本發(fā)明屬于水稻基因工程技術領域。具體涉及水稻內源雙向表達啟動子的分離克隆及功能分析。

背景技術：

啟動子是啟動基因轉錄的一段DNA序列，作為轉錄水平上的重要調控元件，它能夠有效調控下游基因在特定時期、空間和信號刺激下的轉錄過程。隨著作物遺傳改良的進程和功能基因組研究的發(fā)展，越來越多的作物性狀受到關注，同時越來越多可用于性狀改良的候選基因得到鑒定，候選基因的高效應用必須依靠它們在特定部位、生育期或者信號刺激下的高效表達。因此，啟動子的多樣性在基因工程中受到迫切的需求。

迄今為止，越來越多的單向啟動子被克隆和鑒定，根據(jù)它們表達模式可分為組成型啟動子、組織特異型啟動子和誘導型啟動子(McElroy D,Zhang W,Cao J,Wu R.Isolation of an efficient actin promoter for use in rice transformation.The Plant Cell,1990,2:163-171；Cai M,Wei J,Li X,Xu C,Wang S.A rice promoter containing both novel positive and negative cis-elements for regulation of green tissue-specific gene expression in transgenic plants.Plant Biotechnol J,2007,5:664-674；Vijayan J,Devanna BN,Singh NK,Sharma TR.Cloning and functional validation of early inducible Magnaporthe oryzae responsive CYP76M7promoter from rice.Front Plant Sci,2015,6:371)。雙向啟動子泛指相鄰且轉錄方向相反呈“頭對頭結構”的基因對之間的序列，在基因工程中表現(xiàn)出更好的應用潛力(Trinklein ND et al.An abundance of bidirectional promoters in the human genome.Genome Res,2004,14:62-66；Yang S,Sleight SC,Sauro HM.Rationally designed bidirectional promoter improves the evolutionary stability of synthetic genetic circuits.Nucleic Acids Res,2013,41:e33-e33)。這一優(yōu)勢主要得益于雙向啟動子可以同時驅動兩個靶基因表達，在載體構建和基因聚合過程中更加方便省時(Kumar S et al.A combinatorial bidirectional and bicistronic approach for coordinated multi-gene expression in corn.Plant Mol Biol,2015,87:341-353)。而且，在導入多個外源基因的同時，往往需要使它們維持相同或相似的表達模式以達到對特定性狀進行改良的目的(Ha SH et al.Application of two bicistronic systems involving 2A and IRES sequences to the biosynthesis of carotenoids in rice endosperm.Plant Biotechnol J,2010,8:928-938；Ogo Y,Ozawa K,Ishimaru T,Murayama T,Takaiwa F.Transgenic rice seed synthesizing diverse flavonoids at high levels:a new platform for flavonoid production with associated health benefits.Plant Biotechnol J,2013,11:734-746)。然而，具有相同或相似表達模式的單向啟動子數(shù)量有限，重復使用可能造成生物體內基因表達的沉默，同時也在載體構建過程中造成時間和成本的更大消耗(Peremarti A et al.Promoter diversity in multigene transformation.Plant Mol Biol,2010,73:363-378)。由于很多雙向基因對存在共表達的現(xiàn)象，雙向啟動子5’和3’的表達模式在很多報道中是相似的(Huang Y,Xiao B,Xiong L.Characterization of a stress responsive proteinase inhibitor gene with positive effect in improving drought resistance in rice.Planta,2007,226:73-85；Chen W,Meaux JD,Lercher MJ.Co-expression of neighbouring genes in Arabidopsis:separating chromatin effects from direct interactions.BMC Genomics,2010,11:178；Didych D et al.Human PSENEN and U2AF1L4genes are concertedly regulated by a genuine bidirectional promoter.Gene,2013,515:34-41)。因此，雙向啟動子還能夠克服相同表達模式單向啟動子的缺乏問題。

