明，T細胞活化和增殖依賴于雙重信號途徑。"協(xié)同 刺激信號"的概念是1970年Bretscher和Cohn在T細胞活化雙信號模型的基礎(chǔ)上提出來 的，即T細胞的活化不僅需要通過APC遞呈MHC-抗原肽復(fù)合物給抗原特異性T細胞來提供 第一信號外，還需要多種協(xié)同刺激分子參與提供輔助的第二信號（協(xié)同刺激信號）；隨著研 究的深入，協(xié)同刺激信號逐漸成為免疫學(xué)的熱點領(lǐng)域；這些協(xié)同信號分子主要包括CD28/ B7和TNFR/TNF兩大超家族。ro-1/PD-Ll作為CD28/B7超家族的成員，能介導(dǎo)負性協(xié)同刺 激信號。ro-1/PD-Ll信號通路能有效抑制T、B細胞功能，使T細胞增殖受抑，同時減少細 胞因子IL-2、IL-IO和IFN-γ的分泌，在免疫調(diào)節(jié)中發(fā)揮著重要的作用，并在腫瘤免疫、自 身免疫、移植免疫、哮喘、病毒感染等疾病的研究中有著重要的意義。
[0003] Η)-1屬于免疫球蛋白超家族I型跨膜蛋白，分子量約為50-55KD。最初是在凋亡的 T細胞雜交瘤中通過消減雜交技術(shù)得到的，因其與細胞凋亡有關(guān)故命名為程序性細胞死亡 因子l(Programmed Cell Death 1)。F1D-I的編碼基因是Η)-〇)1，定位于人染色體2q37. 3， 和CTLA4基因具有23%的同源性。ro-1由胞內(nèi)區(qū)、跨膜區(qū)和胞外區(qū)構(gòu)成，其胞外區(qū)包含一 個免疫球蛋白可變區(qū)IgV樣結(jié)構(gòu)域；其胞內(nèi)區(qū)N端的兩個酪氨酸殘基與其他氨基酸殘基共 同組成了一個免疫受體酪氨酸抑制基序（Ι??Μ)，Ι??Μ通過酪氨酸的磷酸化發(fā)揮拮抗抗原 受體刺激信號的功能，從而在免疫應(yīng)答過程中發(fā)揮負性調(diào)控功能；ro-i分子可在活化的T 細胞、B細胞、NK細胞、單核細胞和樹突狀細胞表面誘導(dǎo)性地表達，并與其配體ro-Li、ro-L2 相結(jié)合而對淋巴細胞的活化產(chǎn)生抑制作用，從而抑制免疫細胞的免疫應(yīng)答反應(yīng)。
[0004] PD-Ll (CD274或B7H1)和PD-L2 (CD273或B7DC)是PDl的兩個配體，這兩個配體基 因均定位于人染色體9p24. 2,并起始于同一方向，間隔42kb左右；它們同屬B7家族，因而 同其他成員一樣，在蛋白結(jié)構(gòu)上ro-Li和ro-L2均由Igv樣結(jié)構(gòu)域、Igc樣結(jié)構(gòu)域、跨膜區(qū) 和短而保守的胞質(zhì)區(qū)尾巴組成；與ro-L2相比，PD-Ll的胞質(zhì)尾巴在不同種屬間更為保守。 PD-Ll在活化的T細胞、B細胞、樹突狀細胞、單核細胞和多種類型的腫瘤細胞（如肺癌、肝 癌、乳腺癌、卵巢癌、腎癌、頭頸癌、食道癌、皮膚癌、鱗狀細胞癌等）上誘導(dǎo)性表達；PD-L2主 要表達于活化的巨噬細胞、樹突細胞和個別腫瘤細胞（如霍奇金淋巴瘤）上。腫瘤表面的 PD-Li與ro-i相互作用，可導(dǎo)致腫瘤抗原特異性T細胞凋亡，使腫瘤細胞逃脫機體免疫監(jiān) 控?？箁o-ι的單抗通過阻斷ro-1/PD-Li信號通路促進腫瘤抗原特異性τ細胞增殖，發(fā)揮 殺傷腫瘤細胞的作用，能有效提高免疫治療效果，具有治療多種類型腫瘤的潛力。
