肺炎支原體快速檢測(cè)和基因分型的試劑盒的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及微生物檢測(cè)技術(shù)領(lǐng)域，具體的說(shuō)涉及一種肺炎支原體快速檢測(cè)和基因 分型的試劑盒。
【背景技術(shù)】
[0002] 肺炎支原體（Mycoplasma pneumoniae, Mp)是引起人類呼吸道感染的重要病原菌 之一，每年約有10% -40%的社區(qū)獲得性肺炎是由其感染所引起的。熒光PCR檢測(cè)技術(shù)憑 借其快速、高靈敏度和特異度的優(yōu)勢(shì)，逐漸成為肺炎支原體感染檢測(cè)的金標(biāo)準(zhǔn)，逐漸在臨床 檢驗(yàn)及科研工作中廣泛使用。在檢測(cè)的基礎(chǔ)上對(duì)肺炎支原體進(jìn)行基因分型是深入了解其抗 原變異，進(jìn)行菌株流行暴發(fā)預(yù)警預(yù)測(cè)的重要監(jiān)測(cè)手段。研宄發(fā)現(xiàn)，肺炎支原體在基因水平 上可分成1型和2型兩種基因型菌株，目前所報(bào)道的幾種變異型菌株（VI型，V2a-2d型變 異菌株）均為兩種型別菌株經(jīng)同源重組造成Pl基因序列上的部分堿基差異。從全基因組 水平分析，變異型菌株仍然屬于其對(duì)應(yīng)的兩種基因型菌株。目前最常用的肺炎支原體基因 分型技術(shù)主要有 PCR-RFLP 方法（參考文獻(xiàn)：Sasaki T，Kenri T，0kazaki N，et al. 1996. Epidemiological study of Mycoplasma pneumoniae infections in japan based on PCR-restriction fragment length polymorphism of the Plcytadhesin gene. J Clin Microbiol. 34:447-449.)，熒光 PCR 熔鏈曲線分析法（參考文獻(xiàn)：Schwartz SB, Mitchell SL, Thurman KA, et al. 2009. Identification of Plvariants of Mycoplasma pneumoniae by use of high-resolution melt analysis. J Clin Microbiol.47:4117-4120.)， pl 基因多重PCR分型法（參考文獻(xiàn)：Kenri T，Taniguchi R，Sasaki Y，et al.1999. Identification of a new variable sequence in the Plcytadhesin gene of Mycoplasma pneumoniae: evidence for the generation of antigenic variation by DNA recombination between repetitive sequences. Infect Tmmun. 67:4557-4562.), pl 基因測(cè)序分析法（參考文獻(xiàn)：Zhao F, Cao B, Li J，et al. 2011. Sequence analysis of the pladhesin gene of Mycoplasma pneumoniae in clinical isolates collected in Beijing in 2008to 2009. J Clin Microbiol. 49:3000-3003·)。幾種方法均可將肺炎支原 體分為1型和2型兩種基因型，分型結(jié)果一致。基因分型是對(duì)于肺炎支原體感染進(jìn)行流行 病學(xué)溯源的重要技術(shù)手段，對(duì)于肺炎支原體感染的疫情控制有重要作用。同時(shí)，基因型別的 檢測(cè)與監(jiān)測(cè)也是對(duì)肺炎支原體暴發(fā)流行預(yù)警預(yù)測(cè)的重要依據(jù)。
[0003] 目前報(bào)道的上述常用肺炎支原體分型技術(shù)雖然已廣泛使用，但是其存在著明顯的 缺陷：這些方法均依賴于肺炎支原體的分離培養(yǎng)，即均需要從標(biāo)本中分離到肺炎支原體菌 株后，再經(jīng)純培養(yǎng)提取的高濃度肺炎支原體基因組DNA后才可以進(jìn)行基因分型，普通的臨 床標(biāo)本中的肺炎支原體核酸量不足以支持用上述的分型方法來(lái)檢測(cè)。這種情況造成了目前 肺炎支原體的檢測(cè)技術(shù)與分型技術(shù)嚴(yán)重脫節(jié)的現(xiàn)狀：標(biāo)本經(jīng)過(guò)核酸提取通過(guò)熒光PCR技術(shù) 進(jìn)行肺炎支原體快速檢測(cè)（1小時(shí)可獲得檢測(cè)結(jié)果），但是其分型卻首先需要對(duì)標(biāo)本進(jìn)行肺 炎支原體菌株分離培養(yǎng)，培養(yǎng)陽(yáng)性的標(biāo)本再進(jìn)行核酸提取后才能使用常用分型方法進(jìn)行檢 測(cè)（平均2周才可獲得分型結(jié)果），且肺炎支原體標(biāo)本培養(yǎng)十分困難，陽(yáng)性率低，造成許多熒 光PCR檢測(cè)陽(yáng)性標(biāo)本由于無(wú)法分離培養(yǎng)出菌株不能進(jìn)行分型檢測(cè)，使得分型結(jié)果存在一定 程度上偏倚。這種肺炎支原體檢測(cè)與基因分型檢測(cè)靈敏度不一致，檢測(cè)時(shí)限不同步的現(xiàn)狀 嚴(yán)重制約了肺炎支原體研宄的發(fā)展。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明目的在于提供一種能夠?qū)Ψ窝字гw快速檢測(cè)、快速進(jìn)行基因分型的試劑 盒。
