用于乙型肝炎病毒感染治療的導(dǎo)向rna靶點的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明一般涉及分子生物學、細胞生物學和基因治療領(lǐng)域。更具體地，本發(fā)明涉 及用于乙型肝炎病毒（HepatitisBvirus，HBV)感染治療的15個導(dǎo)向RNA(shortguide RNA，gRNA)靶點，通過這些靶點獲得的導(dǎo)向RNA及其重組表達載體，以及應(yīng)用這些靶點和導(dǎo) 向RNA以各種方式獲得的用于HBV感染治療的藥物和方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 目前針對HBV的抗病毒藥物為核苷酸類似物和干擾素。雖然，核苷酸類似物 (Nucleotide,NAs)可通過抑制HBV聚合酶的活性高效抑制HBV復(fù)制，但其對HBV共價閉合 環(huán)狀DNA(CovalentlyclosedcircularDNA，cccDNA)無作用，由于cccDNA是HBV復(fù)制的 模版，其半衰期可達數(shù)年至數(shù)十年，所以短期內(nèi)NAs不能清除HBV，機體免疫力低下或耐藥 等因素均可誘發(fā)HBV再激活和肝炎復(fù)發(fā)。盡管，干擾素a(IFN-a)可清除一部分感染者體 內(nèi)的HBV，且體外實驗證實高劑量的IFN-a可降解CCCDNA，但其清除比例較低（〈8% )，且 由于高劑量的IFN-a具有很強的副作用，機體不能耐受。因此，HBVcccDNA是慢性乙型肝 炎（乙肝）治療過程中的一大障礙，目前尚無高效清除HBVcccDNA的方法。
[0003] CRISPR/Cas系統(tǒng)，是最近幾年來發(fā)展起來的一種新的可對基因組DNA進行靶向 編輯的工具。該系統(tǒng)原本是存在于細菌中的一種對付病毒等外來DNA的防御系統(tǒng)。在一 些細菌基因組中存在一系列成簇排列的DNA序列，被稱作"規(guī)律間隔成簇短回文重復(fù)序 列"（ClusteredRegularlyInterspacedShortPalindromicRepeats，CRISPR)。這些重 復(fù)序列的間隔序列，被發(fā)現(xiàn)和很多能夠侵入細菌的噬菌體DNA序列相同。并且，這些序列 在被轉(zhuǎn)錄成為RNA后，能夠與宿主細菌產(chǎn)生的一類稱為Cas(CRISPRassociated)的蛋白 質(zhì)形成復(fù)合體，來對Cas蛋白起到導(dǎo)向作用，因此這段RNA也被稱為導(dǎo)向RNA(guideRNA， gRNA)。當復(fù)合體檢測到入侵的DNA和gRNA序列一致時，CRISPR/Cas系統(tǒng)可以識別外源核 酸中的特殊片段，該特殊片段中含有原型間隔序列峨鄰基序（即ProtospacerAssociated Motif,PAM)。Cas蛋白由此到達PAM識別序列的特定位點而對外來DNA進行定點、特異的切 害J，達到DNA序列的修飾或者編輯的目的。
[0004] 嚴格來說，在細菌體內(nèi)gRNA由兩部分組成：一部分為來自于間隔區(qū)、 識別入侵DNA的crRNA(CRISPRRNA,crRNA)，另一部分為活化Cas蛋白所需的 tracrRNA(trans-activatingcrRNA,tracrRNA)。在人工構(gòu)建的CRISPR_Cas9 系統(tǒng)載體中， 這兩段RNA可融合為一條，稱為導(dǎo)向RNA(guideRNA，gRNA)。
