專利名稱：檢測肺炎支原體IgM抗體的化學(xué)發(fā)光免疫試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及醫(yī)學(xué)檢測試劑，特別是一種檢測肺炎支原體IgM抗體的化學(xué)發(fā)光免疫
試齊U盒。
背景技術(shù)：
肺炎支原體(Mycoplasma pneumonia, MP)于1962年自非典型肺炎患者痰液中分離首次分離出，是一類介于細菌與病毒之間、無細胞壁、能在無生命培養(yǎng)基上生長繁殖的原核細胞生物，屬于原生生物門、柔膜體綱、支原體目、支原體科、支原體屬，是引起兒童氣管炎、支氣管炎、原發(fā)性非典型肺炎、社區(qū)獲得性肺炎(community acquired pneumonia,CAP) 的重要病原體，感染后還可引起腦炎、心肌炎、免疫性溶血性貧血、神經(jīng)系統(tǒng)損害、腎臟損害、傳染性單核細胞增多癥和川崎病等并發(fā)癥。MP通過飛沫以氣溶膠微粒的形式傳播，可在全球范圍內(nèi)引起散發(fā)呼吸道感染或小流行，每間隔3-7年可發(fā)生一次地區(qū)性流行。MP感染發(fā)病率隨研究對象、季節(jié)、診斷方法不同而變化。人類對MP普遍易感，其中5-20歲為高發(fā)人群。據(jù)估計，在門診患兒中約有 20-40 %患J L感染MP，而住院CAP患兒中感染率為10-20 %，CAP患兒MP感染陽性率與患J L 年齡增高呈正相關(guān)。MP與其他病原的混合感染常使病程遷延，與肺炎鏈球菌混合感染率約為10%，與肺炎支原體混合感染率約為8. 8%。肺炎支原體感染人體后，經(jīng)過2-3周的潛伏期，表現(xiàn)臨床癥狀。發(fā)病初期有咽痛、 頭痛、發(fā)熱、乏力、肌肉酸痛、食欲減退、惡心、嘔吐等癥狀，一般中等熱度，2-3天后出現(xiàn)明顯的呼吸道癥狀，突出表現(xiàn)為陣發(fā)性刺激性咳嗽，以夜間為重，咳少量黏痰或黏液膿性痰，有時痰中帶血，也可有呼吸困難、胸痛。除呼吸系統(tǒng)的表現(xiàn)外，支原體肺炎可伴發(fā)多系統(tǒng)、多器官損害。皮膚損害可表現(xiàn)為斑丘疹、結(jié)節(jié)性紅斑、水皰疹等，胃腸道系統(tǒng)可見嘔吐、腹瀉和肝功損害，血液系統(tǒng)損害較常見溶血性貧血，中樞神經(jīng)系統(tǒng)損害可見多發(fā)性神經(jīng)根炎、腦膜腦炎及小腦損傷等，心血管系統(tǒng)病變偶有心肌炎及心包炎。因此，MP感染早期診斷對于盡早發(fā)現(xiàn)和治療MP感染性疾病非常重要。目前對MP的實驗室診斷方法主要有病原體分離培養(yǎng)技術(shù)、核酸檢測技術(shù)、血清學(xué)診斷技術(shù)等方法。其中病原體分離培養(yǎng)技術(shù)由于技術(shù)條件要求高，操作繁瑣，所需時間長等限制，不能解決臨床快速診斷的需要，已逐漸為其他快速檢測方法所取代。PCR法敏感性高、 特異性強，尤其適用于MP早期快速診斷。但PCR因其敏感易受污染、易出現(xiàn)假陽性結(jié)果，且技術(shù)要求高，需要專門的儀器設(shè)備和技術(shù)人員，價格昂貴等原因限制了其在臨床的普及發(fā)展。酶聯(lián)免疫吸附試驗(enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA)具有快速、敏感、 簡便、易于標準化等優(yōu)點，使其得到迅速的發(fā)展和廣泛應(yīng)用，成為最廣泛應(yīng)用的檢測方法之
