支原體疫苗的制備方法
【專利說明】支原體疫苗的制備方法
【背景技術(shù)】
[0001] 支原體（Mycoplasma)屬菌屬于柔膜菌綱（Mollicutes)且代表一組源自厚壁菌門 (Firmicutes)譜系之生物體。柔膜菌綱系最小自主復(fù)制生物體，其在結(jié)構(gòu)上與其它真細菌 之不同之處在于其缺少細胞壁。業(yè)內(nèi)認為其單膜表面系在復(fù)雜免疫活性宿主環(huán)境中介導(dǎo)適 應(yīng)及存活之關(guān)鍵界面。此外，柔膜菌綱具有小基因組及數(shù)目有限之代謝路徑。因此，亦將支 原體屬成員描述為"最小自我復(fù)制生物體"。然而，盡管其非常簡單，多種支原體菌系人類及 多種動物之病原體。與其它毒力主要取決于毒素、侵襲素及細胞溶素之病原性細菌相比，病 原性支原體菌似乎不具有該等典型主要毒力因子（Chambaud，I.等人，2001，Nucleic Acids Res. 29:2145-2153, Fraser 等人，1995, Science 270:397-403)。目前可獲得之對允許病原 性支原體引起宿主細胞損傷、發(fā)炎及疾病之分子機制及效應(yīng)物之了解極少。
[0002] 病原性支原體菌主要引起人類及動物之非典型肺炎、泌尿生殖道感染及 關(guān)節(jié)炎（Blanchard, A?及 G.F.Browning(編輯）.2005.Mycoplasmas:Molecular biology, pathogenicity and strategies for control. Horizon Bioscience, ffymondham U. K. ；Kobisch M.及 Friis N. F. 1996, Swine mycoplasmoses, Rev. Sci. Tech. Off. Int. Epiz. 15, 1569-1605)。已知該等體征之再活化或加重會反復(fù)并逐漸轉(zhuǎn)變成慢性疾病， 且因此通過早期診斷及早期治療預(yù)防或治療加重或再活化非常重要。豬肺炎支原體 (M. hyopneumoniae)系地方性肺炎之病因。在豬中，其因體重增長降低及飼料效率低而系 最常見且經(jīng)濟上最重要之疾病之一。該疾病引起肺損害、慢性咳嗽、毛色無光、生長遲滯及 持續(xù)數(shù)周之不興旺外觀。肺損害、尤其在腹側(cè)頂葉及心葉中之損害之特征在于上皮細胞增 生及單核細胞之血管周及細支氣管周累積增加。豬呼吸道之另一常見支原體，即豬鼻支原 體（M. hyorhinis)可引起仔豬之多發(fā)性衆(zhòng)膜炎及關(guān)節(jié)炎。豬滑液支原體（M. hyosynoviae) 一般位于扁桃體中且可引起關(guān)節(jié)炎疾病，從而導(dǎo)致經(jīng)濟損失。豬滑液支原體系自關(guān)節(jié)及咽 /扁桃體樣品分離且可在血液及關(guān)節(jié)液中誘導(dǎo)抗體。牛支原體（M.bovis)被認為系致病性 更強之支原體菌中之一且在世界上造成顯著經(jīng)濟損失。支原體菌引起所有年齡之牛之嚴(yán)重 臨床體征。牛支原體系發(fā)現(xiàn)引起牛之肺炎、乳腺炎及關(guān)節(jié)炎之最常見支原體病原體，且其病 因?qū)W作用與母牛及公牛之耳炎、角膜結(jié)膜炎、滑膜炎及生殖障礙有關(guān)。
[0003] 由于支原體缺少細胞壁，許多靶向細胞壁合成之常見抗生素（例如青霉素或其它 0 _內(nèi)酰胺抗生素）對其無影響。實際使用之支原體感染之治療劑系一些抗生素，例如基于 大環(huán)內(nèi)酯或基于新喹諾酮或基于四環(huán)素之抗生素，但該等抗生素具有嚴(yán)重不良效應(yīng)，例如 抗藥性菌株之出現(xiàn)，其導(dǎo)致支原體感染變嚴(yán)重同時預(yù)期治療效應(yīng)不足，且成為轉(zhuǎn)變成慢性 疾病的病因。此外，疫苗接種系控制支原體感染之有效方法。然而，通常僅在復(fù)合培養(yǎng)基中 培養(yǎng)才可獲得制備疫苗所需之支原體之極高產(chǎn)率（Kobisch M.及Friis N.F. 1996, Swine mycoplasmoses, Rev. Sci. Tech. Off. Int. Epiz. 15, 1569-1605 ；Gabridge M. G.