一種受銹菌誘導(dǎo)的小麥啟動(dòng)子的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及植物基因工程技術(shù)領(lǐng)域，提供了一種受銹菌誘導(dǎo)的小麥啟動(dòng)子，利用 該啟動(dòng)子可用于小麥基因工程育種等方面。
【背景技術(shù)】
[0002] 啟動(dòng)子是一段特定的直接與RNA聚合酶及其轉(zhuǎn)錄因子相結(jié)合、決定基因轉(zhuǎn)錄起始 與否的DNA序列，位于受其調(diào)控的基因上游某一固定位置，緊鄰轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)，長(zhǎng)度一般約 為一百至一千個(gè)堿基。根據(jù)作用方式及功能，可將啟動(dòng)子分為組成型、特異型及誘導(dǎo)型啟 動(dòng)子。其中組成型啟動(dòng)子可在所有組織中啟動(dòng)下游基因的表達(dá)，所啟動(dòng)基因的表達(dá)具有 持續(xù)性，如編碼肌動(dòng)蛋白和微管蛋白等植物持家基因 （housekeeping gene)的啟動(dòng)子；特 異型啟動(dòng)子僅在特定組織或時(shí)期內(nèi)具有起始轉(zhuǎn)錄的功能，如種子貯藏蛋白的胚乳特異啟 動(dòng)子。誘導(dǎo)型啟動(dòng)子僅在特定外界環(huán)境因素的刺激下才促使目的基因的表達(dá)模式發(fā)生變 化。雖然利用生物信息學(xué)軟件可以預(yù)測(cè)啟動(dòng)子包含的各類(lèi)調(diào)控元件，但是對(duì)于啟動(dòng)子的 確切的功能分析往往需要實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，如報(bào)告基因的融合表達(dá)驗(yàn)證（Thilmony等，GM Crops Food，2014, 5:36-43)，或?qū)?dòng)子捕獲載體（Promoter trapping)的轉(zhuǎn)基因后代進(jìn)行分析 (Jennifer 等，2012, PLoS One, 7: e41916)等。
[0003] 近年來(lái)，小麥（Triticum aestivum L.)基因組學(xué)的迅速發(fā)展為小麥重要基因的 分離與功能研宄提供了大量候選基因，為進(jìn)一步有效開(kāi)展基因工程育種奠定了重要基礎(chǔ)。 在基因功能研宄及基因工程改良中，目前廣泛采用的是目標(biāo)基因的過(guò)量表達(dá)與RNAi沉默 研宄。玉米泛素基因（ubiquitin)啟動(dòng)子、花椰菜花葉病毒（CaMV)35S啟動(dòng)子等組成型啟 動(dòng)子是上述研宄中最常用的啟動(dòng)子元件。然而，組成型啟動(dòng)子啟動(dòng)的外源基因在受體植物 中非特異、持續(xù)、高效表達(dá)不但會(huì)造成浪費(fèi)，而且引起非目標(biāo)性狀或其它重要農(nóng)藝性狀的變 化，弱化基因工程改良的預(yù)期目標(biāo)（Brunner等，Plang Biotechnol J. ,2011,9:897-910; Morran 等，Plang Biotechnol J·，2011，9:230-249 ;Risk 等，Plant Biotechnol J.，2013, 11:847-54)。
