以酪蛋白水解物為氮源發(fā)酵生產(chǎn)青霉素g?；傅姆椒?br>【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種青霉素酰化酶的生產(chǎn)方法，尤其涉及以酪蛋白水解物為氮源發(fā)酵 生產(chǎn)青霉素G?；傅姆椒?。
【背景技術(shù)】
[0002] 青霉素G酰化酶（PGA)是重要的工業(yè)用酶，廣泛用于催化青霉素G生成6-氨基青 霉烷酸（6-APA)和催化頭孢霉素G生成7-氨基脫乙酰氧基頭孢烷酸（7-ADCA)。6-APA和 7-ADCA是抗生素工業(yè)上生產(chǎn)半合成青霉素類抗生素和頭孢霉素類抗生素的重要原料。
[0003] 目前，青霉素G?；改晷枨蟪^800噸，并且每年大約以10%左右的速度增長， 而國內(nèi)市場上銷售的高活力青霉素G?；钢苿┤远鄶?shù)依賴于進(jìn)口。我國自20世紀(jì)80年 代開始青霉素G?；傅难绣?，主要集中在產(chǎn)青霉素G?；腹こ叹臉?gòu)建、青霉素G?；?酶酶分子特性和底物特異性研宄、青霉素G酰化酶的分離純化等方面。發(fā)酵生產(chǎn)青霉素G 酰化酶雖已初步實(shí)現(xiàn)工業(yè)化，但產(chǎn)酶菌的產(chǎn)酶活性、工程菌的穩(wěn)定性、生產(chǎn)工藝技術(shù)仍有待 于提高。一方面，構(gòu)建基因工程菌工作復(fù)雜而繁瑣，所構(gòu)建的菌株遺傳穩(wěn)定性較差。另一方 面，目前國內(nèi)外用于產(chǎn)青霉素G?；傅陌l(fā)酵培養(yǎng)基中的氮源主要為蛋白胨、牛肉膏、酵母 膏等，來源有限且成本昂貴，不能夠滿足大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)的需要。因此，獲得高產(chǎn)青霉素 G?；干a(chǎn)菌株并提高其遺傳穩(wěn)定性，以及降低發(fā)酵培養(yǎng)基的生產(chǎn)成本，是國內(nèi)青霉素G 酰化酶工業(yè)化生產(chǎn)面臨的最大挑戰(zhàn)。
[0004] 酪蛋白是西北藏區(qū)牦牛乳中含量最高的蛋白質(zhì)，由a、0、Y和k酪蛋白組成。 利用酸水解技術(shù)制得的酪蛋白水解物，不但成本低，而且可發(fā)酵性含氮物質(zhì)種類多、含量豐 富，可作為食品原料或微生物培養(yǎng)基使用。酪蛋白水解物對(duì)菌體的生長及產(chǎn)酶能力具有一 定的促進(jìn)作用，是發(fā)酵生產(chǎn)青霉素G?；傅睦硐氲呐囵B(yǎng)基氮源。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是提供一種成本低、產(chǎn)量高的以酪蛋白水解物為氮源 發(fā)酵生產(chǎn)青霉素G?；傅姆椒?。
[0006] 為解決上述問題，本發(fā)明所述的以酪蛋白水解物為氮源發(fā)酵生產(chǎn)青霉素G?；?的方法，包括以下步驟： ⑴配制斜面培養(yǎng)基： 將5g酵母粉、10g蛋白胨、10g氯化鈉、15g瓊脂與1L蒸餾水混合，采用質(zhì)量濃度為 10%~20%的氫氧化鈉溶液調(diào)pH值至7. 