ο化學(xué)發(fā)光免疫分析(Chemiluminescence Immunoassay, CLIA)是近年來繼放射免疫分析和酶免疫分析之后發(fā)展起來的一種高靈敏度的微量測定技術(shù)，具有高靈敏度、檢測范圍寬、操作簡便快速等優(yōu)點，作為放射性免疫分析、酶免疫分析的替代者，是當前最理想的免疫分析方法。目前沒有見到基于化學(xué)發(fā)光免疫分析檢測肺炎支原體的靈敏度高，穩(wěn)定性好的試劑盒。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明根據(jù)上述領(lǐng)域的存在的空白和需求，提供一種檢測肺炎支原體IgM抗體的試劑盒，實驗證明，具有本底背景低、特異性高、親和力強，同時有效降低批間差異，在免疫檢測領(lǐng)域具有較大的應(yīng)用價值。檢測肺炎支原體IgM抗體的化學(xué)發(fā)光免疫試劑盒，包括抗異硫氰酸熒光素的單抗包被的固相載體，異硫氰酸熒光素標記的肺炎支原體抗原、辣根過氧化物酶標記的抗人IgM 和化學(xué)發(fā)光底物，所述化學(xué)發(fā)光底物包括底物液A和底物液B，其中A液為的組成為pH值為7. 2 8. 5，濃度為10 30mM的磷酸鹽緩沖液中加入終濃度(W/V)為0. 02 0. 1 % Proclin300,0. 1 1. 0%吐溫-20和IOmM過氧化脲溶液；B液為50mM的iTris-HCI緩沖液中加入終濃度(W/V)為0. 02 0. 1% Proclin300,1. 0 3. OmM的4-碘苯酚，0.
的BSA，0. 1 的溴化十六烷基三甲基銨，10 50mM魯米諾溶液。所述抗異硫氰酸熒光素的單抗包被微孔板的包被濃度為2ug/ml。所述抗異硫氰酸熒光素的單抗包被的微孔板通過以下步驟制得用pH值為9. 6的碳酸鹽緩沖液配制成2ug/ml的抗異硫氰酸熒光素單抗包被液包被微孔板。所述異硫氰酸熒光素標記的肺炎支原體抗原通過以下步驟制得(1)肺炎支原體抗原用50mmol/L pH 9. 6碳酸緩沖液在2 8°C條件下透析，(2)異硫氰酸熒光素溶于二甲基亞砜中，終濃度為lmg/mL，(3)按肺炎支原體抗原異硫氰酸熒光素為Img 150 Ug的比例將步驟O)的溶液緩慢加入肺炎支原體抗原溶液中混合均勻，避光4V反應(yīng)8小時，加入NH4C1至終濃度 50mmol/L，4°C終止反應(yīng)2小時，(4)將異硫氰酸熒光素標記抗原溶液在0. 05mol/L pH 7. 2的磷酸鹽緩沖液中透析，加入含0.1% (W/ff)NaN3U% (ff/ff)牛血清白蛋白，濃度為10mmol/L pH 7. 2的磷酸鹽緩沖液中，4°C避光保存。所述試劑盒還包括稀釋液，洗滌液，支原體抗體IgM陰性對照、陽性對照、校準品， 辣根過氧化物酶標記的抗人IgM。所述抗人IgM為羊抗人IgM多抗、兔抗人IgM多抗或鼠抗人IgM單抗。本發(fā)明以異硫氰酸熒光素(FITC)標記肺炎支原體抗原，同時以抗FITC單抗包被固相載體，建立間接包被肺炎支原體化學(xué)發(fā)光檢測方法，該方法優(yōu)勢在于本底背景低、特異性高、親和力強，同時有效降低批間差異，在免疫檢測領(lǐng)域具有較大的應(yīng)用價值。