由于啟動子并不像基因編碼區(qū)有產物可以限制其在進化過程中的變異，因此，除了保守的順式調控元件之外，啟動子的序列存在高度變異(Müller F,Demény MA,Tora L.New problems in RNA polymerase II transcription initiation:matching the diversity of core promoters with a variety of promoter recognition factors.J Biol Chem,2007,282:14685-14689)。所以，研究啟動子的保守性可以通過其調控的下游基因入手。早在2002年，Adachi等人就發(fā)現(xiàn)人類基因組中“頭對頭結構”的基因對普遍存在(Adachi N,Lieber MR.Bidirectional gene organization:a common architectural feature of the human genome.Cell,2002,109:807-809)。其后，Li等人通過系統(tǒng)，發(fā)現(xiàn)“頭對頭結構”的基因對在不同物種中存在較高的保守性(Li Y et al.Systematic analysis of head-to-head gene organization:evolutionary conservation and potential biological relevance.PLoS Comput Biol,2006,2:e74)。2012年，Xu等人通過“頭對頭結構”的基因對在不同物種間的結構保守性來研究雙向啟動子的保守問題(Xu C,Chen J,Shen B.The preservation of bidirectional promoter architecture in eukaryotes:what is the driving force？BMC Syst Biol,2012,6:S21)。

根據(jù)已有報道，雙向啟動子的鑒定方法可分為兩種，一種是利用生物信息學手段的鑒定方法，與之相對的則是利用實驗手段的鑒定方法。生物信息學鑒定方法不盡相同，本質上都是通過開發(fā)不同的語言模型預測啟動子中存在的轉錄調控區(qū)域、MOTIF的結合位點或者核小體缺失區(qū)域，篩選符合條件的雙向啟動子進行表達相關性和功能相關性分析(Wang Q et al.Searching for bidirectional promoters in Arabidopsis thaliana.BMC Bioinformatics,2009,10:S29；Claeys M,Storms V,Sun H,Michoel T,Marchal K.MotifSuite:workflow for probabilistic motif detection and assessment.Bioinformatics,2012,28:1931-1932；Zhang W et al.High-resolution mapping of open chromatin in the rice genome.Genome Res,2012,22:151-162)。而實驗鑒定方法則落腳于檢測啟動子驅動報告基因的表達模式這一常規(guī)的啟動子分析方法上面。一些研究是通過啟動子正反驅動同一個報告基因進行鑒定(Huang Y,Xiao B,Xiong L.Characterization of a stress responsive proteinase inhibitor gene with positive effect in improving drought resistance in rice.Planta,2007,226:73-85)， 而一些研究是通過啟動子同時驅動兩個報告基因進行鑒定(Léjard V,Rebours E,Meersseman C,Rocha D.Construction and validation of a novel dual reporter vector for studying mammalian bidirectional promoters.Plasmid,2014,74:1-8)，也有結合以上兩種方法同時鑒定的報道(Mishra RC,Grover A.Intergenic sequence between Arabidopsis caseinolytic protease B-cytoplasmic/heat shock protein100and choline kinase genes functions as a heat-inducible bidirectional promoter.Plant Physiol,2014,166:1646-1658)。通過實驗手段克隆的雙向啟動子，絕大多數(shù)都依附于其調控基因的研究。迄今為止，鮮有將生物信息學手段和實驗手段相結合，根據(jù)雙向啟動子的結構特點和表達模式進行規(guī)模化篩選和鑒定的報道。

水稻是我國主要的糧食作物。因此，水稻遺傳改良的重要性和必要性不言而喻。多基因的導入是其中很關鍵的一步。前文已詳細介紹雙向啟動子在多基因導入中的優(yōu)勢，所以水稻雙向啟動子的挖掘對于水稻遺傳改良是必不可少的。同時，水稻中完備的基因組信息(Goff SA et al.A draft sequence of the rice genome(Oryza sativa L.ssp.japonica).Science,2002,296:92-100；Yu J et al.A draft sequence of the rice genome(Oryza sativa L.ssp.indica).Science,2002,296:79-92；Pan Y et al.Comparative BAC-based physical mapping of Oryza sativa ssp.indica var.93-11and evaluation of the two rice reference sequence assemblies.Plant J,2014,77:795-805)及較為清楚的基因表達信息(Wang L et al.A dynamic gene expression atlas covering the entire life cycle of rice.Plant J,2010,61:752-766)也為雙向啟動子的篩選和鑒定提供了極大的便利。

