檢測cda基因第79、208和435位點的引物和方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬生命科學(xué)和生物技術(shù)領(lǐng)域,特別涉及檢測CDA基因第79、208和435位點 的引物和方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 吉西他濱是一種破壞細胞復(fù)制的二氟核普類抗代謝抗腫瘤藥,在臨床上廣泛用 于非小細胞肺癌的一線治療,同時對于包括胰腺癌、膽囊癌、乳腺癌和平滑肌肉瘤等在內(nèi) 的其他許多實體瘤具有活性。但是,該藥的治療窗小,易引發(fā)以骨髓抑制為主的不良反應(yīng)。 有研宄表明,編碼胞苷脫氨酶CDA的基因序列中的單核昔酸多態(tài)性可能會影響吉西他濱的 血藥濃度,進而影響其用藥后的不良反應(yīng)乃至療效。有研宄表明CAD基因多態(tài)性位點包括 第79位點的突變A79C (即Lys27Gln),第208位點的突變G208A (即Ala70Thr)和第435位 點的突變 C435T (即 Thr 145Thr)。
【發(fā)明內(nèi)容】
[0003] 本發(fā)明提供檢測CDA基因第79、208和435位點的引物,采用Sanger測序法,可用 于快速檢測CDA基因第79、208和435位點突變的情況。
[0004] 本發(fā)明的目的之一在于提供檢測CDA基因 A79C(Lys27Gln),G208A(Ala70Thr) 和C435T(Thrl45Thr)位點的引物,包括:擴增覆蓋檢測CDA基因第A79C(Lys27Gln), G208A(Ala70Thr)和C435T(Thrl45Thr)位點的正、反向引物和測序引物;其堿基序列為:
[0005] CDA79-F :TGTAAAACGACGGCCAGTAGAGTGTGAAGCACACGTAGG ;
[0006] CDA79-R :TGTAAAACGACGGCCAGTCTGCGCCTCTTCCTGTACATC ;
[0007] CDA208-F :TGTAAAACGACGGCCAGTCTCTGCTCTCTTCTCAGGGT ;
[0008] CDA208-R :TGTAAAACGACGGCCAGTGTTGGCTAAAGAGATGAATG ;
[0009] CDA435-F :TGTAAAACGACGGCCAGTTCTCTCACGCCAGCTTTGCC ;
[0010] CDA435-R :TGTAAAACGACGGCCAGTCTCAGGCTGGAGTGTAATCTG ;
[0011] 測序-F : TGTAAAACGACGGCCAGT ;
[0012] 測序-R :AACAGCTATGACCATG。
[0013] 進一步地,所述正、反向引物的使用濃度比為:CDA79-F:CDA79-R = 1:1,CDA7208-F:CDA208-R = I:I, CDA435-F:CDA435-R = 1:1〇
[0014] 進一步地,所述測序引物的使用濃度比為:測序-F:測序-R = 1:1。
[0015] 本發(fā)明的目的之二是提供一種檢測檢測CDA基因第A79C (Lys27Gln), G208A(Ala70Thr)和C435T(Thrl45Thr)位點的方法,其包括如下步驟:
[0016] (1)提取樣品 DNA ;
[0017] (2)利用擴增引物 CDA79-F/CDA79-R,CDA208-F/CDA208-R,CDA435-F/CDA435-R 對 (1)中的DNA分別進行擴增,獲得檢測CDA基因第A79C(Lys27Gln),G208A(Ala70Thr)和 C435T(Thrl45Thr)位點的擴增產(chǎn)物;
[0018] (3)利用測序引物測序-F與測序-R對⑵中的擴增產(chǎn)物分別進行正向和反向測 序,獲得所述擴增產(chǎn)物的基因序列;
[0019] (4)將(3)中的基因序列與野生型CDA基因序列進行比較,確定突變位點是否存 在;
[0020] 其中所述引物序列為:
[0021] CDA79-F :TGTAAAACGACGGCCAGTAGAGTGTGAAGCACACGTAGG ;
[0022] CDA79-R :TGTAAAACGACGGCCAGTCTGCGCCTCTTCCTGTACATC ;
[0023] CDA208-F :TGTAAAACGACGGCCAGTCTCTGCTCTCTTCTCAGGGT ;
[0024] CDA208-R :TGTAAAACGACGGCCAGTGTTGGCTAAAGAGATGAATG ;
[0025] CDA435-F :TGTAAAACGACGGCCAGTTCTCTCACGCCAGCTTTGCC ;
[0026] CDA435-R :TGTAAAACGACGGCCAGTCTCAGGCTGGAGTGTAATCTG ;
[0027] 測序-F :TGTAAAACGACGGCCAGT ;
[0028] 測序-R :AACAGCTATGACCATG。