[0005] 本發(fā)明通過(guò)對(duì)28株肺炎支原體全基因測(cè)序株序列比對(duì)分析（其中8株NCBI 數(shù)據(jù)庫(kù)中菌株；20株為臨床分離株），尋找到肺炎支原體1型菌株和2型菌株特異 的核苷酸序列，其中1型菌株基因組中一段長(zhǎng)約3kbp的序列特異核苷酸片段，對(duì)應(yīng) M129(GenBank:U00089. 2)測(cè)序菌株（1型菌株）基因 mpn457-459 ;以及2型菌株基因組中 一段長(zhǎng)約5kbp的序列特異核苷酸片段，對(duì)應(yīng)309(GenBank:AP012303. 1)測(cè)序菌株（2型菌 株）基因 mpna5861-5865。具體地，該2條特異的核苷酸序列如SEQ ID NO. 7、8所示。
[0006] 據(jù)此，本發(fā)明首先提供了一組用于肺炎支原體（Mycoplasma pneumoniae)檢測(cè)和 基因分型的靶序列，分別為肺炎支原體基因1型、2型的特異性核酸片段，所述特異性靶序 列分別如SEQ ID NO. 7、8所示的序列或其特異性片段。
[0007] 本發(fā)明提供了 SEQ ID NO. 7、8所示的序列或其特異性片段在肺炎支原體檢測(cè)和基 因分型中的應(yīng)用。選擇上述特異核苷酸片段中高度保守的區(qū)域可以作為PCR、熒光定量PCR 檢測(cè)的靶序列使用。
[0008] 在本發(fā)明的實(shí)施例中選擇的用于肺炎支原體檢測(cè)和基因分型的肺炎支原體基因1 型、2型的特異性核酸片段的保守序列分別為SEQ ID NO. 9、10。其中，SEQ ID NO. 9位于SEQ ID NO. 7 的第 2596-2708 位，SEQ ID NO. 10 位于 SEQ ID NO. 8 的第 3177-3323 位。
[0009] 進(jìn)一步地，本發(fā)明提供了 SEQ ID NO. 9和SEQ ID NO. 10所示的序列或它們的特異 性片段在肺炎支原體檢測(cè)和基因分型中的應(yīng)用。
[0010] 進(jìn)一步，本發(fā)明分別以上述2條序列為基礎(chǔ)設(shè)計(jì)了 2對(duì)特異性引物對(duì)以及與引物 對(duì)配合使用的熒光探針，并以此建立了一種具有更高靈敏度和特異度的肺炎支原體檢測(cè)和 基因分型的雙重?zé)晒釶CR方法。
[0011] 本發(fā)明提供了用于肺炎支原體快速檢測(cè)和基因分型的引物探針組合，包括以下4 條引物和2條探針：
[0012] MP 1-F:CCAGATTCACGTTTAATTTC(SEQ ID NO. 1)
[0013] MP 1-R:GCATCTAACATGAAGACTG(SEQ ID NO. 2)
[0014] MPl-P:AACCAACAACTTCTCATTCATCCTCAG(SEQ ID NO. 3)
[0015] MP 2-F:TTGGGTAAACCTAATTTGC(SEQ ID NO. 4)
[0016] MP 2-R:ACACGTATTAGCATCACTA(SEQ ID NO. 5)
[0017] MP 2-P:AAGACTATTCGCCTTACAACCAACC(SEQ ID NO. 6)〇
[0018] 在本發(fā)明的實(shí)施例中，2條探針類型均為TaqMan探針，檢測(cè)I型菌株的探針5'標(biāo) 記熒光基團(tuán)FAM，3'標(biāo)記淬滅基團(tuán)BHQ1，檢測(cè)2型菌株的探針5'標(biāo)記熒光基團(tuán)VIC，3'標(biāo)記 淬滅基團(tuán)BHQl。
[0019] 本發(fā)明提供了上述引物探針組合在制備肺炎支原體快速檢測(cè)和基因分型試劑盒 中的應(yīng)用。
[0020] 含有上述引物探針組合的試劑盒屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。
[0021] 本發(fā)明的試劑盒基于雙重?zé)晒舛縋CR方法，對(duì)待測(cè)樣本提取基因組DNA后，采用 上述SEQ ID NO. 1-6所示的引物探針組合進(jìn)行雙重?zé)晒舛縋CR檢測(cè)待測(cè)樣本中的肺炎支 原體并進(jìn)行基因分型。
[0022] 優(yōu)選地，本發(fā)明試劑盒25yL檢測(cè)體系的具體配置為：
[0023]
[0024]
[0025] 優(yōu)選地，本發(fā)明試劑盒工作條件為：95°C預(yù)變性2min，l個(gè)循環(huán)；95°C變性15s， 55-57°C退火15s，45個(gè)循環(huán)。
[0026] 每次檢測(cè)標(biāo)本時(shí)必須設(shè)立NTC對(duì)照（無(wú)模板的陰性對(duì)照）和兩種POS對(duì)照（陽(yáng)性 對(duì)照），POSl和P0S2 (P0S1為1型菌株陽(yáng)性對(duì)照，P0S2為2型菌株陽(yáng)性對(duì)照），兩種對(duì)照對(duì) 于結(jié)果判讀起決定性作用：
[0027] 有效擴(kuò)增：NTC (_)、POSl (+)和 P0S2 (