植物花藥特異表達啟動子pTaASG042的鑒定和應用
【技術領域】
[0001]本發(fā)明屬于植物生物技術領域，具體而言，本發(fā)明涉及分離的DNA，其能夠指導可操作地連接在其下游的核酸在植物花藥中特異轉錄和/或表達。另外，本發(fā)明還涉及包含該DNA的表達盒和植物等，并涉及該DNA的應用。
【背景技術】
[0002]植物基因調控主要是在轉錄水平上進行的，受多種順式作用元件和反式作用因子的相互協(xié)調。啟動子是重要的順式作用元件，它是位于結構基因5'端上游區(qū)域調控基因轉錄的一段DNA序列，能活化RNA聚合酶，使之與模板DNA準確地結合，確保轉錄精確而有效地起始，在轉錄調控中起關鍵作用。根據其驅動基因表達的不同特點，啟動子分為組成型啟動子和特異性啟動子。組成型啟動子能在所有細胞或組織中，不分時間和空間地啟動轉錄；特異性啟動子又可分為組織特異性啟動子和誘導型啟動子，其中誘導型啟動子平時不啟動轉錄或轉錄活性很低，但在某些特定的逆境信號的刺激下，轉錄活性能夠顯著地提高。
[0003]外源DNA序列通過連接到特定的啟動子從而啟動在植物宿主中的表達，啟動子類型的選擇決定基因的表達時間和部位。目前在農業(yè)生物技術領域廣泛應用的主要是一些組成型的強啟動子，比如CaMV 35S啟動子和玉米Ubiquitin-1啟動子，然而在利用這些啟動子誘導目的基因轉化水稻等作物以期改良作物的品質時，往往會由于目的基因表達的時間(發(fā)育階段特異性)或空間(組織器官特異性)不能很好地控制而導致改良效果不明顯，或者由于這些組成型啟動子誘導基因表達量太高而對植物的生長發(fā)育造成影響，這些都是目前利用組成型強啟動子結合功能基因來改良作物品質時遇到的障礙。
[0004]此外，在研宄某些代謝過程或調節(jié)途徑時，常常需要將同一途徑上的兩個以上的基因轉化到同一個株系中去，采用轉化其中一個基因得到轉基因植株后再轉化另外一個基因，或者兩個基因分別轉化完成后再進行雜交，都需要等待較長的時間，為了提高效率縮短多個基因轉化的時間，最近有報道可以利用新的載體同時進行多個基因的轉化，但是在多基因轉化時如果重復使用同一個啟動子，也會由于啟動子序列的高同源性可能導致基因沉默。
[0005]近年來，通過基因工程調控植物花粉育性、創(chuàng)造植物雄性不育系及其恢復系已在一些作物上獲得成功，為作物雜種優(yōu)勢的利用開創(chuàng)了新的前景。目前利用基因工程創(chuàng)造雄性不育的策略主要是利用花粉發(fā)育的特異啟動子與外源基因嵌合，構建表達載體，轉化植物來阻斷花粉發(fā)育的過程從而達到雄性不育的目的。Mariani等利用煙草花藥絨氈層特異啟動子TA29與RNase Tl或Barnase連接構建成嵌合基因，通過農桿菌介導轉入煙草和油菜，獲得了穩(wěn)定的雄性不育的轉化株(Mariani C等，Induct1n of male sterilityin plants by a chimaeric ribonuclease gene，Nature，1990，347:737-741)。隨后，他們又用TA29驅動Barstar基因，創(chuàng)建了上述雄性不育系的恢復系(Mariani C等，A chimaeric ribonuclease-1nhibitor gene restores fertility to male sterileplants, Nature, 1992，357:384-387)。此外，其他研宄小組利用花藥特異啟動子啟動反義苯基苯乙烯酮合成酶基因、反義肌動蛋白基因、β -1,3-葡聚糖酶基因等在花藥中特異表達也分別成功地獲得了雄性不育植物(Meer等，Promoter analysis of the chalconesynthase gene of petunia hybrid:a 67bp promoter reg1n directs flower-specificexpress1n, Plant B1l., 1990, 15:95-109 ;李艷紅等，將新的任紅雄性不育基因導入小麥栽培品種的研宄初報，農業(yè)生物技術學報，1999，7:255-258 ；Curtis等，Genomicmale sterility in lettuce, a base line for the product1n of F^ybrid, PlantSc1.， 1996， 113:113-119)。
