本發(fā)明涉及癌癥診斷檢測(cè)用的試劑盒領(lǐng)域，具體為一種用于檢測(cè)膀胱癌的rt-qpcr試劑盒及檢測(cè)方法。
背景技術(shù)：
膀胱癌是人體最常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，其惡性度高，侵襲性強(qiáng)，易復(fù)發(fā)和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，給臨床治療帶來(lái)很大困難。但早期發(fā)現(xiàn)和治療，5年的存活率大于90％，因此早期診斷是提高膀胱癌治療效果和患者遠(yuǎn)期生存的關(guān)鍵。
目前膀胱癌的診斷和術(shù)后隨訪主要依靠尿脫落細(xì)胞檢查和膀胱鏡檢查。但尿脫落細(xì)胞檢查的敏感性低，尤其是低級(jí)別的腫瘤，因此膀胱癌的診斷仍依賴膀胱鏡檢加活檢，膀胱癌術(shù)后隨訪也主要依賴膀胱鏡檢查。膀胱鏡檢查敏感性和準(zhǔn)確度雖然都很高，但是具有創(chuàng)傷性，給病人帶來(lái)不少痛苦。
腫瘤標(biāo)志物檢測(cè)技術(shù)被認(rèn)為是早期發(fā)現(xiàn)無(wú)癥狀微灶腫瘤的唯一途徑，腫瘤標(biāo)志物試劑盒在膀胱癌早期診斷及篩查中起到至關(guān)重要的作用。
因此，尋找膀胱癌腫瘤標(biāo)志物來(lái)早期發(fā)現(xiàn)或診斷膀胱癌是當(dāng)前膀胱癌研究中的熱點(diǎn)。最新研究表明，尿上清中存在大量dna或rna標(biāo)記物，因此檢測(cè)尿液中dna或rna標(biāo)記物有望為膀胱癌的診斷提供一個(gè)新方法。
雖然已經(jīng)有30多種尿液標(biāo)記物可用于膀胱癌的診斷，但是用于診斷膀胱癌試劑盒只有：urovyv50(fish方法)，nmp-22(elisa方法)，bta(elisa)，immunocyt(elisa)；而且這些方法都或多或少存在敏感性不高，假陽(yáng)性率和假陰性率過(guò)高的問(wèn)題，無(wú)法取代膀胱鏡檢查。目前國(guó)際市場(chǎng)用于膀胱癌診斷且敏感性較高的僅有cxbladder(rna診斷)試劑盒，該試劑盒檢測(cè)尿脫落細(xì)胞中rna標(biāo)記物：cdc2，hoxa13，mdk，igfbp5和cxcr5其敏感性達(dá)到83％，特異性達(dá)到85％，可以作為膀胱鏡檢查的補(bǔ)充。
總的來(lái)說(shuō)，現(xiàn)有膀胱癌診斷試劑盒的靈敏性及準(zhǔn)確性都偏低，臨床意義有限，滿足不了早期診斷的要求。為了提高膀胱癌的早期診斷，提高術(shù)后生存率，改善病人生存質(zhì)量，有必要開(kāi)發(fā)新的腫瘤標(biāo)志物并進(jìn)行產(chǎn)業(yè)化，制備一種靈敏度高、準(zhǔn)確性強(qiáng)、使用方便、價(jià)格便宜且高效的膀胱癌診斷及術(shù)后監(jiān)護(hù)的診斷試劑盒。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
本發(fā)明針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的不足之處，提供一種敏感性及特異性優(yōu)良的用于檢測(cè)膀胱癌的rt-qpcr試劑盒。
本發(fā)明另一目的是提供一種用于檢測(cè)膀胱癌的rt-qpcr檢測(cè)方法。
為解決上述的技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案：一種用于檢測(cè)膀胱癌的rt-qpcr試劑盒，包括檢測(cè)survivin基因的引物：
survivin正向引物：atgggtgccccgacgttgc；
survivin反向引物：ccctccaagaagggccagtc；
survivin特異性探針：ccctttctcaaggaccacc-。
一種用于檢測(cè)膀胱癌的rt-qpcr檢測(cè)方法,其包括的步驟如下：
(1)取30ml尿液離心(其中轉(zhuǎn)速2000rpm，時(shí)間10分鐘，溫度4℃)，收集上清液放入另一試管；