[0005] 細菌中的CRISPR-Cas系統(tǒng)極為多樣，而一個來自產(chǎn)膿鏈球菌（Streptococcus pyogenes)的由Cas9蛋白參與的系統(tǒng)被人們研宄的最為透徹。因此人們對它進行了改造， 將編碼Cas9蛋白的序列及其附屬元件共同制造成為一個單一的載體。在轉(zhuǎn)入宿主細胞后， 產(chǎn)生的人工構(gòu)建的gRNA就能指導(dǎo)Cas9蛋白切割宿主細胞特定的DNA序列，從而起到基因 編輯的作用。
[0006] 以CRISPR-Cas系統(tǒng)為基礎(chǔ)將有望開發(fā)出新型的更有效地用于HBV感染治療的方 法，該方法需要提供有效清除HBVcccDNA的gRNA靶點。本發(fā)明滿足了這一要求，提供了用 于該目的的gRNA靶點、gRNA和重組表達載體等。
【發(fā)明內(nèi)容】
[0007] 為了解決以上問題，本發(fā)明提供了靶向HBV的gRNA靶點，用于構(gòu)建包含或互補本 發(fā)明涉及的gRNA靶點的表達載體、重組載體和宿主細胞，以及可獲得用于獲得包含有由本 發(fā)明涉及的gRNA靶點獲得的治療藥物。
[0008] 本發(fā)明提供的gRNA靶點可靶向HBV，可破壞共價閉合環(huán)狀DNA并抑制HBV復(fù)制。 本發(fā)明提供的gRNA靶點是通過以下方法獲得的：選擇設(shè)計可靶向HBV的gRNA靶點序列，通 過設(shè)計合適的引物構(gòu)建gRNA，并克隆入表達載體獲得相應(yīng)的gRNA表達載體，將該載體分別 與HBV表達載體進行共轉(zhuǎn)染實驗，通過檢測HBV表面抗原水平及鑒定抑制特異性等分析篩 選獲得合適的gRNA靶點。
[0009] 本發(fā)明提供一種靶向HBV的導(dǎo)向RNA靶點序列，其選自以下序列之一：
[0010] (l)SEQIDNOs:l-15中任一個所述的序列；
[0011] (2)與⑴中序列具有至少70% (優(yōu)選至少80%、85%、90%、95%、99%或更高） 一致性的序列；
[0012] (3)在嚴格條件下或者高度嚴格條件下與（1)中序列能夠雜交的核苷酸序列；
[0013] (4)與⑴中的序列僅有1-3個（優(yōu)選1-2個，更優(yōu)選1個）核苷酸不同的序列； 以及
[0014] (5)與（1)-⑷中序列的片段或者互補序列。
[0015] 在一個具體方面，所述gRNA靶點序列可以靶向HBVA、B、C或者D型基因。
[0016]在本發(fā)明的一個實施方式中，gRNA靶點序列N18_2(l符合如下結(jié)構(gòu)：5'-Nx-NGG-3'， NGG中N表示A、G、C和T中的任一種，Nx中N表示A、G、C和T的任一種，x= 18-20。
[0017] 本發(fā)明還提供包含根據(jù)本發(fā)明的導(dǎo)向RNA靶點序列的核酸構(gòu)建體或載體如表達 載體。
[0018] 本發(fā)明還提供根據(jù)本發(fā)明的導(dǎo)向RNA靶點序列獲得的、能夠破壞共價閉合環(huán)狀 DNA或者抑制HBV復(fù)制或者降低HBV表面抗原的導(dǎo)向RNA。
[0019] 在一個實施方式中，本發(fā)明的gRNA依次由能夠與靶點序列互補結(jié)合的RNA片段和 骨架RNA片段連接而成，骨架RNA片段可與Cas核酸酶結(jié)合。具體地說，gRNA中能夠與靶 點序列互補結(jié)合的RNA片段為能與5' -Nx-NGG-3'中Nx(N18_2CI)片段互補結(jié)合的RNA片段。 優(yōu)選地，gRNA包含能夠與下列靶點序列結(jié)合的片段，其選自以下序列之一：
[0020] (l)SEQIDNOs:l-15中任一個所述的序列；