[0004] 利用誘導(dǎo)型啟動(dòng)子，實(shí)現(xiàn)對(duì)目的基因表達(dá)模式的精細(xì)控制是解決上述問(wèn)題的有 效策略。例如在大麥中利用組成型啟動(dòng)子過(guò)量表達(dá)小麥TaDREB3轉(zhuǎn)錄因子基因，雖然可 以提高抗凍性，但開(kāi)花時(shí)間推遲3-6周，而利用低溫誘導(dǎo)啟動(dòng)子0sWRKY71或TdCor39,轉(zhuǎn) 基因大麥不但抗凍性明顯提高，而且其它農(nóng)藝性狀基本不受影響（Kovalchuk等，Plant Biotechnol J. ,2013,11:659-670)。抗旱基因 LcNECDI在矮牽牛中組成型表達(dá)可導(dǎo)致植 株矮化、種子發(fā)芽延遲，而利用脅迫誘導(dǎo)啟動(dòng)子rd29A驅(qū)動(dòng)的過(guò)量表達(dá)，不但可以提高抗 旱性，而且可以消除對(duì)植株生長(zhǎng)及種子休眠特性影響（Estrada-Melo等，Horticulture Research, 2015, 2:15013)。因此，誘導(dǎo)型啟動(dòng)子的研宄與利用在基礎(chǔ)研宄和植物基因工程 育種方面具有重要的應(yīng)用價(jià)值。
[0005] 目前已在植物中鑒定多個(gè)誘導(dǎo)型啟動(dòng)子，可響應(yīng)高溫、低溫、干旱、鹽堿、病原菌等 脅迫信號(hào)的刺激，并被用于目的基因的過(guò)量表達(dá)或RNAi沉默研宄。但是銹菌誘導(dǎo)型啟動(dòng)子 鮮有報(bào)道。小麥條銹病、葉銹病和桿銹病是世界范圍內(nèi)危害小麥生產(chǎn)的重要病害。銹菌可 通過(guò)氣流進(jìn)行高空遠(yuǎn)距離傳播，造成大面積銹病流行，危害嚴(yán)重年份可造成減產(chǎn)10-30 %。 抗病品種的培育是防治小麥銹病的重要措施。改良基因工程技術(shù)、培育更好的抗病品種是 現(xiàn)有技術(shù)亟待解決的問(wèn)題之一。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明的發(fā)明人針對(duì)上述現(xiàn)有技術(shù)的情況，提供了一個(gè)受病原菌誘導(dǎo)的小麥啟動(dòng) 子及其應(yīng)用。該啟動(dòng)子來(lái)源于小麥類(lèi)萌發(fā)素蛋白基因，其核苷酸序列如SEQ ID ΝΟ:1所示， 長(zhǎng)度為672bp，發(fā)明人用含有該啟動(dòng)子和綠色熒光蛋白（GFP)基因的重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)化模 式植物二穗短柄草（Brachypodium)，驗(yàn)證了該啟動(dòng)子受銹菌誘導(dǎo)而增強(qiáng)表達(dá)。利用該特 性，可以把該啟動(dòng)子應(yīng)用于麥類(lèi)作物目的基因或基因片段的誘導(dǎo)型過(guò)量表達(dá)或RNAi沉默 研宄，以實(shí)現(xiàn)基因的功能分析或基因工程育種。
[0007] 本發(fā)明所述的過(guò)量表達(dá)植物抗病基因（Wang等，F(xiàn)unct Integr Genomics, 2015, 15:375-81)或沉默表達(dá)病原菌的致病基因 （Wei 等，Plant Biotechnol J.，2015, doi: 10. 1111/pbi. 12352)，正逐漸被應(yīng)用于小麥的抗病育種中，發(fā)明人基于這種 技術(shù)基礎(chǔ)獲得了本發(fā)明的技術(shù)方案。
[0008] 發(fā)明人首先提供了一個(gè)受銹菌誘導(dǎo)的小麥啟動(dòng)子，發(fā)明人將其命名為PTaGER4， 其核苷酸序列如SEQ ID NO: 1所示。
[0009] 該啟動(dòng)子來(lái)源于小麥類(lèi)萌發(fā)素蛋白基因，可以是下述核苷酸序列之一：