技術實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于在于克服現(xiàn)有技術存在的缺陷，建立一個雙向啟動子的篩選、克隆及功能分析的完整方法，并為基因工程和分子育種提供高效的雙向啟動子資源。本發(fā)明結合MSU和RAP數(shù)據(jù)庫中的RNA-seq數(shù)據(jù)以及CREP數(shù)據(jù)庫中的表達譜芯片數(shù)據(jù)在水稻基因組中選取了候選雙向啟動子BIP1，并利用它同時驅動兩個報告基因綠色熒光蛋白基因(以下簡稱GFP基因)和β-葡糖醛酸酶基因(以下簡稱GUS基因)在水稻中表達。對轉基因水稻的GUS和GFP分析結果顯示，BIP1啟動子具有雙向表達活性。然后我們對其進行5’和3’缺失分析，鑒定出其雙向表達調控區(qū)段以及控制其5’和3’方向基本表達活性的區(qū)段。隨后，利用生物信息學手段分析了BIP1在禾本科植物中的保守性。本發(fā)明為水稻雙向啟動子的分離克隆及功能分析提供了一個成功的方法。

本發(fā)明的技術方案如下所述：

首先以MSU和RAP數(shù)據(jù)庫中的RNA-seq數(shù)據(jù)以及CREP數(shù)據(jù)庫中的表達譜芯片數(shù)據(jù)為基礎，根據(jù)雙向啟動子調控基因的位置信息和表達信息，選取了一個候選雙向啟動子BIP1，其核苷酸序列如序列表SEQ ID NO：1所示。通過設計特異引物，從水稻明恢63的基因組中擴增BIP1，并構建表達載體BIP1-DX2181。通過對轉基因水稻的GUS和GFP分析試驗，我們發(fā)現(xiàn)啟動子BIP1在兩個方向均呈現(xiàn)出組成型高效表達。然后對其進行5’和3’缺失分析，鑒定出其雙向表達調控區(qū)段R1以及控制其3’方向基本表達活性的區(qū)段R2和5’方向基本表達活性的區(qū)段R3。隨后，利用生物信息學手段分析了BIP1在禾本 科植物中的保守性。

本發(fā)明公開了雙向啟動子的篩選及分離克隆方法、轉化載體的構建過程、水稻遺傳轉化過程和轉化植物的GUS組織化學染色、GUS蛋白活性檢測、GFP組織學分析、GFP定量分析和雙向啟動子的保守性分析等方法。

本發(fā)明的具體步驟是：

首先以MSU和RAP數(shù)據(jù)庫中的RNA-seq數(shù)據(jù)以及CREP數(shù)據(jù)庫中的表達譜芯片數(shù)據(jù)為基礎，根據(jù)雙向啟動子調控基因的位置信息和表達信息，選取了一個候選雙向啟動子BIP1，其核苷酸序列如序列表SEQ ID NO：1所示。利用PCR法，以明恢63基因組DNA為模板，通過特異引物(表1)擴增BIP1。PCR擴增得到的BIP1經過TA克隆(購自Promega公司)后利用SP6和T7引物測序。經過測序驗證的克隆通過Pst I單酶切將BIP1導入載體DX2181(載體構建圖及多克隆位點等信息見圖2)，得到重組的表達載體BIP1-DX2181(見圖3)。將重組的表達載體BIP1-DX2181通過電轉化法導入農桿菌菌株EHA105。

將水稻品種中花11(來源于中國農業(yè)科學院作物科學研究所)的成熟種子消毒后誘導胚性愈傷組織。將含有表達載體BIP1-DX2181的農桿菌菌株EHA105與胚性愈傷組織進行共培養(yǎng)后，在含有50mg/L潮霉素的篩選培養(yǎng)基上進行抗性愈傷組織的篩選，經過兩次篩選之后，挑取抗性愈傷轉入分化培養(yǎng)基上進行分化，當分化的小苗長到2-3cm時，切掉原生根，放到生根培養(yǎng)基上進行生根，當新根生長到2cm左右時，煉苗后移栽到溫室。這些再生小苗即為T₀代轉基因苗。

