本發(fā)明屬于分子生物學(xué)檢測(cè)技術(shù)領(lǐng)域，具體地涉及一種檢測(cè)豬肺炎支原體的引物對(duì)、試劑盒及Syto9熒光定量PCR-HRM檢測(cè)方法。

背景技術(shù)：

豬支原體病(Mycoplasmal Diseases)是指由豬肺炎支原體（M.Hyopneumoniae，Mhp）、豬鼻支原體（M.hyorhinis，Mhr）、豬滑液支原體（M.hyosynoviae，Mhs）和豬嗜血支原體(豬附紅細(xì)胞體)和絮狀支原體等寄生于宿主豬，引起豬肺炎、漿膜炎、關(guān)節(jié)炎和黃疸性貧血等癥狀性疾病。其中，Mhp是引起豬支原體肺炎又稱“喘氣病”的病原微生物，其主要危害是引起豬的生長(zhǎng)受阻和飼料轉(zhuǎn)化率大幅下降，其高致病率嚴(yán)重影響?zhàn)B豬業(yè)的經(jīng)濟(jì)效益。

檢測(cè)Mhp的常用方法有分離培養(yǎng)、核酸探針、PCR、微粒凝集試驗(yàn)、免疫熒光試驗(yàn)和酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)等。雖然Mhp可以在人工培養(yǎng)基上生長(zhǎng)，但對(duì)營(yíng)養(yǎng)要求極為苛刻，且培養(yǎng)時(shí)間長(zhǎng)，容易被其他病原微生物污染。血清學(xué)檢測(cè)方法與其他支原體之間存在嚴(yán)重交叉反應(yīng)，給Mhp的鑒別診斷帶來(lái)了困難。隨著現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)的快速發(fā)展，熒光PCR技術(shù)不僅克服了血清學(xué)交叉反應(yīng)的缺點(diǎn)，而且敏感、快速、方便。

熒光PCR 技術(shù)大致分為熒光探針?lè)ǎ?biāo)記熒光PCR）和通用型的熒光染料法（非標(biāo)記熒光PCR）。前者利用熒光標(biāo)記的特異性探針或者引物來(lái)識(shí)別模版，優(yōu)點(diǎn)是特異性更高，適用于擴(kuò)增序列專一檢測(cè)，不過(guò)檢測(cè)成本要高很多。而后者主要是利用熒光染料與雙鏈DNA 分子結(jié)合發(fā)光的特性來(lái)指示擴(kuò)增產(chǎn)物的增加，其優(yōu)點(diǎn)是：無(wú)需另外設(shè)計(jì)熒光探針，簡(jiǎn)便易行，成本較低。其中，熒光染料又分為非飽和染料（如SYBR Green）和飽和染料（如LC Green 等）。

相對(duì)SYBR Green 等非飽和染料來(lái)說(shuō)，Eva Green、LC Green、Syto9等飽和染料具有以下優(yōu)點(diǎn)：①飽和的染料對(duì)PCR 反應(yīng)沒(méi)有任何抑制作用，因此可以在PCR 反應(yīng)之前加入，而其它非飽和熒光染料若較多加入到反應(yīng)液中會(huì)抑制PCR 反應(yīng)，因此只能限量加入，從而對(duì)熒光PCR 反應(yīng)的指示受到限制。②DNA 高溫變性時(shí)，非飽和熒光染料加入則會(huì)造成DNA 雙鏈高溫變性時(shí)，單鏈部分的熒光染料分子發(fā)生遷移，熒光染料分子重新結(jié)合到雙鏈DNA 的空置位點(diǎn)，造成熒光信號(hào)沒(méi)有變化，因此出現(xiàn)假陰性，特異性下降，而飽和染料則不會(huì)出現(xiàn)此類情況。③高溫穩(wěn)定，對(duì)于高GC 含量的PCR 產(chǎn)物，Tm 值較高，在DNA 雙鏈高溫熔解時(shí)，飽和熒光染料結(jié)合核酸更穩(wěn)定。

高分辨率熔解曲線(high-resolution melt，HRM) 分析技術(shù)是近幾年來(lái)在國(guó)外興起的一種用于基因突變掃描和基因分型的最新遺傳學(xué)分析方法。HRM 利用了特定的染料可以插入DNA 雙鏈中的特性，通過(guò)實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)升溫過(guò)程中雙鏈DNA 熒光染料與PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物的結(jié)合情況記錄熔解曲線，從而對(duì)樣品進(jìn)行檢測(cè)。因其操作簡(jiǎn)便快速，使用成本低，結(jié)果準(zhǔn)確，實(shí)現(xiàn)了真正的閉管操作，HRM 技術(shù)受到普遍關(guān)注。

