一種植物種子中調(diào)節(jié)基因表達的啟動子與內(nèi)含子及應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于農(nóng)業(yè)生物技術(shù)領(lǐng)域；本發(fā)明涉及植物中基因時空表達的調(diào)節(jié)。本發(fā)明 描述了來自棉花的核苷酸序列，這些核苷酸序列主要包括兩個調(diào)節(jié)元件：啟動子和內(nèi)含子； 利用這些序列來構(gòu)建植物表達載體，遺傳轉(zhuǎn)化植株，調(diào)控目標基因在植物種子中的時空表 達。
【背景技術(shù)】
[0002] 啟動子是基因表達所必需的，其決定了外源基因在轉(zhuǎn)基因植物中表達的空間、時 間和表達的強度等，是人們定向改造生物的重要限制因素。植物基因啟動子按其作用方式 大體可以分為三類，即組成型啟動子、誘導(dǎo)型啟動子和組織特異性啟動子。
[0003] 目前在植物表達載體中廣泛應(yīng)用的啟動子是組成型啟動子。然而，由于組成型啟 動子驅(qū)動外源基因在受體植物內(nèi)所有部位持續(xù)的表達，不僅造成浪費，而且往往會影響植 株正常的生長發(fā)育。
[0004] 組織特異型啟動子可將外源基因集中在某一時間和/或目標組織中表達，在這類 啟動子調(diào)控下，基因往往只在某些特定的器官或組織部位表達，并表現(xiàn)出發(fā)育調(diào)節(jié)的特性。 例如煙草的花粉絨氈層細胞中特異表達基因啟動子TA29,豌豆的豆清蛋白基因啟動子可在 轉(zhuǎn)化植物種子中特異性表達，馬鈴薯塊莖儲藏蛋白基因啟動子在塊莖中優(yōu)勢表達；水稻胚 乳特異性啟動子控制外源基因在水稻胚乳中高效表達等。其不僅避免因在轉(zhuǎn)基因植株非目 標組織中表達所造成的能量浪費，而且可避免因在非收獲器官或組織中表達目標蛋白而造 成的轉(zhuǎn)基因食品的潛在的安全性等問題。因此，組織特異性啟動子不僅有助于闡明植物形 態(tài)、發(fā)育、代謝途徑等基礎(chǔ)理論，而且具有廣泛的應(yīng)用價值。
[0005] 種子特異型啟動子是組織特異型啟動子的一種，它可以控制外源基因在植物種子 中高效表達，避免外源基因在植物的其他部位表達，從而減少對植物的不利影響。
[0006] 在基因工程研究中，啟動子過強或過弱都有可能影響到基因的表達并對其它基因 的表達產(chǎn)生影響。挑選一個組織特異性強、表達模式與強度適當?shù)膯幼油腔蚬こ?實驗成敗的關(guān)鍵。
[0007] 目前，在棉花的遺傳轉(zhuǎn)化以及基因功能等研究方面，可利用的種子特異表達啟動 子仍較少，開發(fā)新型種子特異表達啟動子和深入了解這些啟動子在結(jié)構(gòu)與功能上的區(qū)別將 有助于在基因工程中對基因的表達進行精細調(diào)控。
[0008] 此外，在許多植物中都已證實內(nèi)含子的存在，尤其是當內(nèi)含子位于轉(zhuǎn)錄本5'UTR時，可以顯著增強基因的轉(zhuǎn)錄效率。在單子葉植物中能夠提高基因表達量的內(nèi)含子有來 自玉米的Adhl、Shi、Bzl、Hsp82、Actin、Ubil和GapAl基因等和來自水稻的SalT、Actl、 OsTubAl和0sCDPK2基因等；在雙子葉植物中可以提高表達量的內(nèi)含子有來自矮牽牛的 RbcS基因和馬鈴薯的ST-LS1基因等。內(nèi)含子介導(dǎo)的增強效應(yīng)可以提高基因表達100倍以 上，一般在2-10倍左右。內(nèi)含子對基因表達的增強程度與許多因素有關(guān)，如內(nèi)含子自身特 征、啟動子和外顯子序列特征、細胞類型等。不同內(nèi)含子對同一基因表達增強的程度不同， 玉米Shi基因的內(nèi)含子1可以使報告基因表達水平增強40倍，而玉米Adhl基因的內(nèi)含子 1使報告基因的表達水平僅提高4倍。Adhl基因的內(nèi)含子2和6均能不同程度地增強報告 基因的表達水平，但內(nèi)含子9卻不能。并且不同內(nèi)含子對同一基因的表達活性的影響效果 也不相同。
[0009]已有的研究表明，包括陸地棉（G.hirsutum)、海島棉（G.barbadense)、雷蒙德氏 棉（G.raimondii)以及魯賓遜氏棉（G.robinsonii)等棉屬的FAD2-1基因都含有一個位于 5'UTR的內(nèi)含子。FAD2-1的內(nèi)含子位于翻譯起始位點上游-9bp處；在棉花中，F(xiàn)AD2-1的 5'UTR內(nèi)含子富含AT，并具有典型的自主復(fù)制元件（ARS)等，該內(nèi)含子對所調(diào)控基因的時 空表達作用仍有待進一步的研究。