(2)取5ml上清液加入1mlexoquick的exosome提取液，在4℃孵化12小時(shí)，混合液離心后(轉(zhuǎn)速為1500g，時(shí)間為30分鐘)使得exosome沉淀在試管底，去除上液后用100ul不含rnaase(核糖核酸酶)水懸浮exosome；
(3)在exosome試管中加入700ulqiazol洗脫液，震蕩后加入120ulchloroform(三氯甲烷)；離心(轉(zhuǎn)速14000rpm，時(shí)間15分鐘，溫度4℃)后取上清，加入同體積的體積比濃度為100％酒精；把混合液放入rna純化柱，離心后加700ul洗滌液，離心后再用500ul洗滌液洗一次，最后加入15ul不含rnaase水，離心收集rna的液體，取2ul測(cè)rna的質(zhì)量與數(shù)量；
(4)用一步法rt-qpcr測(cè)定survivin
正向引物：atgggtgccccgacgttgc
反向引物：ccctccaagaagggccagtc
tagman探針：ccctttctcaaggaccacc-
pcr混合物使用為：25ul的2xmix，1ul的正向引物(10um)，1ul的反向引物(10um)，1ultagman探針(10um)，1ul的taq酶；
pcr反應(yīng)的條件為：95℃，15分鐘，95℃，2分鐘后進(jìn)行40個(gè)循環(huán)，95℃，15秒，60℃30秒。
與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的具有如下有益效果：
(1)本發(fā)明可以同時(shí)檢測(cè)survivin在尿脫落細(xì)胞和尿液離心后上清液中exosomerna的表達(dá)，靈敏性和準(zhǔn)確性都將近90％，大大提高膀胱癌的早期診斷率，有效減輕患者痛苦，節(jié)約患者治療開(kāi)支，降低膀胱癌死亡率。
(2)本發(fā)明既可用于膀胱癌的診斷和鑒別診斷，又可用于膀胱癌治療后的復(fù)查和高危人群的篩查，具有廣闊的應(yīng)用前景。
(3)本發(fā)明是對(duì)現(xiàn)有腫瘤診斷試劑行業(yè)有力的補(bǔ)充，且將腫瘤診斷試劑水平提升到一個(gè)新高度，對(duì)行業(yè)的發(fā)展及技術(shù)進(jìn)步產(chǎn)生深遠(yuǎn)影響。
具體實(shí)施例
為了更好地闡述本發(fā)明內(nèi)容，下面用若干較佳的具體實(shí)施例進(jìn)行說(shuō)明。但這些具體實(shí)施例只是為了說(shuō)明本發(fā)明的內(nèi)容，而不是對(duì)本發(fā)明內(nèi)容進(jìn)行限制。原理說(shuō)明
exosomes(中文名外泌體，因其形態(tài)而得名)，是細(xì)胞外泌囊泡中體積較小的一種，是一種能被大多數(shù)細(xì)胞分泌的微小膜泡，具有脂質(zhì)雙層膜結(jié)構(gòu)，直徑大約40-100nm。外泌體于1983年即被發(fā)現(xiàn)，但一直被認(rèn)為是一種細(xì)胞廢棄物。最近發(fā)現(xiàn)這種微小膜泡中含有細(xì)胞特異的蛋白、脂質(zhì)和核酸，能作為信號(hào)分子傳遞給其它細(xì)胞從而影響其它細(xì)胞的功能。這些發(fā)現(xiàn)點(diǎn)燃了人們對(duì)細(xì)胞分泌膜泡的興趣。最近的研究發(fā)現(xiàn)外泌體在很多生理病理上起著重要的作用，如免疫中抗原呈遞、腫瘤的生長(zhǎng)與遷移、組織損傷的修復(fù)等。不同細(xì)胞分泌的外泌體具有不用的組成成分和功能，可作為疾病診斷的生物標(biāo)志物。
而尿上清中有大量從癌細(xì)胞分泌出來(lái)的exosomes，這些exosomes含有大量rna或dna標(biāo)記物。
本發(fā)明從眾多的標(biāo)記物中篩選出與cxbladder的標(biāo)記物完全不同的survivin。survivin在膀胱癌中有較高表達(dá)?？纱蟠筇岣咴\斷的敏感性和特異性。，本發(fā)明可同時(shí)檢測(cè)和survivin在尿細(xì)胞和上清中exosomerna的表達(dá)，開(kāi)辟了一種全新的膀胱癌診斷與術(shù)后隨訪監(jiān)測(cè)的方法。