[0005] 目前多家大型國際制藥公司都在進行針對ro-i或ro-Li的單抗藥物（如表1所 示），其中百事美施貴寶的F 1D-I抑制劑Opdvio (Nivolumab)于2014年7月獲日本批準上 市；默沙東的ro-1抑制劑于2014年9月獲FDA批準上市；這兩個藥物的首個適應(yīng)癥均為黑 色素瘤。隨著各公司臨床項目的推進，適應(yīng)癥已擴展到肺癌、乳腺癌、血液癌癥等領(lǐng)域。
[0006] 表1、當(dāng)前正在開展臨床實驗的抗ro-i抗體
[0008] 目前全人源性抗體是治療性抗體發(fā)展的主要方向，抗體庫技術(shù)的出現(xiàn)為人源抗體 的制備篩選提供了良好的技術(shù)平臺。抗體庫技術(shù)繞過了以往單抗研制過程中必須的雜交瘤 過程，甚至不需要經(jīng)過免疫過程即可獲得各種抗體基因及抗體分子片段。噬菌體抗體庫是 最早出現(xiàn)也是目前應(yīng)用最廣泛的抗體庫。
[0009] 噬菌體展示技術(shù)是由Smith首先建立的一種將編碼外源蛋白或多肽的基因插入 噬菌體衣殼蛋白基因，使外源蛋白或多肽與噬菌體衣殼蛋白融合表達于噬菌體表面的技 術(shù)。噬菌體抗體庫就是利用了上述原理將不同特異性的抗體或其功能性片段（Fab、Fv、 ScFv)表達在噬菌體表面，再用抗原進行篩選。噬菌體抗體庫根據(jù)抗體基因的來源分為免疫 庫和非免疫庫，非免疫庫又包括天然庫、半合成庫和全合成庫。噬菌體抗體庫的篩選模擬了 抗體親和力成熟的過程，通常將抗原包被在固相介質(zhì)上，加入待篩選的噬菌體抗體庫，通過 數(shù)輪"吸附-洗滌-洗脫-擴增"的過程（即淘選）直至篩選到高親和力特異的抗體。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0010] 本發(fā)明提供了一種抗ro-i的單克隆抗體；本發(fā)明從全合成抗體庫中篩選出抗 ro-i的單克隆抗體，然后通過計算機輔助設(shè)計分析，構(gòu)建小容量合成噬菌體抗體輕鏈庫的 方法，對初篩獲得的抗ro-l單克隆抗體DFPDl-I輕鏈的互補決定區(qū)⑶RU2、3區(qū)突變建庫； 篩選后，選取親和力較高的單克隆抗體DFPD1-3和DFPD1-7,再對其重鏈CDR1、2、3區(qū)突變建 庫進行篩選，最終篩選到了高親和力的抗ro-i的單克隆抗體。
[0011] 為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明一種抗ro-i的單克隆抗體的獲得過程包括：
[0012] (1)、抗ro-i單鏈抗體的生物淘選，通過三輪抗體庫的富集篩選，從全合成的ScFv 噬菌體庫中獲得了一種親和力較高的抗體序列DFPD1-1，其重鏈為DFPDl-Hl (SEQ NO. 1)，輕 鏈為 DFPDl-Ll (SEQ NO. 5)。
[0013] (2)、以DFPDl-I為基礎(chǔ)，通過計算機三級結(jié)構(gòu)模擬，構(gòu)建輕鏈互補決定區(qū)⑶RU2、 3突變庫并對該抗體庫進行生物淘選和陽性克隆的篩選及鑒定，獲得了 6種不同輕鏈的抗 體序列 DFPD1-2、DFPD1-3、DFPD1-4、DFPD1-5、DFPD1-6、DFPD1-7,他們對應(yīng)的輕鏈序列分別 為 DFPD1-L2(SEQ NO. 6)、DFPD-L3(SEQ NO. 7)、DFPD1-L4(SEQ NO. 8)、DFPD1-L5(SEQ NO. 9)、 DFPD1-L6(SEQ NO. 10)、DFPD1-L7(SEQ NO. 11);將上述7種單鏈抗體在噬菌體水平進行親和 力比較。