獲得轉基因植株后，通過GUS組織化學染色、GUS蛋白活性檢測、GFP組織學分析及GFP定量分析，考察BIP1在水稻中的表達模式和表達強度(見圖4、5)。檢測結果表明：啟動子BIP1在水稻中呈現(xiàn)出雙向表達模式，且兩個方向均為組成型高效表達。

設計特異引物(表1)，用PCR法獲得在BIP1的5’端和3’端缺失的不同長度的啟動子(圖6)，并分別構建到載體DX2181(來源：澳大利亞CAMBIA實驗室)上。以同樣的方法轉化水稻品種中花11。獲得轉基因植株后，通過GUS組織化學染色、GUS蛋白活性檢測、GFP組織學分析及GFP定量分析(圖7、8)，鑒定出其雙向表達調控區(qū)段R1以及控制其3’方向基本表達活性的區(qū)段R2和5’方向基本表達活性的區(qū)段R3。

隨后，利用生物信息學手段分析發(fā)現(xiàn)：BIP1在六個禾本科植物(水稻、高粱、小米、二穗短柄草、玉米和小麥)中的水稻、高粱、二穗短柄草和玉米中均呈現(xiàn)出保守性。

本發(fā)明的優(yōu)點在于：

(1)本發(fā)明結合生物信息學方法和實驗手段，根據(jù)雙向啟動子調控基因的位置信息和表達信息，建立了一個雙向啟動子的篩選、克隆及功能分析的完整方法。

(2)本發(fā)明獲得了一個在水稻中組成型高強度表達的雙向啟動子BIP1，為基因工程和分子育種提供了高效的雙向啟動子資源。

附圖說明

序列表SEQ ID NO：1是本發(fā)明中雙向啟動子BIP1的核苷酸序列；序列長度為2237bp。

序列表SEQ ID NO：2是本發(fā)明中BIP1截短后的啟動子BIP1-1F2R的核苷酸序列；序列長度為1240bp。 序列表SEQ ID NO：3是本發(fā)明中BIP1截短后的啟動子BIP1-1F3R的核苷酸序列；序列長度為1099bp。序列表SEQ ID NO：4是本發(fā)明中BIP1截短后的啟動子BIP1-2F1R的核苷酸序列；序列長度為1540bp。序列表SEQ ID NO：5是本發(fā)明中BIP1截短后的啟動子BIP1-2F2R的核苷酸序列；序列長度為543bp。

圖1：本發(fā)明的總體技術路線圖。

圖2：是DX2181載體結構示意圖，本發(fā)明利用其骨架構建轉化載體。

圖3：是本發(fā)明構建的轉化載體BIP1-DX2181結構示意圖。該載體是在DX2181的基礎上改造而來，將啟動子BIP1插入質粒DX2181的多克隆位點構建而成。

圖4：組織學分析BIP1驅動GUS基因和GFP基因在水稻不同組織中的表達情況。

圖5：由BIP1驅動GUS基因和GFP基因的轉化植株的不同組織中GUS蛋白活性檢測和GFP定量分析結果。GFP relative expression level代表GFP的相對表達量；GUS activity(pMol 4-MU/min/mg protein)代表GUS酶活。

圖6：是本發(fā)明對BIP1進行5’和3’缺失分析的示意圖。

圖7：組織學分析不同BIP1缺失啟動子驅動GUS基因和GFP基因在水稻不同組織中的表達情況。

圖8：由不同BIP1缺失啟動子驅動GUS基因和GFP基因分別在轉化植株各組織或器官中GUS蛋白活性檢測和GFP定量分析結果。附圖標記說明：圖8中A圖顯示葉片的結果；圖8中B圖顯示的是葉鞘的結果；圖8中C圖顯示的是穗的結果；圖8中D圖顯示的是莖桿的結果；圖8中E圖顯示的是種子中的結果；圖8中F圖顯示的是根的結果。GFP relative expression level代表GFP的相對表達量；GUS activity(pMol4-MU/min/mg protein)代表GUS酶活。

具體實施方式

實施例1：植物表達載體的構建

如無特別說明，本說明書中所列參考方法及相應分子生物學常規(guī)操作，參考：【J.薩姆布魯克等，《分子克隆實驗指南(第二版)》，中譯本，科學出版社，北京，1996版】的相關信息。