因此，擬開(kāi)發(fā)一種基于飽和熒光染料Syto9的檢測(cè)Mhp的熒光定量PCR-HRM方法，以便更好地避免假陽(yáng)性和假陰性的干擾，最終為豬肺炎支原體的流行病學(xué)調(diào)查及疫情預(yù)警提供技術(shù)支持。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于提供一種檢測(cè)豬肺炎支原體的引物對(duì)、試劑盒以及Syto9熒光定量PCR-HRM檢測(cè)方法。

本發(fā)明所采取的技術(shù)方案是：

用于檢測(cè)豬肺炎支原體的熒光定量PCR引物對(duì)，其核苷酸序列如下所示：

上游引物P1 ：5’- GWCAAAGTCAAAGTCAGCAAAC -3’（SEQ ID NO:1）；

下游引物P2 ：5’- AGCTGTTCAAATGCTTGTCC -3’ （SEQ ID NO:2）。

一種檢測(cè)豬肺炎支原體的Syto9熒光定量PCR-HRM方法，包括如下步驟：

（1）提取待測(cè)樣品DNA；

（2）以步驟（1）提取的DNA為核酸模板，以Syto9為熒光染料，用權(quán)利要求1所述的用于檢測(cè)豬肺炎支原體的熒光定量PCR引物對(duì)進(jìn)行PCR擴(kuò)增；

（3）將步驟（2）獲得的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行高分辨率熔解曲線分析；

（4）結(jié)果判定：形成特異性的熔解曲線峰型為陽(yáng)性，無(wú)特異的熔解曲線峰型為陰性。

其中，步驟（2）所述的PCR擴(kuò)增反應(yīng)的25 μL體系中含有2xTaq Plus Master Mix 12.5 μL，P1 和P2引物（100 pmol/μL）各1.0 μL，核酸模板2.0 μL，Syto9 1.0 μL，余量為去離子水。

其中，步驟（2）所述的PCR擴(kuò)增反應(yīng)程序?yàn)槭紫?4℃ 5 min；隨后94℃ 20 s、54.5℃ 20 s、72℃ 20 s，循環(huán)擴(kuò)增45次；最后72℃延伸7 min。

其中，步驟（3）所述的高分辨率熔解曲線分析程序?yàn)?8℃變性2min，40℃雜合2min，74℃～83℃以0.3℃/s的熔解速率運(yùn)行。

一種豬肺炎支原體的熒光定量PCR檢測(cè)試劑盒，含有上述用于檢測(cè)豬肺炎支原體的熒光定量PCR引物對(duì)。

本發(fā)明的有益效果是：

本發(fā)明建立了一種基于飽和熒光染料Syto9的熒光定量PCR-HRM方法檢測(cè)豬肺炎支原體。該方法操作簡(jiǎn)單，只需在PCR反應(yīng)之前加熒光飽和染料Syto9即可；檢測(cè)速度快且高通量，全部操作過(guò)程只需2～3小時(shí)，極大縮短了檢測(cè)所需時(shí)間；費(fèi)用低，不需要特異性熒光標(biāo)記探針，每個(gè)樣品的飽和染料成本為1.6 RMB；準(zhǔn)確性高，相關(guān)系數(shù)大于0.99；特異性好，可有效區(qū)分包括Mhr、Mhs等豬病原；靈敏度高，最低檢出限可低至4.56拷貝/μL，結(jié)合HRM的閉管檢測(cè)技術(shù)可避免假陽(yáng)性或假陰性的出現(xiàn)，更易于應(yīng)用與推廣。

附圖說(shuō)明

圖1：豬肺炎支原體擴(kuò)增曲線及HRM分析圖；

圖2：熒光定量方法標(biāo)準(zhǔn)曲線及HRM分析圖；

圖3：特異性實(shí)驗(yàn)擴(kuò)增曲線圖及熔解曲線圖；

圖4：靈敏度試驗(yàn)擴(kuò)增曲線及熔解曲線圖；

圖5：臨床樣本檢測(cè)圖，L1~L8為8份臨床肺臟樣品，N1~N5為5份鼻拭子。

具體實(shí)施方式

用于檢測(cè)豬肺炎支原體的熒光定量PCR引物對(duì)，其核苷酸序列如下所示：

上游引物P1 ：5’- GWCAAAGTCAAAGTCAGCAAAC -3’（SEQ ID NO:1）；

下游引物P2 ：5’- AGCTGTTCAAATGCTTGTCC -3’ （SEQ ID NO:2）。

一種檢測(cè)豬肺炎支原體的Syto9熒光定量PCR-HRM方法，包括如下步驟：

（1）提取待測(cè)樣品DNA；

（2）以步驟（1）提取的DNA為核酸模板，以Syto9為熒光染料，用權(quán)利要求1所述的用于檢測(cè)豬肺炎支原體的熒光定量PCR引物對(duì)進(jìn)行PCR擴(kuò)增；