0,分別裝/倒入20ml試管和直徑6cm平皿中，在高 壓蒸汽滅菌鍋中維持lkg(f)/cm2滅菌30min，然后取出，自然冷卻凝固，即分別得到裝有斜 面培養(yǎng)基的試管和裝有斜面培養(yǎng)基的平皿； ⑵以賭狀芽孢桿菌你aciByscereyW21090作為出發(fā)菌株，無菌條件下在所述裝有 斜面培養(yǎng)基的試管中的斜面培養(yǎng)基上接種所述蠟狀芽孢桿菌你21090， 置于30°C恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48h，得到活化的菌株； ⑶制備賭狀芽抱桿菌你21090菌懸液： 將5支所述活化的菌株，分別用10ml無菌生理鹽水將菌苔洗下，并倒入盛有玻璃珠的 小三角瓶中，振蕩30min以打碎菌塊；然后在3000r/min條件下離心15min，棄去上清液，得 到菌體；將該菌體用無菌生理鹽水洗滌2~3次，制成細(xì)胞濃度為108個(gè)/mL的菌懸液； ⑷紫外誘變選育高產(chǎn)青霉素G?；傅耐蛔冎辏?打開15W紫外線燈開關(guān)，預(yù)熱15~25min;同時(shí)，在2套所述裝有斜面培養(yǎng)基的平皿中 分別加入所述菌懸液5mL，并放入無菌攪拌棒，置于磁力攪拌器上，然后在室溫條件下距離 紫外燈下30cm攪拌照射15min;最后，經(jīng)篩選獲得一株產(chǎn)青霉素G?；该富盍?52U/L 的突變株； (5) 制備蠟狀芽孢桿菌突變株發(fā)酵培養(yǎng)基： 將16. 2g酪蛋白水解物、6. 8g牛肉膏、7g葡萄糖、18g苯乙酸、6g氯化鈉、0. 4g氯化鎂、 0. 005g氯化鐵溶解于1LpH值為7. 0的磷酸鹽緩沖溶液中，然后在lkg(f)/cm2壓強(qiáng)下滅菌 30min，經(jīng)自然冷卻至30°C后，即得蠟狀芽孢桿菌突變株發(fā)酵培養(yǎng)基； (6) 青霉素G?；傅陌l(fā)酵生產(chǎn)： 在250ml三角瓶中裝入60ml所述蠟狀芽孢桿菌突變株發(fā)酵培養(yǎng)基，然后置于恒溫振 蕩器上，在30°C下以220r/min的轉(zhuǎn)速恒溫振蕩培養(yǎng)72h，得到青霉素G?；该富盍?408U/L的發(fā)酵醪液； (7) 發(fā)酵醪液預(yù)處理與酶液濃縮： 在所述發(fā)酵醪液中按其體積的〇. 05%加入絮凝劑聚丙烯酰胺，攪拌均勻后，再按所述 發(fā)酵醪液體積的〇. 01%的加入葡聚糖，繼續(xù)攪拌，靜置lh，在3000r/min條件下離心2次， 每次15min，得到澄清酶液；所述澄清酶液在溫度為35°C、真空度為-100~_90kPa的條件 下，經(jīng)薄膜濃縮50~60min后，得到濃縮酶液； (8) 制備青霉素G?；敢后w酶制劑： 往所述濃縮酶液中邊攪拌邊加入研細(xì)的固體硫酸銨，當(dāng)其飽和度為50%時(shí)，以8000r/min的速率離心10min去除雜蛋白，得到上清液；然后再往所述上清液中繼續(xù)加入所述研 細(xì)的固體硫酸銨，當(dāng)其飽和度為70%時(shí)，完全沉淀青霉素G酰化酶，得到沉淀物；將所述沉淀 物按5%的比例溶解于pH值為7. 0的磷酸鹽緩沖液中，隨后經(jīng)孔徑為0. 01ym的超濾膜處 理，脫去硫酸銨，得到酶活力達(dá)到13U/ml的青霉素G酰化酶液體酶制劑； (9) 制備青霉素G?；腹腆w酶粉： 在所述青霉素G酰化酶液體酶制劑中依次加入其體積12%的可溶性淀粉、10%的氯化 鈉、5%的甘油，混合均勻后經(jīng)噴霧干燥即得青霉素G酰化酶固體酶粉。
[0007] 所述步驟(7)中的薄膜規(guī)格為0. 2ym。
[0008] 所述步驟⑶中噴霧干燥的條件是指熱風(fēng)進(jìn)口溫度135°C、熱風(fēng)流量5m3/min、出口 溫度60°C、進(jìn)料速度160ml/h、霧化器壓力0? 4MPa。