本發(fā)明首先以MSU和RAP數(shù)據(jù)庫中的RNA-seq數(shù)據(jù)以及CREP數(shù)據(jù)庫中的表達譜芯片數(shù)據(jù)來選取候選的雙向啟動子。選取原則基于：1、符合相鄰且轉錄方向相反呈“頭對頭結構”的基因對；2、RNA-seq數(shù)據(jù)中，基因對的最大表達數(shù)值同時高于10；表達譜芯片數(shù)據(jù)中，基因對的最大表達數(shù)值同時高于5000；3、基因對在95個樣品的RNA-seq數(shù)據(jù)中的表達相關性高于0.4。依據(jù)以上原則選取了一組基因對，并分離它們的基因間區(qū)，即為候選雙向啟動子。將其命名為BIP1，其核苷酸序列如序列表SEQ ID NO：1所示。利用PCR法，以明恢63基因組DNA為模板，通過特異引物(表1)擴增BIP1。PCR擴增得到的BIP1經過TA克隆(Promega公司)后利用SP6和T7引物測序。經過測序驗證的克隆通過Pst I單酶切將BIP1導入載體DX2181(載體圖及多克隆位點等信息見圖2)，得到重組的表達載體BIP1-DX2181(見圖3)。將表達載體BIP1-DX2181通過電轉化法導入農桿菌菌株EHA105，將轉化后的農桿菌菌株EHA105菌株于-70℃下保存待用。

表1本發(fā)明中使用的引物序列

表1的說明：^a下劃線序列表示酶切位點。

實施例2：農桿菌介導的遺傳轉化

農桿菌介導的遺傳轉化方法主要參照華中農業(yè)大學作物遺傳改良國家重點實驗室發(fā)表的“農桿菌介導的遺傳轉化操作手冊”所示的方法(林擁軍等，2002)。轉化受體為水稻品種中花11(為常規(guī)品種，來源于中國農業(yè)科學院作物科學研究所)的成熟種子所誘導產生的胚性愈傷組織。經過預培養(yǎng)、侵染、共培養(yǎng)、篩選得到具有潮霉素抗性的愈傷，再經過分化、生根、練苗和移栽，得到轉基因植株。本發(fā)明的遺傳轉化的主要步驟、培養(yǎng)基及其配制的方法如下所述：

(1)農桿菌介導的遺傳轉化步驟

1)愈傷誘導

a.將成熟的中花11水稻種子去殼，然后依次用70％的乙醇處理1分鐘，0.15％氯化汞(HgCl₂)種子表面消毒15分鐘；

b.用滅菌水洗種子4-5次；

c.將種子放在誘導培養(yǎng)基上；

d.將接種后的培養(yǎng)基置于黑暗處培養(yǎng)4周，溫度25±1℃。

2)愈傷繼代

挑選亮黃色、緊實且相對干燥的胚性愈傷，放于繼代培養(yǎng)基上黑暗下培養(yǎng)2周，溫度25±1℃。

3)預培養(yǎng)

挑選緊實且相對干燥的胚性愈傷，放于預培養(yǎng)基上黑暗下培養(yǎng)2周，溫度25±1℃。

4)農桿菌培養(yǎng)

a.在帶有對應抗性選擇的LA培養(yǎng)基上預培養(yǎng)農桿菌EHA105(該菌株來自CAMBIA公司商業(yè)化的農桿菌菌株)兩天，溫度28℃；

b.將農桿菌轉移至懸浮培養(yǎng)基里，28℃搖床上培養(yǎng)2-3小時。

5)農桿菌侵染

a.將預培養(yǎng)的愈傷轉移至滅好菌的瓶子內；

b.調節(jié)農桿菌的懸浮液至OD₆₀₀ 0.8-1.0；

c.將愈傷在農桿菌懸浮液中浸泡30分鐘；

d.轉移愈傷至滅菌好的濾紙上吸干；然后放在共培養(yǎng)基上培養(yǎng)3天，溫度19-20℃。

6)愈傷洗滌和選擇培養(yǎng)