[0029] 本發(fā)明的目的還在于提供一種檢測CDA基因第79、208和435位點的試劑盒,所 述試劑盒包括樣品DNA抽提試劑;無水乙醇;檢測體系PCR反應(yīng)液、測序體系反應(yīng)液、陽性 對照品、陰性對照品和空白對照品,其中檢測體系PCR反應(yīng)液包括3對擴增引物CDA79-F/ CDA79-R,CDA208-F/CDA208-R,CDA435-F/CDA435-R,測序體系包括測序引物測序-F 與測 序-R,包括:
[0030] CDA79-F :TGTAAAACGACGGCCAGTAGAGTGTGAAGCACACGTAGG ;
[0031] CDA79-R :TGTAAAACGACGGCCAGTCTGCGCCTCTTCCTGTACATC ;
[0032] CDA208-F :TGTAAAACGACGGCCAGTCTCTGCTCTCTTCTCAGGGT ;
[0033] CDA208-R :TGTAAAACGACGGCCAGTGTTGGCTAAAGAGATGAATG ;
[0034] CDA435-F :TGTAAAACGACGGCCAGTTCTCTCACGCCAGCTTTGCC ;
[0035] CDA435-R :TGTAAAACGACGGCCAGTCTCAGGCTGGAGTGTAATCTG ;
[0036] 測序-F :TGTAAAACGACGGCCAGT ;
[0037] 測序-R :AACAGCTATGACCATG。
[0038] 進一步地,所述檢測體系PCR反應(yīng)液還包括2 X PCR Buffer ;dNTPs ;K0D FX DNA Polymerase。
[0039] 進一步地,所述測序體系還包括測序純化液、EDTA、無水乙醇、75%乙醇、HIDI和 Bigdye Terminator V3.1〇
[0040] 進一步地,所述測序純化液包括蝦堿性磷酸酶和核酸外切酶I。
[0041] 本發(fā)明的有益效果是:本發(fā)明設(shè)計了擴增覆蓋檢測CDA基因第79、208和435位 點的正、反向引物,并創(chuàng)新性的在PCR擴增上游引物前端和下游引物前端分別加了一段長 18bp的測序引物的正向引物序列和長16bp的測序引物的反向引物序列。這樣擴增以后的 產(chǎn)物兩端都會帶上所引入的所述的測序引物序列,隨后進行測序反應(yīng)的時候,所有的擴增 產(chǎn)物可以使用相同的測序引物就可以完成不同基因的正反向測序,很大程度的節(jié)省了檢測 成本。對送檢樣本進行PCR擴增,采用Sanger測序法,對PCR產(chǎn)物進行正反向測序反應(yīng)擴 增、純化后變性、直接測序可以全面地檢測CDA基因第79、208和435位點的突變情況。通 過調(diào)整正反向引物的濃度、退火溫度等反應(yīng)條件,可使擴增效率達到最佳。
[0042] 另一方面利用本發(fā)明所述擴展引物和測序引物,可以擴增包含第79、208和435位 點,通過測序結(jié)果的分析,可以很直觀的了解CDA基因第79、208和435位點基因突變情況, 并不受CDA基因突變多樣化以及沒有突變熱點的影響,可覆蓋待檢測的所有突變位點;具 有很高的特異性及準確性;采用PCR方法擴增目的基因并測序檢測其基因多態(tài)性,具有靈 敏度高,操作簡單、成本低等優(yōu)點。
【附圖說明】
[0043] 圖1樣品ICDA基因第79位點正向測序結(jié)果圖。
[0044] 圖2樣品2CDA基因第79位點正向測序結(jié)果圖。
【具體實施方式】
[0045] 下面結(jié)合具體實施例和附圖,進一步闡述本發(fā)明。應(yīng)當注意的是,實施例中未說明 的常規(guī)條件和方法,通常按照所屬領(lǐng)域?qū)嶒炄藛T常規(guī)采用方法:譬如,奧斯柏和金斯頓主編 的《精編分子生物學(xué)實驗指南》第四版,或者按照制造廠商所建議的步驟和條件。
[0046] 實施例1
[0047] 檢測CDA基因第79、208和435位點的引物,包括:擴增覆蓋檢測CDA基因第 79、208和435位點的正、反向引物;其中測定第79位點的正反向引物分別為CDA79-F和 CDA79-R,測定第208位點的引物分別為CDA208-F和CDA208-R,測定第435位點的引物為 CDA435-F和CDA435-R。所述擴展引物的堿基序列具體包括:
[0048]
[0049] 所述引物還包括測序的正反向引物測序-F和測序-R,其堿基序列為
[0050] 測序-F :TGTAAAACGACGGCCAGT
[0051] 測序-R :AACAGCTATGACCATG。
[0052] 在檢測中,先利用上述正、反向引物對覆蓋檢測CDA基因第79、208和435位點的 DNA片段進行擴增,獲得擴增產(chǎn)物,然后利用上述測序引物對擴增產(chǎn)物進行測序,獲得擴增 廣物的基因序列。
[0053] 檢測檢測CDA基因第79、208和435位點的試劑盒,包括:組織DNA抽提試劑盒(例 如使用天根生物的提取試劑盒);無水乙醇;檢測體系PCR反應(yīng)液、測序體系反應(yīng)液、陽性對 照品、陰性對照品和空白對照品,其中
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