玉米低磷響應(yīng)基因ZmARF31的INDEL分子標記及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及分子遺傳學領(lǐng)域，特別是涉及與玉米耐低磷性狀相關(guān)的分子標記，具 體地，涉及玉米10號染色體上ZmARF31基因內(nèi)的一個與總干重顯著關(guān)聯(lián)的SNP標記、擴增 其的引物對以及該分子標記的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 玉米是集糧、經(jīng)、飼為一體的多元作物，同時也是重要的工業(yè)原料和能源作物，在 世界范圍內(nèi)廣泛分布。20世紀末，隨著全球玉米需求的快速增長，其種植面積逐漸超過水稻 和小麥，成為總產(chǎn)量位居世界第一的糧食作物。預(yù)計到2050年糧食增產(chǎn)的50%將來自玉 米。磷是植物生長發(fā)育所必需的三大營養(yǎng)元素之一，在糖分代謝、能量代謝、酶促反應(yīng)及光 合作用等過程中起著至關(guān)重要的作用，很大程度上決定了作物的產(chǎn)量和品質(zhì)。然而，由于土 壤對磷強烈的吸附導(dǎo)致土壤中可被植物吸收的有效無機磷濃度低至2ymol/L左右，土壤 有效磷缺乏成為限制作物產(chǎn)量的重要非生物脅迫因素之一。因此，加強培育和推廣磷高效 品種是最為有效的措施，也是農(nóng)業(yè)低碳和可持續(xù)發(fā)展的有效途徑。
[0003] 研究和生產(chǎn)實踐表明，磷的吸收利用效率在玉米自交系間存在顯著的基因型差 異。磷對植物根系發(fā)育的影響是復(fù)雜的，不僅表現(xiàn)為品種特異性和基因型依賴性，還涉及多 種激素信號通路的交叉調(diào)節(jié)。磷缺乏時主要通過抑制細胞分裂和靜止中心的丟失而嚴重制 約初生根的生長，同時有效磷通過調(diào)控側(cè)生根根原基的初始化，初生根和側(cè)生根的生長以 及側(cè)生根的生長角度，根毛的密度和伸長等改變根系的適應(yīng)性形態(tài)。
[0004] 玉米耐低磷相關(guān)性狀作為一種復(fù)雜的數(shù)量性狀，利用連鎖作圖進行QTL定位以解 析相關(guān)性狀的遺傳基礎(chǔ)已有大量報道。但QTL定位費時費力，且大部分QTL區(qū)間寬泛，目前 玉米種質(zhì)改良和分子輔助育種中尚未有耐低磷主效位點分子標記開發(fā)與利用的報道。
[0005] 關(guān)聯(lián)分析是一種在自然群體中基于連鎖不平衡（LD)鑒定表型性狀與遺傳標記或 候選基因間關(guān)系的分析方法，主要包括基于全基因組掃描（GWAS)和基于候選基因的關(guān)聯(lián) 分析。其中，基于候選基因的關(guān)聯(lián)分析是發(fā)掘與表型變異密切相關(guān)的功能等位變異的有效 手段。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明的第一個目的在于提供玉米低磷響應(yīng)基因ZmARF31中與根尖數(shù)顯著關(guān)聯(lián) 的InDel(插入/缺失）標記。
[0007] 本發(fā)明的第二個目的是提供擴增上述InDel標記的引物對。
[0008] 本發(fā)明的第三個目的是提供上述InDel標記的應(yīng)用。
[0009] 本發(fā)明的目的是通過以下技術(shù)方案實現(xiàn)的：
[0010] 基于以上目的，申請人收集了中國、美國、墨西哥等地的溫帶、熱帶、亞熱帶 玉米自交系331份，作為本研究的關(guān)聯(lián)群體，利用同源克隆方法獲得其低磷響應(yīng)基因 ZmARF31(GRMZM2G023813)序列，通過多序列比對，發(fā)掘該基因在331份玉米自交系中的變 異位點。本申請結(jié)合正常磷水平和低磷脅迫處理下玉米自交系苗期根系性狀的表型數(shù)據(jù)， 運用TASSEL軟件的一般線性模型和混合線性模型兩種方法進行候選基因關(guān)聯(lián)分析，并同 時檢測到一個（基因組版本和位置為MaizeB73AGP_v3:ChrlO: 148637125)與玉米根尖數(shù) 顯著關(guān)聯(lián)的InDel位點。該位點的等位基因為38bp的插入/缺失，在供試自交系中有缺失 和插入兩種純合基因型，其側(cè)翼序列如SEQIDNO. 1所示，其中38bp的堿基序列如SEQID NO. 4所示。
[0011] TTTGTGCTGTTGCCTCCATCTATCTGCTTGCTGAAAAATTCAGCGCTAGATATACATATATGTTTATC ATATTGATTTGGTATTTCTTTGTTGTAGCTATAACTTTTGTCGTGTTCTTGTATTACAACTGCATGCAGATCGACT GGGATGTTGCCT(SEQIDNO. 1)