a.滅菌水洗滌愈傷至看不見農桿菌；

b.浸泡在含400mg/L羧芐青霉素(CN)的滅菌水中30分鐘；

c.轉移愈傷至滅菌好的濾紙上吸干；

d.轉移愈傷至選擇培養(yǎng)基上選擇培養(yǎng)2-3次，每次2周。

7)分化

將生長旺盛的抗性愈傷轉入分化培養(yǎng)基中，放置于光照培養(yǎng)室中進行光照培養(yǎng)至分化出再生小苗。

8)生根

待再生小苗的芽長至2-3cm高時即可進行生根。用剪刀和鑷子將再生植株在分化培養(yǎng)基上長出的根清除干凈，將再生植株芽的下部插入生根培養(yǎng)基中，放置于光照培養(yǎng)室培養(yǎng)直至長出白色的新根。

9)煉苗及移栽

當新根生長到2cm左右時，可進行煉苗：將生根培養(yǎng)基的封口膜揭掉，加入適量自來水，在光照培養(yǎng)室繼續(xù)培養(yǎng)3天。移栽：洗掉根上的殘留培養(yǎng)基，將具有良好根系的幼苗轉入溫室，同時在最初的幾天保持水分濕潤。

(2)主要溶液配方

1)N₆培養(yǎng)基大量元素母液(按照10倍濃縮液(10X)配制)：

將上述試劑逐一溶解，然后室溫下用蒸餾水定容至1000ml。

2)N6培養(yǎng)基微量元素母液(按照100倍濃縮液(100X)配制：

將上述試劑在室溫下溶解并用蒸餾水定容至1000ml。

3)鐵鹽(Fe_2-EDTA)貯存液(按照100X濃縮液配制)：

將3.73g乙二胺四乙酸二鈉(Na₂EDTA·2H₂O)和2.78g FeSO₄·7H₂O分別溶解，混合并用蒸餾水定容至1000ml，至70℃溫浴2小時，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

4)維生素貯存液(按照100X濃縮液配制)：

加蒸餾水定容至1000ml，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

5)MS培養(yǎng)基大量元素母液(按照10X濃縮液配制)：

將上述試劑在室溫下溶解，并用蒸餾水定容至1000ml。

6)MS培養(yǎng)基微量元素母液(按照100X濃縮液配制)：

將上述試劑在室溫下溶解，并用蒸餾水定容至1000ml。

7)2,4-D貯存液(1mg/ml)的配制：

稱取2,4-D 100mg，用1ml 1N氫氧化鉀溶解5分鐘，然后加10ml蒸餾水溶解完全后定容至100ml，于室溫下保存。

8)6-BA貯存液(1mg/ml)的配制：

稱取6-BA 100mg，用1ml 1N氫氧化鉀溶解5分鐘，然后加10ml蒸餾水溶解完全后定容至100ml，室溫保存。

9)萘乙酸(NAA)貯存液(1mg/ml)的配制：

稱取NAA 100mg，用1ml 1N氫氧化鉀溶解5分鐘，然后加10ml蒸餾水溶解完全后定容至100ml，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

10)吲哚乙酸(IAA)貯存液(1mg/ml)的配制：

稱取IAA 100mg，用1ml 1N氫氧化鉀溶解5分鐘，然后加10ml蒸餾水溶解完全后定容至100ml，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

11)葡萄糖貯存液(0.5g/ml)的配制：

稱取葡萄糖125g，然后用蒸餾水溶解定容至250ml，滅菌后4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

12)AS貯存液的配制：

稱取AS 0.392g，加入DMSO 10ml溶解，分裝至1.5ml離心管內，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

13)1N氫氧化鉀貯存液配制：

稱取氫氧化鉀5.6g，用蒸餾水溶解定容至100ml，室溫保存?zhèn)溆谩?/p>

(3)用于水稻遺傳轉化的培養(yǎng)基配方

1)誘導培養(yǎng)基

加蒸餾水至900ml，1N氫氧化鉀調節(jié)pH值到5.9，煮沸并定容至1000ml，分裝到50ml三角瓶(25ml/瓶)，封口后按常規(guī)方法滅菌(例如121℃下滅菌25分鐘，下述的培養(yǎng)基滅菌方法與本培養(yǎng)基的滅菌方法相同)。