[0010] 因此，在本領(lǐng)域內(nèi)存在用于分離并鑒定新的種子特異或優(yōu)勢表達啟動子及表達調(diào) 控元件的需要，以便獲得具有不同廣度、表達水平和細胞類型表達特異性的啟動子等表達 調(diào)控元件用于種子特異性與種子偏好性表達。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0011] 在本發(fā)明中，提供了用于在轉(zhuǎn)基因植物中啟動目標基因在植物種子中優(yōu)勢表達的 啟動子。在SEQIDNO. 1中給出該啟動子的核苷酸序列。
[0012] 在本發(fā)明中，提供了用于在轉(zhuǎn)基因植物中增強目標基因在種子中優(yōu)勢表達的表達 元件--棉花FAD2-1的5'UTR內(nèi)含子。在SEQIDN0. 2中給出該內(nèi)含子的核苷酸序列。
[0013] 發(fā)明還涉及多種植物表達載體，所述核苷酸序列的啟動子或內(nèi)含子與載體結(jié)合， 構(gòu)成重組植物表達載體PBI-FAD2-1，pBI-FAD2-Intron。它們包括本發(fā)明的啟動子或內(nèi)含 子序列，這些序列啟動及增強目標基因在作物種子中特異性轉(zhuǎn)錄或偏好性轉(zhuǎn)錄。
[0014] 本發(fā)明包含所述宿主為根癌農(nóng)桿菌。所述啟動子或增強子與目標基因融合，轉(zhuǎn)化 到植物細胞、植物組織或植物器官中，并培育成轉(zhuǎn)化植株。
[0015] 所述的目標基因為GUS報告基因。所述的轉(zhuǎn)化植物為擬南芥。
[0016]由本發(fā)明提供的用于檢測轉(zhuǎn)基因植株⑶S基因的存在的核苷酸引物，這些引物的 實例4,轉(zhuǎn)基因植株的分子檢測中給出。
【附圖說明】
[0017] 圖1為PBI121質(zhì)粒載體示意圖。
[0018] 圖2為pBI121-FAD2-l載體示意圖。
[0019]圖 3 為pBI121-FAD2-l_intron質(zhì)粒載體不意圖。
[0020]圖4為對照及轉(zhuǎn)基因植株⑶S基因的RT-PCR檢測。M是指Marker，1-7是指轉(zhuǎn)基 因植株；Actin基因為內(nèi)參基因。
[0021] 圖5為對照及轉(zhuǎn)基因植株⑶S染色檢測結(jié)果。 具體的實施方式
[0022] 實施例1，棉花種子優(yōu)勢表達啟動子的獲得
[0023] 采用天根生化有限公司植物基因組DNA提取試劑盒，提取棉花品種"新陸早33 號"的基因組DNA。以已報道的棉花FAD2-1基因的5' -UTR內(nèi)含子序列為基礎(chǔ)，利用 hiTAIL-PCR，設(shè)計長隨機簡并引物（AD) :5' -ACGATGGACTCCAGAGCGGCCGC(G/C/A)(G/C/A) N(G/C/A)NNNCCAA-3，?三條hiTAIL-PCR引物為：PA(5，-CGGTGCATGCAGGAACCTCACC-3 ')，PB (5' -ACGATGGACTCCAGTCCGGCCACCATGGCTTCTTTCTTCGGGCT-3' )，and PC (5，-GC ATGGCGAAATTCTTCTTCTTCTITCAC-3'）?AC1引物為：5'-ACGATGGACTCCAGAG-3'?PCR產(chǎn)物 膠回收操作步驟按照天根生化公司多功能DNA純化回收試劑盒的說明進行。參照TaKaRa 公司PMD18-TVector試劑盒的說明將目的片段連接到pMD18-TVector上，并轉(zhuǎn)化大腸桿 菌T0P10,篩選抗Amp菌落，同時進行菌落PCR鑒定，經(jīng)華大基因公司測序正確后，命名為 PMD-FAD2-1。
[0024] 實施例2,棉花FAD2-1基因的5' -UTR內(nèi)含子序列的獲得
[0025] 采用天根生化有限公司植物基因組DNA提取試劑盒，提取"新陸早33號"的基因組 DNA。以已報道的棉花FAD2-1基因的5' -UTR內(nèi)含子序列為基礎(chǔ)，設(shè)計出一對特異性引物 IN-F：CGCGGATCCGGTACATTTCTCTTTAATTTCCT,IN-R：CGCGGATCCGGACACGCAAGAAGCAAAAC(戈丨」 線部位為增加的BamHI酶切位點，酶切位點前加保護堿基）：以"新陸早33號"基因組DNA 為模板進行PCR反應(yīng)。擴增體系為：10XExPCRBuffer2. 5iiL，2.5mmol/LdNTPMixture 2uL,lOumol/LG-Pl與G-P2 各 1yL，棉花基因組DNA2yL，ExTaq(5U/yL) 0? 25yL， 加雙蒸水至 25iiL。擴增條件為 94°C5min，35 個循環(huán)（94°Clmin，56°Clmin，72°Clmin)， 72°ClOmin。參照TaKaRa公司pMD18-TVector試劑盒的說明將目的片段連接到pMD18-T Vector上，并轉(zhuǎn)化大腸桿菌T