[0012] 上述SEQIDNO. 1中，下劃線的堿基序列為InDel分子標記的缺失或插入的38個 喊基。
[0013] 該InDel分子標記在正常磷水平和低磷脅迫下與玉米根尖數(shù)顯著相關(guān)，位點基因 型為38bp插入的玉米自交系在正常磷水平和低磷脅迫下根尖數(shù)均高于位點基因型為缺失 的自交系。
[0014] 進一步，本發(fā)明提供了上述InDel分子標記在提高玉米根尖數(shù)中的應(yīng)用。InDel分 子標記的位點基因型插入為優(yōu)異基因型。
[0015] 本發(fā)明還提供了上述InDel分子標記在玉米育種中的應(yīng)用。
[0016] 篩選到該顯著關(guān)聯(lián)的InDel位點后，基于該位點側(cè)翼序列，申請人設(shè)計了包含上 述InDel位點的檢測玉米低磷響應(yīng)基因ZmARF31的特異性引物對。引物對序列如下所示：
[0017] 上游（F) :TTTGTGCTGTTGCCTCCATC(SEQIDN0. 2)
[0018] 下游（R) :AGGCAACATCCCAGTCGATC(SEQIDNO. 3)
[0019] 本發(fā)明提供了上述引物對在玉米種質(zhì)改良中的應(yīng)用。
[0020] 本發(fā)明還提供了上述引物對在選育抗逆玉米中的應(yīng)用。
[0021] 含有上述引物對的試劑盒也屬于本發(fā)明的保護范圍。
[0022] 本發(fā)明提供一種檢測玉米低磷響應(yīng)基因ZmARF31的方法，用上述引物對進行PCR 擴增，待檢測玉米基因組DNA，如果能夠擴增出SEQIDNO. 1所示的片段，則說明該待檢玉米 存在低磷響應(yīng)基因ZmARF31。
[0023] PCR程序為：95°C預(yù)變性 3min;95°C變性 20s、55°C退火 20s，72°C延伸 20s，共 35 個循環(huán)，72°C延伸5min。
[0024] 本發(fā)明提供了上述方法在玉米育種中的應(yīng)用。
[0025] 為進一步驗證所開發(fā)標記的有效性，發(fā)明人在關(guān)聯(lián)群體中隨機挑選16份玉米自 交系，以DNA為模板，采用TaKaRaTaq?HotStartVersion進行基于PCR擴增的標記檢 測，結(jié)果顯示該InDel位點成功地對16份玉米自交系進行長度多態(tài)性檢測（見圖1)。
[0026] 同時，發(fā)明人利用前期構(gòu)建的玉米耐低磷RIL群體（P178X9782)中的198個家系 的DNA為模板，對該位點進行標記驗證（圖2)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)在該RIL群體中，InDel位點與正 常磷水平和低磷脅迫下根尖數(shù)存在顯著相關(guān)性（圖3)，與ZmARF31基因在331份玉米自交 系中的關(guān)聯(lián)分析結(jié)果基本一致。
[0027] 本發(fā)明還提供了一種檢測玉米低磷響應(yīng)基因ZmARF31的試劑盒，其含有SEQID NO. 2~3所示的引物對。本發(fā)明結(jié)合ZmARF31在自然群體中的序列多樣性，利用候選基因 關(guān)聯(lián)分析策略揭示該基因與低磷脅迫下玉米根系性狀之間的內(nèi)在聯(lián)系，發(fā)掘其中顯著的功 能位點，并作為遺傳標記應(yīng)用于玉米分子育種，對提高玉米抗逆性具有重要意義。
[0028] 本發(fā)明的有益效果在于：運用候選基因關(guān)聯(lián)分析方法，能夠快速、精確地檢測與特 定性狀顯著關(guān)聯(lián)的SNP或InDel位點。玉米10號染色體148637125bp位置的InDel位點 (MaizeB73AGP_v3:ChrlO: 148637125)與正常磷水平下玉米苗期根尖數(shù)顯著相關(guān)，解釋表 型變異為2. 74%。該InDel位點能夠作為遺傳標記，用于抗逆玉米育種，提高玉米耐低磷能 力，具有較高的應(yīng)用價值。
【附圖說明】
[0029] 圖1為16份玉米自交系中基于PCR擴增的標記檢測。其中上帶和下帶分別表示基 因型在玉米第10號染色體148637125bp位置38bp"插入"和"缺失"。Marker為DL2000。
[0030] 圖2為RIL群體中72個家系基于PCR擴增的標記驗證。其中上帶和下帶分別表示 基因型在玉米第10號染色體148637125bp位置38bp"插入"和"缺失"。Marker為DL2000。
[0031] 圖3為RIL群體插入和缺失基因型個體的根尖數(shù)比較。CK和T分別表示正常磷水 平對照組和低磷脅迫處理組；*表示0. 01 <P< 0. 05, **表示P〈0. 01。RIL群體中具有插 入基因型和缺失基因型的家系分別為96和99個。
【具體實施方式】