2)繼代培養(yǎng)基

加蒸餾水至900ml，1N氫氧化鉀調節(jié)pH值到5.9，煮沸并定容至1000ml，分裝到50ml三角瓶(25ml/瓶)，封口，按上述方法滅菌。

3)預培養(yǎng)基

加蒸餾水至250ml，1N氫氧化鉀調節(jié)pH值到5.6，封口，按上述方法滅菌。

使用前加熱溶解培養(yǎng)基并加入5ml葡萄糖貯存液和250ul AS貯存液，分裝倒入培養(yǎng)皿中(25ml/皿)。

4)共培養(yǎng)基

加蒸餾水至250ml，1N氫氧化鉀調節(jié)pH值到5.6，封口，按上述方法滅菌。

使用前加熱溶解培養(yǎng)基并加入5ml葡萄糖貯存液和250ul AS貯存液，分裝倒入培養(yǎng)皿中(25ml/每皿)。

5)懸浮培養(yǎng)基

加蒸餾水至100ml，調節(jié)pH值到5.4，分裝到兩個100ml的三角瓶中，封口，按上述方法滅菌。

使用前加入1ml無菌葡萄糖貯存液和100ul AS貯存液。

6)選擇培養(yǎng)基

加蒸餾水至250ml，調節(jié)pH值到6.0，封口，按上述方法滅菌。

使用前溶解培養(yǎng)基，加入250ul HN(50mg/ml)和400ul CN(250mg/ml)分裝倒入培養(yǎng)皿中(25ml/皿)。(注：第一次選擇培養(yǎng)基羧芐青霉素濃度為400mg/l，第二次及以后選擇培養(yǎng)基羧芐青霉素濃度為250mg/l)。

7)預分化培養(yǎng)基

加蒸餾水至250ml，1N氫氧化鉀調節(jié)pH值到5.9，封口，按上述方法滅菌。

使用前溶解培養(yǎng)基，250ul HN(50mg/ml)250ul CN(250mg/ml)，分裝倒入培養(yǎng)皿中(25ml/皿)。

8)分化培養(yǎng)基

加蒸餾水至900ml，1N氫氧化鉀調節(jié)pH值到6.0。

煮沸并用蒸餾水定容至1000ml，分裝到50ml三角瓶(50ml/瓶)，封口，按上述方法滅菌。

9)生根培養(yǎng)基

加蒸餾水至900ml，用1N氫氧化鉀調節(jié)pH值到5.8。

煮沸并用蒸餾水定容至1000ml，分裝到生根管中(25ml/管)，封口，按上述方法滅菌。

實施例3：利用PCR法檢測轉基因陽性植株

將轉化苗移入溫室后，待其返青，然后分單株取1-2cm幼嫩葉片，抽提其基因組DNA，以基因組DNA為模板，利用PCR法檢測陽性植株。擴增片段為報告基因gus的部分片段，片段大小為699bp。引物序列為GUS-F:GGGCGAACAGTTCCTGATTA，GUS-R:AACGTATCCACGCCGTATTC。PCR反應條件：94℃ 5min，94℃50sec，57℃40sec，72℃50sec，30個循環(huán)，72℃7min。PCR產物經0.8％瓊脂糖膠電泳檢測。對所有T₀代植株進行PCR檢測，根據(jù)檢測結果剔除假陽性的轉化植株。

利用小量葉片基因組DNA的提取方法提取基因組DNA:取適量幼嫩葉片，加800μl 1.5×CTAB(1.5×CTAB配方：1.5％CTAB、75mM Tris-HCl、15mM EDTA及1.05M NaCl)研磨，轉入1.5ml離心管中；65℃水浴30min；加入600μL氯仿/異戊醇(體積比為24:1)上下顛倒數(shù)次(約15min)，下層液相呈深綠色為止；室溫下12000r/min離心10min；取500μL上清于一新1.5ml離心管，加入預冷的95％乙醇1mL，混勻后置-20℃，30min；室溫下12000r/min離心10min，去上清，用75％乙醇浸洗沉淀，自然干燥；加入100μL ddH₂O溶解，備用。