[0021] (2)與⑴中序列具有至少70% (優(yōu)選至少80%、85%、90%、95%、99%或更高） 一致性的序列；
[0022] (3)在嚴格條件下或者高度嚴格條件下與（1)中序列能夠雜交的核苷酸序列；
[0023] (4)與⑴中的序列僅有1-3個（優(yōu)選1-2個，更優(yōu)選1個）核苷酸不同的序列； 以及
[0024] (5)與（1)-⑷中序列的片段或者互補序列。
[0025] 在一個優(yōu)選的實施方式中，含有由本發(fā)明獲得的gRNA靶點序列的gRNA序列導(dǎo)入 肝細胞后可使細胞獲得抑制HBV復(fù)制和病毒基因表達的能力。
[0026] 本發(fā)明還提供可表達本發(fā)明的導(dǎo)向RNA的重組表達載體。
[0027] 在一個實施方式中，本發(fā)明的導(dǎo)向RNA的重組表達載體具有以下特征：包含了本 發(fā)明提供的導(dǎo)向RNA靶點序列的gRNA序列，這些gRNA序列與表達控制序列可操作地連接， 使得可在真核細胞（特別是哺乳動物細胞，如人細胞，優(yōu)選肝細胞和干細胞）中表達靶向 HBV的gRNA〇
[0028] 本發(fā)明的重組表達載體可以是質(zhì)粒載體或病毒載體。
[0029] 本發(fā)明還提供包含本發(fā)明的導(dǎo)向RNA靶點序列、或者本發(fā)明的核酸構(gòu)建體或載 體、或者本發(fā)明的導(dǎo)向RNA、或者本發(fā)明的重組表達載體的宿主細胞，包括原核細胞（如細 菌細胞、大腸桿菌細胞）和真核細胞（如真菌細胞、昆蟲細胞、植物細胞、動物細胞，特別是 哺乳動物細胞如人細胞，優(yōu)選肝細胞和干細胞）。
[0030] 本發(fā)明還涉及治療或者預(yù)防HBV感染或者HBV患者的藥物組合物，其包含本發(fā)明 提供的gRNA靶點序列獲得的導(dǎo)向RNA中的一種或多種、和/或包含所述導(dǎo)向RNA的重組表 達載體中的一種或多種，以及任選的藥物載體。
[0031] 本發(fā)明還涉及包含本發(fā)明提供的gRNA靶點序列獲得的導(dǎo)向RNA中的一種或多種、 和/或包含所述導(dǎo)向RNA的重組表達載體中的一種或多種在制備治療或者預(yù)防HBV感染或 者HBV患者的藥物中的用途。
[0032] 本發(fā)明還涉及包含本發(fā)明提供的gRNA靶點序列獲得的導(dǎo)向RNA中的一種或多種、 和/或包含所述導(dǎo)向RNA的重組表達載體中的一種或多種在制備破壞共價閉合環(huán)狀DNA或 者抑制HBV復(fù)制或者降低HBV表面抗原的藥物中的用途。
[0033] 本發(fā)明還涉及包含本發(fā)明提供的導(dǎo)向RNA靶點序列、或者本發(fā)明提供的gRNA靶點 序列獲得的核酸構(gòu)建體或載體/或者導(dǎo)向RNA/或者重組表達載體、或者本發(fā)明所述的宿主 細胞中的任一項在篩選抗HBV藥物中的應(yīng)用。
[0034] 本發(fā)明還提供抑制HBV復(fù)制的方法，包括將有效劑量的本發(fā)明提供的gRNA靶點序 列獲得的導(dǎo)向RNA中的一種或多種、和/或包含所述導(dǎo)向RNA的重組表達載體中的一種或 多種給藥至患者。
[0035] 本發(fā)明還提供抑制HBV復(fù)制的方法，包括以下步驟：
[0036] (1)將本發(fā)明提供的gRNA靶點序列獲得的導(dǎo)向RNA中的一種或多種、和/或包含 所述導(dǎo)向RNA的重組表達載體中的一種或多種導(dǎo)入宿主細胞或者生物體中；以及
[0037] (2)表達本發(fā)明提供的gRNA靶點序列獲得的導(dǎo)向RNA中的一種或多種