等人， 1976, Cultivation of mycoplasma in a modified tissue culture medium, Applied and Environmental microbiology. 31, 986-989 ；Sotoodehnia A.等人 2007, Preparation of agalactia vaccine in fermentor, Archives of razi institute, 62, 45-48 ;Dahlia等人， 2009Isolation of mycoplasma hyosynoviae from penumonic lung of swine, Tropical Biomedicine 26:341-345)。取決于欲培養(yǎng)之支原體菌，復(fù)合培養(yǎng)基補充有10-30%血清且 有時補充有酵母提取物。因此，由于血清之高價格，培養(yǎng)支原體菌之成本密集。此外，減少 復(fù)合培養(yǎng)基中之血清亦將有益于動物福利。因此，業(yè)內(nèi)需要以極高產(chǎn)率在低血清培養(yǎng)系統(tǒng) 中培養(yǎng)支原體，以供制備有效預(yù)防支原體感染之免疫原性組合物。此外，豬特異性支原體菌 一般系在含有豬特異性血清之復(fù)合培養(yǎng)基中培養(yǎng)（Kobisch M.及Friis N.F. 1996, Swine mycoplasmoses, Rev. Sci. Tech. Off. Int. Epiz. 15, 1569-1605)。然而，豬特異性血清可含有 其它豬特異性病原體或可含有可使欲制備之免疫原性組合物之免疫原性降低之針對豬特 異性病原體之抗體。因此，業(yè)內(nèi)亦需要以極高產(chǎn)率在無豬血清培養(yǎng)系統(tǒng)中培養(yǎng)支原體，以供 制備有效預(yù)防支原體感染之免疫原性組合物。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 在闡述本發(fā)明各態(tài)樣之前，必須注意，除非上下文明確指示其它含義，否則如在本 文中及在隨附申請專利范圍中使用之單數(shù)形式"一（a) "、"一（an)"及"該"包括復(fù)數(shù)參考。 因此，例如，在提及"一抗原"時包括復(fù)數(shù)種抗原，在提及"細胞"時系指一或多個細胞及本 領(lǐng)域技術(shù)人員已知之其等效物，等等。除非另有定義，否則本文中所使用之所有技術(shù)及科學(xué) 術(shù)語皆具有熟習(xí)本發(fā)明所屬領(lǐng)域技術(shù)者一般理解之相同意義。盡管在本發(fā)明之實踐或測試 中可使用任何與本文所述之方法及材料類似或等效之彼等，但現(xiàn)在闡述較佳方法、裝置及 材料。本文所提及之所有出版物皆系以引用方式并入本文中，用于闡述及揭示該等出版物 中所報導(dǎo)可結(jié)合本發(fā)明使用之細胞系、載體及方法之目的。本文中所有內(nèi)容皆不應(yīng)視為承 認該揭示內(nèi)容由于先前發(fā)明而有資格先于本發(fā)明。
[0005] 本發(fā)明解決先前技術(shù)中固有之問題并提供技術(shù)現(xiàn)況之獨特進步。
[0006] 概言之，本發(fā)明提供制備用于治療及/或預(yù)防對象之支原體感染之免疫原性組合 物之方法，其包含a)在低血清真核細胞系統(tǒng)中培養(yǎng)支原體菌；b)獲得該支原體菌之抗原； 及c)添加醫(yī)藥上可接受之載體。
[0007] 有利地，本發(fā)明所提供實驗數(shù)據(jù)揭示，可在低血清真核細胞系統(tǒng)中產(chǎn)生支原體菌。
[0008] 術(shù)語"免疫原性組合物"系指包含至少一種抗原之組合物，其引發(fā)被施用該免疫原 性組合物之宿主之免疫反應(yīng)。該免疫反應(yīng)可為細胞及/或抗體介導(dǎo)之針對本發(fā)明免疫原性 組合物之免疫反應(yīng)。該宿主亦被稱為"對象"。較佳地，本文所闡述或提及之任一宿主或?qū)?象系動物。
[0009] 通常，"免疫反應(yīng)"包括（但不限于）以下效應(yīng)中之一或多者：特異性指向本發(fā)明 免疫原性組合物中所包括抗原之抗體、B細胞、輔助性T細胞、抑制性T細胞及/或細胞毒 性T細胞及/或y - S T細胞之產(chǎn)生或活化。較佳地，宿主將展示保護性免疫反應(yīng)或治療反 應(yīng)。