本發(fā)明的試劑盒采用FITC單抗包被微孔板，與FITC標記抗原和待測樣本中肺炎支原體IgM形成固相FITC單抗-FITC標記抗原-抗體復(fù)合物，再與標記的抗人IgM形成固相FITC單抗-FITC標記抗原-抗體-標記二抗夾心復(fù)合物，然后加入化學(xué)發(fā)光底物，利用化學(xué)發(fā)光儀檢測相對發(fā)光強度，定性或半定量檢測待測樣本中肺炎支原體IgM抗體，從而避免了酶免試劑存在的靈敏度低、部分底物有毒或致癌等缺點，該試劑盒具有反應(yīng)速度快、光信號不受溫度變化影響、成本低、易儲存、特異性高、產(chǎn)品批間差異小、生產(chǎn)方便等優(yōu)勢，可為臨床肺炎支原體相關(guān)的急性呼吸道疾病輔助診斷提供更為特異、快速、可靠的診斷依據(jù)。
本發(fā)明的了一個主要的貢獻在于提供了一種新的化學(xué)發(fā)光底物液配方，與采用現(xiàn)有常規(guī)底物液配方的試劑盒相比，具有靈敏度高，穩(wěn)定性好等優(yōu)點。
具體實施例方式實施例1、本發(fā)明的試劑盒制備方法1、本發(fā)明的試劑盒包括1)肺炎支原體IgM陽性對照；2)肺炎支原體IgM陰性對照；3)肺炎支原體IgM校準品；4)包被FITC單抗的微孔板；5) FITC標記的肺炎支原體抗原；6)抗人IgM酶標記物； 7) 20倍濃縮洗滌液；以及8)化學(xué)發(fā)光底物液。其中，微孔板為M、48或96孔的微孔板條；所述抗人IgM為羊抗人IgM多抗、兔抗人IgM多抗或鼠抗人IgM單抗；所述酶辣根過氧化物酶。2、本發(fā)明I號試劑盒的制備方法以肺炎支原體IgM陽性血清配制陽性對照，以健康人血清配制陰性對照，以肺炎支原體IgM陽性血清配制校準品，微孔板包被FITC單抗，F(xiàn)ITC標記肺炎支原體抗原，酶標記抗人IgM，配制化學(xué)發(fā)光底物，分裝上述組份，以及組裝為成品。2. 1微孔板包被抗FITC單抗2. 1. 1 包被用50mM pH值為9. 6的碳酸鹽緩沖液配制成包被濃度為2ug/ml的FITC單抗包被液，并將包被液負載于微孔板(IOOul/孔)，2-8°C包被18-M小時。
名稱數(shù)量無水碳酸鈉1.6g碳酸氫鈉2.9g雙蒸水定容至IOOOmL調(diào)整pH值至pH9.6 2. 1. 2封閉用含5% BSA, pH值為7. 0-7. 5，濃度為IOmM的Tris緩沖液作為封閉液封閉上述洗滌后的固相載體。
名稱數(shù)量Tris1.212gBSA5gProclin 300ImL雙蒸水定容至IOOOmL調(diào)整pH值至pH7.4 2. 2酶標抗人IgM抗體的制備采用改良的過碘酸鈉法。具體步驟參見《生物化學(xué)與生物物理學(xué)報》16卷1984年第6期，駱加里等“過碘酸鈉氧化辣根過氧化物酶(HRP)中的若干問題及高效果的標記方法”
2. 3FITC標記肺炎支原體抗原的制備將肺炎支原體(購自廣州貴翔)2mg用50mmol/L pH 9. 6碳酸緩沖液在2 8°C條件下透析，將FITC溶于二甲基亞砜(DMSO)中，終濃度為lmg/mL，按抗原FITC = Img 150 yg的比例將FITC 二甲基亞砜溶液緩慢加入待標記抗原溶液中混合均勻，暗處 4°C反應(yīng)8小時，加入5mol/L的NH4C1溶液至終濃度50mmol/L，4°C終止反應(yīng)2小時，將FITC 標記抗原溶液在0. 05mol/L pH 7. 2的磷酸鹽緩沖液中透析至透析液清亮，加入0. (重量)NaN3、l% (重量)牛血清白蛋白(BSA)pH 7. 2的lOmmol/L磷酸鹽緩沖液中，4°C暗處保存。2. 4FITC標記抗原、酶標記抗體稀釋液的配制
權(quán)利要求