（3）將步驟（2）獲得的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行高分辨率熔解曲線分析；

（4）結(jié)果判定：形成特異性的熔解曲線峰型為陽(yáng)性，無(wú)特異的熔解曲線峰型為陰性。

其中，步驟（2）所述的PCR擴(kuò)增反應(yīng)的25 μL體系中含有2xTaq Plus Master Mix 12.5 μL，P1 和P2引物（100 pmol/μL）各1.0 μL，核酸模板2.0 μL，Syto9 1.0 μL，余量為去離子水。

其中，步驟（2）所述的PCR擴(kuò)增反應(yīng)程序?yàn)槭紫?4℃ 5 min；隨后94℃ 20 s、54.5℃ 20 s、72℃ 20 s，循環(huán)擴(kuò)增45次；最后72℃延伸7 min。

其中，步驟（3）所述的高分辨率熔解曲線分析程序?yàn)?8℃變性2min，40℃雜合2min，74℃～83℃以0.3℃/s的熔解速率運(yùn)行。

一種豬肺炎支原體的熒光定量PCR檢測(cè)試劑盒，含有上述用于檢測(cè)豬肺炎支原體的熒光定量PCR引物對(duì)。

下面結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步解釋，但不局限于此。實(shí)施例中未詳細(xì)說(shuō)明的操作為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的常規(guī)操作。

實(shí)施例1豬肺炎支原體的Syto9熒光定量PCR-HRM檢測(cè)方法的建立

（1）用于檢測(cè)豬肺炎支原體的熒光定量PCR引物對(duì)的設(shè)計(jì)

對(duì)GenBank中登錄的不同國(guó)家和地區(qū)Mhp P102基因的序列進(jìn)行分析，針對(duì)保守區(qū)設(shè)計(jì)一對(duì)引物，如下：

上游引物P1：5’-GWCAAAGTCAAAGTCAGCAAAC-3’（SEQ ID NO:1）；

下游引物P2：5’-AGCTGTTCAAATGCTTGTCC -3’（SEQ ID NO:2）；

預(yù)期擴(kuò)增片段大小為138bp。

（2）重組質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品的制備

按照DNA提取試劑盒說(shuō)明書(shū)提取Mhp的DNA，以其為模板，用步驟（1）設(shè)計(jì)的P1和P2引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR產(chǎn)物回收純化后，克隆于pMD18-T載體中構(gòu)建重組質(zhì)粒，經(jīng)PCR鑒定和測(cè)序顯示，PCR產(chǎn)物約為138bp，獲得正確的重組質(zhì)粒。

以重組質(zhì)粒為熒光定量PCR的標(biāo)準(zhǔn)品，測(cè)定陽(yáng)性重組質(zhì)粒濃度為142.53 ng/μL，根據(jù)公式計(jì)算分子拷貝數(shù)為4.56×10¹⁰拷貝/μL，依次做10倍梯度稀釋，將質(zhì)粒稀釋至濃度范圍為4.56×10⁹拷貝/μL～4.56×10⁰拷貝/μL ，用作標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立及靈敏度試驗(yàn)研究。

（3） PCR擴(kuò)增及HRM分析

參照2xTaq Plus Master Mix（Vazyme）產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)，按以下組成配制PCR反應(yīng)液。采用25 μL 的PCR 反應(yīng)體系，在0.2 mL PCR 反應(yīng)管內(nèi)分別加入2xTaq Plus Master Mix 12.5 μL，P1 和P2引物（100 pmol/μL）各1.0 μL，核酸模板2.0 μL，Syto9 1.0 μL，去離子水7.5 μL。PCR 反應(yīng)程序?yàn)椋?4 ℃ 5 min；94 ℃ 20 s、54.5 ℃ 20 s、72 ℃ 20 s，循環(huán)擴(kuò)增45 次；最后72℃延伸7 min。

熔解曲線分析，采用Rotor gene Q2儀器，程序?yàn)椋?8℃變性2min，40℃雜合2min，74℃到83℃以0.3℃/s的熔解速率進(jìn)行高分辨率熔解曲線分析。HRM試驗(yàn)結(jié)果用Rotor gene Q軟件進(jìn)行分析。

以標(biāo)準(zhǔn)樣品Mhp為核酸模板，水為陰性對(duì)照，每個(gè)樣品重復(fù)三次。結(jié)果如圖1所示，峰型化熔解曲線圖顯示，形成單峰Tm值為77.49±0.1℃，無(wú)非特異性擴(kuò)增。