[0032] 以下實施例進一步說明本發(fā)明的內(nèi)容，但不應(yīng)理解為對本發(fā)明的限制。在不背離 本發(fā)明精神和實質(zhì)的情況下，對本發(fā)明方法、步驟或條件所作的修改或替換，均屬于本發(fā)明 的范圍。
[0033] 若未特別指明，實施例中所用的技術(shù)手段為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的常規(guī)手段。
[0034] 實施例1玉米低磷響應(yīng)基因ZmARF31與根尖數(shù)顯著相關(guān)的一個InDel分子標記的 獲得及其檢測引物的確定
[0035] 本發(fā)明玉米低磷響應(yīng)基因ZmARF31與根尖數(shù)顯著相關(guān)的一個InDel分子標記是通 過以下方法獲得的：
[0036] 1)收集獲得331份來自中國、美國、墨西哥的玉米自交系，構(gòu)建了作圖所用的關(guān)聯(lián) 群體。該群體有著豐富的遺傳多樣性，包含131個溫帶玉米自交系和200個熱帶/亞熱帶 玉米自交系。
[0037] 2)關(guān)聯(lián)群體苗期根系表型鑒定。分別于2010年在四川農(nóng)業(yè)大學多營農(nóng)場基地 和2012年在四川農(nóng)業(yè)大學雅安教學實驗大棚對獲得的331份玉米自交系進行以新鮮河沙 為基質(zhì)的盆栽試驗。待玉米生長至兩葉一芯期后，定期澆灌改良的霍格蘭營養(yǎng)液。其中對 照組施澆正常的全素營養(yǎng)液（磷含量為lmmol/L)，低磷脅迫組施澆低磷營養(yǎng)液（磷含量為 liimol/L)，培養(yǎng)至6葉期。每個自交系選取5株，運用EpsonExpression10000XL掃描儀 和RegentWinrhizoCanada根系分析系統(tǒng)測定供試自交系的根系性狀。正常磷水平條件 下根尖數(shù)的平均值為881. 55,低磷脅迫下根尖數(shù)的平均值為639. 96。方差分析表明，根尖 數(shù)在不同自交系和不同處理下差異達極顯著水平（表1)。
[0038] 表1根尖數(shù)在正常供磷水平和低磷脅迫處理的方差分析
[0039]
【主權(quán)項】
1. 玉米低磷響應(yīng)基因ZmARF31的InDeL分子標記，該InDeL分子標記位于玉米第10號 染色體148637125bp位置，等位基因為38bp的插入/缺失。
2. 如權(quán)利要求1所述的InDeL分子標記，其特征在于，所述38bp的序列如SEQIDNO. 4 所示。
3. 如權(quán)利要求1所述的InDeL分子標記，其特征在于，其位點側(cè)翼序列如SEQIDNO. 1 所示。
4. 權(quán)利要求1~3任一所述的InDeL分子標記在玉米育種中的應(yīng)用。
5. 權(quán)利要求1~3任一所述的InDeL分子標記在提高玉米根尖數(shù)中的應(yīng)用。
6. 檢測權(quán)利要求1或2所述InDeL分子標記的引物對，其特征在于， 上游引物序列，5' -ITTGTGCTGTTGCCTCCATC-3' ； 下游引物序列，5' -AGGCAACATCCCAGTCGATC-3'。
7. 權(quán)利要求6所述引物對在玉米種質(zhì)改良中的應(yīng)用。
8. -種檢測玉米低磷響應(yīng)基因ZmARF31的方法，其特征在于，用權(quán)利要求6所述的引物 對進行PCR擴增待檢測玉米基因組DNA，如果能夠擴增出SEQIDNO. 1所示的片段，則說明 該待檢玉米存在低磷響應(yīng)基因ZmARF31基因。
9. 一種檢測玉米低磷響應(yīng)基因ZmARF31的試劑盒，其含有SEQIDNO. 2、3所示的引物 對。
【專利摘要】本發(fā)明提供了玉米低磷響應(yīng)基因ZmARF31基因內(nèi)的InDel分子標記，該SNP標記位于玉米第10號染色體148637125 bp位置，等位基因為38 bp的插入/缺失，所述38 bp的序列如SEQ ID NO.4所示，該等位基因的側(cè)翼序列如SEQ ID NO.1所示，其由核苷酸序列如SEQ ID NO.2～3所示的引物擴增得到。該InDeL分子標記在正常磷水平和低磷脅迫下與玉米根尖數(shù)顯著相關(guān)，位點基因型為38 bp插入的玉米自交系在正常磷水平和低磷脅迫下根尖數(shù)均高于位點基因型為缺失的自交系。本發(fā)明的分子標記可用于玉米輔助育種，加速玉米磷高效特異材料創(chuàng)制與新品種選育進程。
【IPC分類】C12N15-82, C12N15-11, C12Q1-68, A01H5-00
【公開號】CN104711254
【申請?zhí)枴緾N201410578033
【發(fā)明人】盧艷麗, 劉玲, 吳鋒鍇, 王 琦, 胡博晶, 徐潔, 高世斌, 唐祈林, 蘭海, 劉堅
【申請人】四川農(nóng)業(yè)大學
【公開日】2015年6月17日
【申請日】2014年10月23日