[0009] 本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比具有以下優(yōu)點(diǎn)： 1、本發(fā)明充分利用牦牛乳酸水解酪蛋白的優(yōu)良特性，通過紫外誘變選育出一株高產(chǎn)青 霉素G?；傅耐蛔兙?，以酪蛋白水解液作為培養(yǎng)基的主要氮源，確定了培養(yǎng)基配方、發(fā) 酵工藝參數(shù)和酶制劑制備工藝方法，在降低生產(chǎn)成本的情況下有效提高了產(chǎn)量。
[0010] 2、本發(fā)明所得產(chǎn)品為類白色固體顆粒，無結(jié)塊、無潮解現(xiàn)象，無異味，有特殊發(fā)酵 氣味。經(jīng)理化檢測，本發(fā)明所得產(chǎn)品符合技術(shù)指標(biāo)要求(參見表1)。
[0011] 表1PGA的理化與衛(wèi)生指標(biāo)檢測結(jié)果
【主權(quán)項(xiàng)】
1.以酪蛋白水解物為氮源發(fā)酵生產(chǎn)青霉素G?；傅姆椒?，包括以下步驟： ⑴配制斜面培養(yǎng)基： 將5g酵母粉、10g蛋白胨、10g氯化鈉、15g瓊脂與1L蒸餾水混合，采用質(zhì)量濃度為 10%~20%的氫氧化鈉溶液調(diào)pH值至7. 0,分別裝/倒入20ml試管和直徑6cm平皿中，在高 壓蒸汽滅菌鍋中維持lkg(f)/cm2滅菌30min，然后取出，自然冷卻凝固，即分別得到裝有斜 面培養(yǎng)基的試管和裝有斜面培養(yǎng)基的平皿； ⑵以蠟狀芽孢桿菌21090作為出發(fā)菌株，無菌條件下在所述裝有斜面培養(yǎng)基的試管中 的斜面培養(yǎng)基上接種所述蠟狀芽孢桿菌21090,置于30°C恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48h，得到活化 的菌株； ⑶制備蠟狀芽孢桿菌21090菌懸液： 將5支所述活化的菌株，分別用10ml無菌生理鹽水將菌苔洗下，并倒入盛有玻璃珠的 小三角瓶中，振蕩30min以打碎菌塊；然后在3000r/min條件下離心15min，棄去上清液，得 到菌體；將該菌體用無菌生理鹽水洗滌2~3次，制成細(xì)胞濃度為108個(gè)/mL的菌懸液； ⑷紫外誘變選育高產(chǎn)青霉素G?；傅耐蛔冎辏? 打開15W紫外線燈開關(guān)，預(yù)熱15~25min;同時(shí)，在2套所述裝有斜面培養(yǎng)基的平皿中 分別加入所述菌懸液5mL，并放入無菌攪拌棒，置于磁力攪拌器上，然后在室溫條件下距離 紫外燈下30cm攪拌照射15min;最后，經(jīng)篩選獲得一株產(chǎn)青霉素G?；该富盍?52U/L 的突變株； (5) 制備蠟狀芽孢桿菌突變株發(fā)酵培養(yǎng)基： 將16. 2g酪蛋白水解物、6. 8g牛肉膏、7g葡萄糖、18g苯乙酸、6g氯化鈉、0. 4 g氯化鎂、 0. 005g氯化鐵溶解于1LpH值為7. 0的磷酸鹽緩沖溶液中，然后在lkg(f)/cm2壓強(qiáng)下滅菌 30min，經(jīng)自然冷卻至30°C后，即得蠟狀芽孢桿菌突變株發(fā)酵培養(yǎng)基； (6) 青霉素G?；傅陌l(fā)酵生產(chǎn)： 在250ml三角瓶中裝入60ml所述蠟狀芽孢桿菌突變株發(fā)酵培養(yǎng)基，然后置于恒溫振 蕩器上，在30°C下以220r/min的轉(zhuǎn)速恒溫振蕩培養(yǎng)72h，得到青霉素G?