[0014] (3)、選出兩株親和力較高的克隆DFPD1-3和DFPD1-7,構(gòu)建重鏈互補決定區(qū) CDR1、2、3庫并對該庫進行生物淘選和陽性克隆的篩選，獲得了五種不同的單鏈抗體序列 DFPD1-9, DFPD1-10、DFPD1-11、DFPD1-12、DFPD1-13。其中 DFPD1-9、DFPDl-Il 和 DFPD1-12 的輕鏈可變區(qū)序列是DFPD1-L3,而DFPD1-10和DFPD1-13的輕鏈可變區(qū)序列是DFPD1-L7 ; DFPD1-9 和 DFPD1-10 的重鏈可變區(qū)序列是 DFPD1-H2(SEQ NO. 2) ,DFPDl-Il 和 DFPD1-13 的 重鏈可變區(qū)是 DFPD1-H3(SEQ NO. 3)，DFPD1-12 的重鏈可變區(qū)是 DFPD1-H4(SEQ NO. 4)。將 上述單鏈抗體在噬菌體水平上進行親和力比較。
[0015] (4)、將（3)中所述單克隆重鏈可變區(qū)基因和輕鏈可變基因及輕重鏈恒定區(qū)基因 克隆到真核表達載體，轉(zhuǎn)染宿主細胞，獲得單克隆抗體的全抗再進行親和力和其他生物學(xué) 功能比較。
[0016] 通過上述方法獲得的抗ro-i的單克隆抗體，包括：輕鏈和重鏈；所述輕鏈的互補 決定區(qū) CDRl、CDR2 和 CDR3 分別用 LCDRl、LCDR2 和 LCDR3 表示；LCDRl 包含 RASQNIHSYLD、 RASQNVSNWLD、RASQSIHNYLD、RASQDINNWLD RASQDVRTYLD、RASQGINSWLD 或 RASQSVSNYLD 中 的任一種；LCDR2 包含 EASTRAS、DASNRAT、NASTRAT、DASTLAT、GASTRAT 或 DASTRAT 中的任一 種；LCDR3 包含 QQALKLPIT、QQSRHIPLT、QQELHLPLT、QQNVNLPLT、QQDIDLPLT、QQSYRLPLT 或 QQNMQLPLT中的任一種。
[0017] 其中，所述輕鏈可變區(qū)氨基酸序列包含SEQ NO. 5、SEQ NO. 6、SEQ NO. 7、SEQ NO. 8、 SEQ NO. 9、SEQ NO. 10 或 SEQ NO. 11 中的任一種。
[0018] 通過上述方法獲得的抗ro-i的單克隆抗體，包括：輕鏈和重鏈；所述重鏈的互補 決定區(qū) CDRl，CDR2 和 CDR3 分別用 HCDRl、HCDR2 和 HCDR3 表示；HCDRl 包含 SNNGMH 或 SNYGMH ; HCDR2 包含 VIWYDGSKK、VIWYDSSRK 或 VIWYDSTKK 中的任一種；HCDR3 包含 TAVYYCATNNDYW 或 TAVYYCATNTDYffo
[0019] 其中，所述重鏈可變區(qū)氨基酸序列包含SEQ NO. 1、SEQ NO. 2、SEQ NO. 3或SEQ NO. 4 中的任一種。
[0020] 其中，本發(fā)明還提供了一種包含上述輕鏈或上述重鏈的抗體、多肽或蛋白質(zhì)。
[0021] 其中，本發(fā)明還提供了一種包含上述輕鏈或上述重鏈的抗體，所述抗體能夠阻斷 ro-i與其配體PD-Li的結(jié)合，抑制ro-i的生物學(xué)活性。
[0022] 其中，本發(fā)明還提供了一種包含上述輕鏈或上述重鏈的多核苷酸序列或組合。
[0023] 其中，本發(fā)明還提供了一種包含上述多核苷酸序列或組合的重組DNA表達載體； 所述載體的DNA序列中包含編碼抗PDl抗