[0010] 核苷酸序列如SEQ ID NO: 1所示的DNA序列；
[0011] 基本上相當(dāng)于SEQ ID NO. 1所示的經(jīng)取代、缺失和/或添加一個(gè)或幾個(gè)核苷酸所 衍生的具有相同啟動(dòng)子功能的DNA序列；
[0012] 或者在嚴(yán)格條件下與SEQ ID NO. 1所示限定的序列雜交且具有啟動(dòng)子功能的DNA 序列；
[0013] 可以認(rèn)為在核苷酸序列如SEQ ID NO: 1所示的DNA序列的基礎(chǔ)上基于不破壞其啟 動(dòng)子功能的合理變化都屬于本發(fā)明所涵蓋的范圍。
[0014] 在獲得上述啟動(dòng)子的基礎(chǔ)上，發(fā)明人將該啟動(dòng)子與報(bào)告基因 GFP連接并重組至植 物表達(dá)載體。利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法進(jìn)行二穗短柄草的遺傳轉(zhuǎn)化。對(duì)轉(zhuǎn)基因材料接種短柄草銹 菌，通過(guò)對(duì)接種前后的葉片組織進(jìn)行報(bào)告基因的表達(dá)分析與熒光檢測(cè)，判定PTaGER4啟動(dòng) 子受銹菌誘導(dǎo)的特性。
[0015] 利用上述發(fā)現(xiàn)的特性，利用PTaGER4啟動(dòng)子開(kāi)展目的基因的過(guò)量表達(dá)，可以使目 的基因在受到病原菌誘導(dǎo)后增強(qiáng)表達(dá)，避免了持續(xù)過(guò)量表達(dá)可能對(duì)轉(zhuǎn)基因植株的生長(zhǎng)發(fā)育 或農(nóng)藝性狀造成的嚴(yán)重影響。
[0016] 利用PTaGER4啟動(dòng)子開(kāi)展目的基因的RNAi沉默研宄，可在受到病原菌誘導(dǎo)后抑制 目的基因的表達(dá)。
[0017] 綜上所述，本發(fā)明的發(fā)明人提供了一個(gè)受銹菌誘導(dǎo)的小麥啟動(dòng)子，并驗(yàn)證了該啟 動(dòng)子受銹菌誘導(dǎo)而增強(qiáng)表達(dá)的特性，利用該特性可以把該啟動(dòng)子應(yīng)用于麥類(lèi)作物目的基因 或基因片段的誘導(dǎo)型過(guò)量表達(dá)或RNAi沉默研宄，以實(shí)現(xiàn)基因的功能分析或基因工程育種。
【附圖說(shuō)明】
[0018] 圖1.本發(fā)明所述啟動(dòng)子轉(zhuǎn)化二穗短柄草后，農(nóng)桿菌侵染后短柄草愈傷組織的GFP 熒光檢測(cè)結(jié)果灰度圖；
[0019] 圖中C為本發(fā)明所述啟動(dòng)子轉(zhuǎn)化后二穗短柄草，D為組成型啟動(dòng)子-玉米泛素啟 動(dòng)子轉(zhuǎn)化后二穗短柄草，由圖可知，篩選獲得的短柄草愈傷組織為陽(yáng)性轉(zhuǎn)基因材料，其中可 觀察到明顯的綠色熒光信號(hào)，說(shuō)明本發(fā)明克隆的PTaGER4序列具有啟動(dòng)子的功能。
[0020] 圖2.利用本發(fā)明所述啟動(dòng)子獲得的轉(zhuǎn)基因短柄草受銹菌侵染后GFP基因的表達(dá) 水平變化結(jié)果灰度圖；
[0021] 圖2A中左側(cè)為接種前的轉(zhuǎn)基因短柄草葉片，右側(cè)為銹菌接種10天后的發(fā)病葉 片；
[0022] 圖2B中1和2為銹菌侵染前葉片中GFP基因的表達(dá)水平，3和4為銹菌侵染后葉 片中GFP基因的表達(dá)水平，
[0023] 結(jié)果表明，接種前葉片中的GFP基因表達(dá)量很低，而發(fā)病后葉片中的GFP表達(dá)量明 顯提尚；