[0006]植物花粉或花藥啟動子的驅動活性和特異性決定了通過基因工程手段調控花粉育性、創(chuàng)造植物不育系及恢復系的成敗。目前已知的驅動活性高且特異性良好的植物花粉或花藥特異啟動子還相對較少，而小麥因其基因組較大且結構復雜等原因，在花粉或花藥發(fā)育分子機制方面的研宄更加匱乏，因此，對小麥花粉特異表達啟動子的克隆和功能分析對于在小麥中利用基因工程調控花粉育性、創(chuàng)造植物雄性不育系，從而為小麥雜種優(yōu)勢資源在小麥育種中的充分利用打下基礎。

【發(fā)明內容】

[0007]本發(fā)明的目的是提供一種植物花粉發(fā)育晚期花藥特異表達的啟動子序列及克隆并應用該啟動子的方法。
[0008]本發(fā)明取花粉處于減數(shù)分裂期、單核期、雙核期和三核期的小麥花藥，用Trizol (Invitrogen)提取總 RNA，并進行 DNaseI (Promega)處理，進而純化 mRNA (Amb1n)。將純化的mRNA進行反轉錄(Invitrogen)、超聲打斷(Fisher)、制備文庫(illumina)并擴增(illumina)，最后在illumina機器上進行測序反應。
[0009]小麥轉錄組高通量測序的結果首先通過Trinity軟件進行序列拼接，得到的拼接序列進一步去除冗余以及相似性聚類。對于拼接得到的轉錄本contig的表達變化分析，各樣品中高通量測序的序列首先通過TopHat (http://tophat.cbcb.umd.edu/)軟件與轉錄本拼接的結果進行比對。而后Cufflink軟件能夠計算比對上的轉錄本contigs的均一化表達量，用“外顯子每百萬比對片段的千堿基數(shù)(fragments per kilobase of exon modelper mill1n mapped fragments，F(xiàn)PKM)，，表不。
[0010]通過對不同發(fā)育時期小麥花藥的全基因組表達譜分析，找到花粉處于減數(shù)分離期的花藥中不表達而在花粉處于單核、雙核和三核期的花藥中表達的轉錄本contig 7187個。如圖1所示，compl77540_c2_seqll (序列如SEQ ID NO:1所示)花粉處于減數(shù)分離期的花藥中不表達而在花粉處于單核、雙核和三核期的花藥中表達。將compl77540_C2_Seqll所對應的基因命名為 TaASG042 (Anther Specific Gene 042)。
[0011]從compl77540_c2_seqll 的序列(如 SEQ ID NO:1 所示)出發(fā)，利用 CerealsDB和 IWGSC (Internat1nal Wheat Genome Sequencing Consortium)公布的普通小麥的測序信息，以及2013年Nature上發(fā)表的小麥祖先烏拉爾圖小麥(Triticum urartu，A基因組供體)和粗山羊草(Aegilops tauschii, D基因組供體)的測序信息進行電子克隆，獲得了TaASG042基因的CDS序列，如SEQ ID NO: 2所示。設計特異性引物，利用RT-PCR方法，對該基因在小麥根、莖、葉、不同發(fā)育時期的花藥及除花藥以外的其他花器官等多種組織材料中進行表達特異性分析，結果如圖2所示，TaASG042基因只在花粉處于單核期、雙核期和三核期的花藥中特異性表達，在同時期的其他花器官和根、莖、葉和減數(shù)分裂期的穗子等組織器官中都不表達，說明TaASG042基因是花藥特異表達、且只在花粉發(fā)育晚期的花藥中特異表達的基因。
[0012]本發(fā)明還提供了一個花藥特異表達的啟動子，所述啟動子通過以下方法獲得:從TaASG042 基因的 CDS 序列出發(fā)，利用 CerealsDB 和 IffGSC(Internat1nal Wheat GenomeSequencing Consortium)公布的普通小麥的測序信息，以及2013年Nature上發(fā)表的小麥祖先烏拉爾圖小麥(Triticum urartu，A基因組供體)和粗山羊草(Aegilops tauschii，D基因組供體)的測序信息進行電子克隆，獲得了 TaASG042基因的啟動子，命名為TaASG027啟動子，在本發(fā)明中所述啟動子也可稱為pTaASG042，其長度為2000bp，所述啟動子的核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示。
[0013]利用PlantCARE數(shù)據庫和PLACE數(shù)據庫，對TaASG042啟動子進行順式元件分析。如圖3所示，翻譯起始位點ATG用粗體下劃線表示，以翻譯起始位點ATG的A定義為“+1”，AGAAA基序用陰影表示，GTGA基序用方框表示，AGGTCA基序用下劃曲線表示。TaASG042基因啟動子中有2個AGAAA基序、5個GTGA