survivin(生存素)基因是一種重要的凋亡抑制基因，具有獨(dú)特的分子結(jié)構(gòu)及生物學(xué)功能。在細(xì)胞凋亡、細(xì)胞周期的調(diào)節(jié)和血管形成中有著關(guān)鍵作用。而且survivin作為凋亡抑制蛋白家族的成員，在正常組織中無(wú)表達(dá)，但在多種腫瘤組織中高表達(dá)，且與腫瘤進(jìn)展和術(shù)后判斷有關(guān)，在膀胱癌中有較多研究。survivin在膀胱癌ⅰ、ⅱ、ⅲ級(jí)表達(dá)分別為55％、75％、81％。說(shuō)明惡性程度越高survivin表達(dá)越豐富。即survivin在膀胱癌中有高表達(dá)，可以大大提高診斷的敏感性和特異性。
一種用于檢測(cè)膀胱癌的rt-qpcr試劑盒，包括檢測(cè)survivin基因的引物：
survivin正向引物：atgggtgccccgacgttgc；
survivin反向引物：ccctccaagaagggccagtc；
survivin特異性探針：ccctttctcaaggaccacc-。
一種用于檢測(cè)膀胱癌的rt-qpcr檢測(cè)方法,其包括的步驟如下：
(1)取30ml尿液離心(其中轉(zhuǎn)速2000rpm，時(shí)間10分鐘，溫度4℃)，收集上清液放入另一試管；
(2)取5ml上清液加入1mlexoquick的exosome提取液，在4℃孵化12小時(shí)，混合液離心后(轉(zhuǎn)速為1500g，時(shí)間為30分鐘)使得exosome沉淀在試管底，去除上液后用100ul不含rnaase(核糖核酸酶)水懸浮exosome。
(3)在exosome試管中加入700ulqiazol洗脫液，震蕩后加入120ulchloroform(三氯甲烷)；離心(轉(zhuǎn)速14000rpm，時(shí)間15分鐘，溫度4℃)后取上清，加入同體積的體積比濃度為100％酒精；把混合液放入rna純化柱，離心后加700ul洗滌液，離心后再用500ul洗滌液洗一次，最后加入15ul不含rnaase水，離心收集rna的液體，取2ul測(cè)rna的質(zhì)量與數(shù)量；所述洗滌液可以選用體積比為70％乙醇溶液。
(4)用一步法rt-qpcr測(cè)定survivin
正向引物：atgggtgccccgacgttgc
反向引物：ccctccaagaagggccagtc
tagman探針：ccctttctcaaggaccacc-
pcr混合物使用為：25ul的2xmix，1ul的正向引物(10um)，1ul的反向引物(10um)，1ultagman探針(10um)，1ul的taq酶；
pcr反應(yīng)的條件為：95℃，15分鐘，95℃，2分鐘后進(jìn)行40個(gè)循環(huán)，95℃，15秒，60℃30秒。
用ct值確定反應(yīng)的陰陽(yáng)性。
通過(guò)臨床驗(yàn)證，結(jié)果見(jiàn)下表：
結(jié)果表明，survivin對(duì)膀胱癌的敏感性和特異性分別為88.2％和82.6％；
上表在對(duì)50多例膀胱癌的尿脫落細(xì)胞的rt-qpcrsurvivin的檢測(cè)顯示，其敏感性及特異性均將近90％。同時(shí)對(duì)尿脫落細(xì)胞和尿液離心后上清的exosome進(jìn)行檢測(cè)可提高敏感性，因尿液中含有大量的腫瘤exosomes，尿exosomerna應(yīng)為膀胱癌病人液體活檢(liquidbiopsy)最佳途徑。
上述實(shí)施例為本發(fā)明較佳的實(shí)施方式，但本發(fā)明的實(shí)施方式并不受上述實(shí)施例的限制，其他的任何未背離本發(fā)明的精神實(shí)質(zhì)與原理下所作的改變、修飾、替代、組合、簡(jiǎn)化，均應(yīng)為等效置換方式，都包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。