[0024] 圖3.利用本發(fā)明所述啟動(dòng)子獲得的轉(zhuǎn)基因短柄草受到銹菌誘導(dǎo)后GFP熒光觀察 結(jié)果灰度圖；
[0025] 圖中A和D為空白對(duì)照載體pIPKbOOl (GFP上游為多克隆位點(diǎn)序列）的轉(zhuǎn)基因短 柄草；
[0026] B和E為載體pIPKb002 (玉米泛素啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)GFP)的轉(zhuǎn)基因短柄草；
[0027] C和F為本發(fā)明所述啟動(dòng)子轉(zhuǎn)化后的轉(zhuǎn)基因短柄草；
[0028] ABC為誘導(dǎo)前，DEF為誘導(dǎo)后，
[0029] 結(jié)果發(fā)現(xiàn)在不接種銹菌情況下，空白對(duì)照（pIPKbOOl)沒(méi)有GFP熒光信號(hào)（A)，對(duì)照 載體（pIPKb002)的轉(zhuǎn)基因短柄草葉片可見(jiàn)GFP熒光信號(hào)（B)，表明本發(fā)明所使用的載體系 統(tǒng)可正常工作，本發(fā)明所述啟動(dòng)子轉(zhuǎn)化后的轉(zhuǎn)基因短柄草（C)葉片中也觀察到GFP熒光信 號(hào)，表明該啟動(dòng)子具有轉(zhuǎn)錄功能；
[0030] 銹菌接種10天后，取發(fā)病葉片的銹菌孢子堆附近區(qū)域進(jìn)行觀察，空白對(duì)照（D)及 陽(yáng)性對(duì)照（E)無(wú)明顯變化，而本發(fā)明所述啟動(dòng)子轉(zhuǎn)化后的轉(zhuǎn)基因短柄草（F)葉片中的GFP 熒光信號(hào)明顯增強(qiáng)，表明其可受銹菌誘導(dǎo)而增強(qiáng)表達(dá)的特征。
【具體實(shí)施方式】
[0031] 以下實(shí)施例中進(jìn)一步定義本發(fā)明，根據(jù)以上的描述和這些實(shí)施例，本領(lǐng)域技術(shù)人 員可以確定本發(fā)明的基本特征，并且在不偏離本發(fā)明精神和范圍的情況下，可以對(duì)本發(fā)明 作出各種改變和修改，以使其適用各種用途和條件。除特殊注明外，本發(fā)明所采用的均為本 領(lǐng)域現(xiàn)有技術(shù)。
[0032] 實(shí)施例1小麥GER4基因啟動(dòng)子的克?。?br>[0033] 利用大麥類(lèi)萌發(fā)素蛋白基因 GER4c的編碼序列（GenBank :418E01)，在小麥中國(guó) 春基因組數(shù)據(jù)庫(kù)(http: //www. cerealsdb. uk. net)中搜索同源序列，通過(guò)序列拼接獲得了 長(zhǎng)度為1.4kb的序列跨疊群，其中包含小麥GER同源基因5 '端兩個(gè)外顯子及其上游序列。 根據(jù)小麥同源基因的上游序列設(shè)計(jì)引物，引物末端分別添加 StuI和SpeI酶切位點(diǎn)序列， 正向引物序列：5' -AAAAGGCCTCTTTGCAGGCACTAACTTCATA-3'，其核苷酸序列如 SEQ ID N0:2 所示；反向引物序列：5' -TTTACTAGTTGATTTCAGCTCCTTTGGGTC-3'，其核苷酸序列如SEQ ID NO: 3所示。
[0034] PCR 擴(kuò)增使用 Phusion 高保真酶（Thermo Scientif ic 公司，貨號(hào) F-530S)。
[0035] PCR擴(kuò)增體系包含 5 XPhusion HF Buffer 10 μ l、10mM dNTPs 1 μ 1、10 μ mol 引物 2.5yl、DMS0 1.5