（4）標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

選取重組質(zhì)粒5個(gè)稀釋度（4.56×10⁹拷貝/μL到4.56×10⁵拷貝/μL），每個(gè)稀釋度重復(fù)三次，以各濃度梯度的質(zhì)粒DNA為模板，采用建立的熒光定量PCR進(jìn)行擴(kuò)增，得到動(dòng)力學(xué)曲線，并通過(guò)儀器軟件自動(dòng)生成標(biāo)準(zhǔn)曲線。

結(jié)果如圖2所示，標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為y=-3.118x+39.675，相關(guān)系數(shù)R²=0.99343，結(jié)果呈良好線性關(guān)系。HRM分析表明，無(wú)非特異性擴(kuò)增。

（5）特異性試驗(yàn)

以豬肺炎支原體（Mhp）、豬鼻支原體（Mhr）、豬滑液支原體（Mhs）、豬圓環(huán)病毒（PCV2）、豬偽狂犬病病毒（PRV）的DNA及豬繁殖與呼吸綜合征病毒（PRRSV）的cDNA為模板進(jìn)行熒光定量PCR反應(yīng)，以驗(yàn)證該方法的特異性。

結(jié)果如圖3所示，只有Mhp有擴(kuò)增曲線及特異的熔解曲線，其余均無(wú)，表明建立方法特異性良好。

（6）敏感性試驗(yàn)

選取重組質(zhì)粒10個(gè)稀釋度（4.56×10⁹拷貝/μL到4.56×10⁰拷貝/μL），以各濃度梯度的重組質(zhì)粒DNA為模板，采用建立的熒光定量PCR為模板，以確定最低檢測(cè)限，判定標(biāo)準(zhǔn)以形成特異性的熔解曲線峰型為陽(yáng)性，無(wú)特異的熔解曲線峰型為陰性。

結(jié)果如圖4所示，在模板濃度低至4.56×10⁰拷貝/μL時(shí)，還有明顯的擴(kuò)增曲線及熔解峰形成。

實(shí)施例2 臨床樣品檢測(cè)

以Mhp為陽(yáng)性對(duì)照，水為陰性對(duì)照，采用本研究建立的基于飽和熒光染料Syto9的豬肺炎支原體熒光定量檢測(cè)方法，檢測(cè)臨床肺臟樣品8份、鼻拭子5份。

具體檢測(cè)方法如下：

（1）提取待測(cè)樣品DNA：按照DNA提取試劑盒進(jìn)行；

（2）以待測(cè)樣品DNA為核酸模板，用實(shí)施例1步驟（1）所設(shè)計(jì)的P1和P2引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，參照2xTaq Plus Master Mix（Vazyme）產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)，按以下組成配制PCR反應(yīng)液：采用25 μL 的PCR 反應(yīng)體系，在0.2 mL PCR 反應(yīng)管內(nèi)分別加入2xTaq Plus Master Mix 12.5 μL，P1 和P2引物（100 pmol/μL）各1.0 μL，核酸模板2.0 μL，Syto9 1.0 μL，去離子水7.5 μL；PCR 反應(yīng)程序?yàn)椋菏紫?4 ℃ 5 min；隨后94 ℃ 20 s、54.5 ℃ 20 s、72 ℃ 20 s，循環(huán)擴(kuò)增45 次；最后72℃延伸7 min；

（3）將步驟（2）的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物閉管置于RotorgeneQ2儀器，進(jìn)行高分辨率熔解曲線分析，程序?yàn)椋?8℃變性2min，40℃雜合2min，74℃到83℃以0.3℃/s的熔解速率進(jìn)行高分辨率熔解曲線分析，HRM試驗(yàn)結(jié)果用Rotor gene Q軟件進(jìn)行分析；

（4）判定標(biāo)準(zhǔn)：以形成特異性的熔解曲線峰型為陽(yáng)性，無(wú)特異的熔解曲線峰型為陰性。

樣品檢驗(yàn)結(jié)果如圖5所示，5份肺臟樣品（L2、L4、L5、L6、L7）和3份鼻拭子樣品（N1、N2、N4）均出現(xiàn)特異性的熔解曲線峰型，判斷為陽(yáng)性，其余為陰性。

SEQUENCE LISTING

<110> 廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院動(dòng)物衛(wèi)生研究所

<120> 一種檢測(cè)豬肺炎支原體的引物對(duì)、試劑盒及Syto9熒光定量PCR-HRM檢測(cè)方法

<130>

<160> 2

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

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<212> DNA

<213> 人工序列

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