1.檢測肺炎支原體IgM抗體的化學(xué)發(fā)光免疫試劑盒，包括抗異硫氰酸熒光素的單抗包被的微孔板，異硫氰酸熒光素標記的肺炎支原體抗原、辣根過氧化物酶標記的抗人IgM和化學(xué)發(fā)光底物，所述化學(xué)發(fā)光底物包括底物液A和底物液B，其中A液為的組成為pH值為7. 2 8. 5，濃度為10 30mM的磷酸鹽緩沖液中加入終濃度(W/V)為0. 02 0. 1 % Proclin300,0. 1 1. 0%吐溫-20和IOmM過氧化脲溶液；B液為50mM的iTris-HCI緩沖液中加入終濃度(W/V)為0. 02 0. 1% Proclin300,1. 0 3. OmM的4-碘苯酚，0. 的BSA，0. 1 的溴化十六烷基三甲基銨，10 50mM魯米諾溶液。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的化學(xué)發(fā)光免疫試劑盒，所述抗異硫氰酸熒光素的單抗包被微孔板的包被濃度為2ug/ml。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的化學(xué)發(fā)光免疫試劑盒，所述抗異硫氰酸熒光素單抗包被的微孔板通過以下步驟制得用PH值為9. 6的碳酸鹽緩沖液配制成2ug/ml的抗異硫氰酸熒光素單抗包被液包被微孔板。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的化學(xué)發(fā)光免疫試劑盒，所述異硫氰酸熒光素標記的肺炎支原體抗原通過以下步驟制得(1)肺炎支原體抗原用50mmol/LpH 9. 6碳酸緩沖液在2 8°C條件下透析，(2)異硫氰酸熒光素溶于二甲基亞砜中，終濃度為lmg/mL，(3)按肺炎支原體抗原異硫氰酸熒光素為Img 150yg的比例將步驟O)的溶液緩慢加入肺炎支原體抗原溶液中混合均勻，避光4°C反應(yīng)8小時，加入NH4C1至終濃度 50mmol/L，4°C終止反應(yīng)2小時，(4)將異硫氰酸熒光素標記抗原溶液在0.05mol/L pH 7. 2的磷酸鹽緩沖液中透析，加入含0. (W/ff)NaN3U% (ff/ff)牛血清白蛋白，濃度為lOmmol/L pH 7. 2的磷酸鹽緩沖液中，4°C避光保存。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的化學(xué)發(fā)光免疫試劑盒，所述試劑盒還包括稀釋液，洗滌液，支原體抗體IgM陰性對照、陽性對照、校準品，辣根過氧化物酶標記的抗人IgM。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的化學(xué)發(fā)光免疫試劑盒，所述抗人IgM為羊抗人IgM多抗、兔抗人IgM多抗或鼠抗人IgM單抗。
全文摘要
本發(fā)明“檢測肺炎支原體IgM抗體的化學(xué)發(fā)光免疫試劑盒”，屬于醫(yī)學(xué)檢測試劑。包括抗異硫氰酸熒光素的單抗包被的微孔板，異硫氰酸熒光素標記的肺炎支原體抗原、辣根過氧化物酶標記的抗人IgM和化學(xué)發(fā)光底物。該方法優(yōu)勢在于本底背景低、特異性高、親和力強，同時有效降低批間差異，在免疫檢測領(lǐng)域具有較大的應(yīng)用價值。
文檔編號G01N33/533GK102368071SQ201110183669
公開日2012年3月7日 申請日期2011年6月30日 優(yōu)先權(quán)日2011年6月30日
發(fā)明者彭京勝, 李全, 焦守恕 申請人:同昕生物技術(shù)(北京)有限公司