[0010] "保護性免疫反應(yīng)"將顯示為受感染宿主通常展示之臨床體征之減少或缺少、較短 回復(fù)時間及/或縮短之感染性持續(xù)時間或組織或體液或受感染宿主之排泄物中降低之病 原體效價。
[0011] 若宿主展示保護性免疫反應(yīng)而使得對新感染之抗性將增強及/或疾病之臨床嚴(yán) 重度降低，則將免疫原性組合物稱為"疫苗"。
[0012] 如本文所用"抗原"系指（但不限于）引發(fā)宿主對包含該抗原或其免疫活性組份 之所關(guān)注免疫原性組合物或疫苗之免疫反應(yīng)之組份?？乖蛎庖呋钚越M份可為完整微生物 (呈滅活或改良活形式）或其任何碎片或部分，若將其施用宿主可引發(fā)宿主之免疫反應(yīng)。抗 原可為或可包含呈其原始形式或作為所謂改良活疫苗（MLV)中之減毒生物體之完整的活 生物體?？乖蛇M一步包含該等生物體之適當(dāng)組件（亞單位疫苗），其中該等組件系通過以 下方式來生成：破壞完整生物體或該等生物體之生長培養(yǎng)物且實施后續(xù)純化步驟以產(chǎn)生期 望結(jié)構(gòu)；或通過對適宜系統(tǒng)（如但不限于細菌、昆蟲、哺乳動物或其它物種）進行適當(dāng)操作 來誘導(dǎo)合成過程，且隨后視情況實施分離及純化程序；或通過使用適宜醫(yī)藥組合物在需要 疫苗之動物中直接引入遺傳物質(zhì)來誘導(dǎo)該等合成過程（多核苷酸疫苗接種）?？乖砂?所謂的死菌疫苗（KV)中之通過適當(dāng)方法滅活之完整生物體。若生物體系細菌，則死菌疫苗 稱為死菌苗（bacterin)。
[0013] 術(shù)語"治療及/或預(yù)防"系指減小畜群中具體支原體感染之發(fā)病率或降低由具體 支原體感染引起或與該感染相關(guān)之臨床體征之嚴(yán)重度。因此，術(shù)語"治療及/或預(yù)防"亦系 指減小畜群中受具體支原體菌感染之動物數(shù)（=減小具體支原體感染之發(fā)病率），或與動 物未接受如本文所提供免疫原性組合物之動物組相比，在動物已接受有效量之該免疫原性 組合物之動物組中降低通常與支原體感染相關(guān)或由該感染引起之臨床體征之嚴(yán)重度。
[0014] "治療及/或預(yù)防"一般涉及向需要或可受益于此治療/預(yù)防之對象或?qū)ο笕菏┯?有效量之本發(fā)明免疫原性組合物。術(shù)語"治療"系指一旦對象或畜群中之至少一些動物已 被該支原體感染且其中該等動物已顯示一些由該支原體感染引起或與該感染相關(guān)之臨床 體征，則施用有效量之免疫原性組合物。術(shù)語"預(yù)防"系指在對象之任何支原體感染之前， 或至少在該動物或動物組中沒有動物不顯示任何由該支原體感染引起或與該感染相關(guān)之 臨床體征時，向該對象施用。
[0015] 如本文所用術(shù)語"有效量"意指（但不限于）引發(fā)或能引發(fā)對象之免疫反應(yīng)之抗 原之量。該有效量能減小畜群中具體支原體感染之發(fā)病率或降低具體支原體感染之臨床體 征之嚴(yán)重度。
[0016] 較佳地，與未經(jīng)治療或經(jīng)在本發(fā)明之前可獲得之免疫原性組合物治療但隨后被具 體支原體菌感染之對象相比，臨床體征之發(fā)病率或嚴(yán)重度減小至少10%、更佳至少20%、 更佳至少30%、甚至更佳至少40%、更佳至少50%、甚至更佳至少60%、更佳至少70%、甚 至更佳至少80 %、更佳至少90 %且最佳至少95 %。
[0017] 如本文所用術(shù)語"臨床體征"系指對象來自支原體菌之感染體征。感染之臨床體 征取決于所選病原體。該等臨床體征之實施例包括（但不限于）呼吸窘迫、多發(fā)性漿膜炎 (例如腹膜炎、肋膜炎、心包炎）、關(guān)節(jié)炎（跛行及關(guān)節(jié)腫脹）、耳炎、被毛粗化、微熱、抑郁癥、 食欲下降及菌血癥。然而，臨床體征亦包括（但不限于）可自活動物直接觀察到之臨床體 征?？勺曰顒游镏苯佑^察到之臨床體征之實施例包括鼻排出物及眼分泌物、嗜睡、咳嗽、喘 鳴、膈痙攣性呼吸（thumping)、高熱、體重增加或減少、脫水、腹瀉、關(guān)節(jié)腫脹、跛行、消瘦、皮 膚蒼白、羸弱、腹瀉及諸如此類。
[0018] 可通過向有需要對