；该富盍?408U/L的發(fā)酵醪液； (7) 發(fā)酵醪液預(yù)處理與酶液濃縮： 在所述發(fā)酵醪液中按其體積的〇. 05%加入絮凝劑聚丙烯酰胺，攪拌均勻后，再按所述 發(fā)酵醪液體積的〇. 01%的加入葡聚糖，繼續(xù)攪拌，靜置lh，在3000r/min條件下離心2次， 每次15min，得到澄清酶液；所述澄清酶液在溫度為35°C、真空度為-100~_90kPa的條件 下，經(jīng)薄膜濃縮50~60min后，得到濃縮酶液； (8) 制備青霉素G酰化酶液體酶制劑： 往所述濃縮酶液中邊攪拌邊加入研細(xì)的固體硫酸銨，當(dāng)其飽和度為50%時(shí)，以8000 r/min的速率離心10min去除雜蛋白，得到上清液；然后再往所述上清液中繼續(xù)加入所述研 細(xì)的固體硫酸銨，當(dāng)其飽和度為70%時(shí)，完全沉淀青霉素G?；?，得到沉淀物；將所述沉淀 物按5%的比例溶解于pH值為7. 0的磷酸鹽緩沖液中，隨后經(jīng)孔徑為0. 01 y m的超濾膜處 理，脫去硫酸銨，得到酶活力達(dá)到13U/ml的青霉素G?；敢后w酶制劑； (9) 制備青霉素G酰化酶固體酶粉： 在所述青霉素G?；敢后w酶制劑中依次加入其體積12%的可溶性淀粉、10%的氯化 鈉、5%的甘油，混合均勻后經(jīng)噴霧干燥即得青霉素G?；腹腆w酶粉。
2. 如權(quán)利要求1所述的以酪蛋白水解物為氮源發(fā)酵生產(chǎn)青霉素G酰化酶的方法，其特 征在于：所述步驟(7)中的薄膜規(guī)格為0. 2ym。
3. 如權(quán)利要求1所述的以酪蛋白水解物為氮源發(fā)酵生產(chǎn)青霉素G?；傅姆椒?，其特 征在于：所述步驟⑶中噴霧干燥的條件是指熱風(fēng)進(jìn)口溫度135°C、熱風(fēng)流量5m3/min、出口 溫度60°C、進(jìn)料速度160ml/h、霧化器壓力0? 4MPa。
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種以酪蛋白水解物為氮源發(fā)酵生產(chǎn)青霉素G酰化酶的方法，該方法包括以下步驟：⑴配制裝有斜面培養(yǎng)基的試管和裝有斜面培養(yǎng)基的平皿；⑵無菌條件下在裝有斜面培養(yǎng)基的試管中的斜面培養(yǎng)基上接種蠟狀芽孢桿菌21090，經(jīng)恒溫培養(yǎng)得到活化的菌株；⑶制備細(xì)胞濃度為108個(gè)/mL的菌懸液；⑷紫外誘變選育高產(chǎn)青霉素G酰化酶的突變株；⑸以酪蛋白水解物等制備蠟狀芽孢桿菌突變株發(fā)酵培養(yǎng)基；⑹青霉素G酰化酶發(fā)酵后得到發(fā)酵醪液；⑺發(fā)酵醪液預(yù)處理與酶液濃縮后得到濃縮酶液；⑻制備青霉素G?；敢后w酶制劑；⑼制備青霉素G?；腹腆w酶粉：在PGA液體酶制劑中依次加入可溶性淀粉、氯化鈉、甘油，混合均勻后經(jīng)噴霧干燥即得PGA酶粉。本發(fā)明成本低、產(chǎn)量高。
【IPC分類】C12N9-84, C12N15-01, C12N13-00, C12R1-085
【公開號(hào)】CN104711244
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201510150866
【發(fā)明人】馬志安, 邵威平, 楊富民, 李國峰, 張永玲, 郭臨生, 顏麗, 吳卓穎, 楊敏, 張忠明
【申請(qǐng)人】臨夏州華安生物制品有限責(zé)任公司
【公開日】2015年6月17日
【申請(qǐng)日】2015年4月1日