實施例4：啟動子BIP1在水稻各組織中的表達模式

取表達載體BIP1-DX2181陽性轉化植株(參考實施例3)的不同組織(包括：根、葉片、葉鞘、莖桿、穗及種子)切成約0.5CM長度的適當大小，浸入約200μl的GUS染液，37℃過夜，然后用75％酒精脫色，觀察是否有藍色出現(xiàn)。染色液的配方參照Jefferson等報道的方法(Jefferson,R.A.,Kavanagh,T.A.and Bevan,M.W.GUS fusions:β-glucuronidase as a sensitive and versatile gene fusion marker in higher plants.EMBO J.1987,6,3901-3907)。

表達載體BIP1-DX2181陽性轉化植株的GFP組織學分析通過熒光顯微鏡進行。取T₀代陽性轉化植株的各個組織(葉片、葉鞘、莖桿、根、穗及種子)在熒光顯微鏡(Leica MZ16F)的GFP2檔下觀察，并利用Leica Application Suite software拍照。

檢測結果顯示：本發(fā)明分離的啟動子BIP1在水稻中呈現(xiàn)出雙向表達模式，且兩個方向均為組成型高效表達(見圖4)。

實施例5：啟動子BIP1在水稻不同組織中的表達強度分析

取表達載體BIP1-DX2181陽性轉化植株的不同組織(包括：根、葉片、葉鞘、莖桿、穗及種子)并抽提總蛋白，然后測定其GUS活性?？偟鞍椎某樘峒皾舛葴y定參考Bradford的方法(Bradford,M.M.A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding.Anal.Biochem.1976,72,248-254)，GUS活性測定參考Xu的方法(Xu,L.et al.Isolation of the endosperm-specific LPAAT gene promoter from coconut(Cocos nucifera L.)and its functional analysis in transgenic rice plants.Plant Cell Rep.2010,29,1061-1068)。

BIP1-DX2181陽性轉化植株不同組織的GFP表達量利用quantitative real-time PCR(qRT-PCR)進行檢測。轉基因植株不同組織的總RNA抽提方法和具體步驟如下(采用北京全式金生物科技有限公司的TransZol，具體操作步驟參考其說明書)。進行質量分析和濃度檢測后，使用invitrogen公司的SSIII試劑盒進行反轉錄合成用于real-time PCR的cDNA第一鏈。qRT-PCR使用寶生物工程大連有限公司的SYBR Green Master Mix試劑盒。所用引物序列為：目的基因：GFP-F:5’-ATCCGCCACAACATCGAGGA-3’；GFP-R:5’-TCGTCCATGCCGAGAGTGAT-3’；內參基因：GAPDH-F:5’-CTGCAACTCAGAAGACCGTTG-3’； GAPDH-R:5’-CCTGTTGTCACCCTGGAAGTC-3’。反應在ABI 7500PCR儀上進行。實驗結果分析方法采用2^-ΔΔC_T法。

BIP1-DX2181轉基因植株的GUS及GFP報告基因定量檢測的結果(圖5)顯示，啟動子BIP1的3’方向的表達活性在種子中最高，其GUS活性達到17806±2108pmol 4-MU/min/mg protein；其次是根，GUS活性為14769±1782pmol 4-MU/min/mg protein；接下來是莖桿，葉鞘，穗和葉片，GUS活性分別為9825±1510，8681±834，7380±895和6092±875pmol 4-MU/min/mg protein。啟動子BIP1的5’方向的表達活性在穗中最高，是葉片中表達活性的3.4倍；而根，葉鞘，莖桿和種子中GFP的表達量分別是葉片中的2.8，2.5，1.4和1.1倍。

實施例6：啟動子BIP1的5’和3’缺失分析

為了尋找雙向啟動子BIP1的雙向表達調控區(qū)域，對它進行5’和3’缺失分析。以測序驗證的TA-BIP1為模板，利用PCR法，設計特異引物(表1)來構建BIP1的一系列5’和3’缺失啟動子(圖6)。載體構建、水稻遺傳轉化及轉基因植株的GUS和GFP相關分析方法均與上述實施例相同。不同BIP1缺失啟動子驅動GUS基因和GFP基因在水稻不同組織中的表達情況見圖7。不同BIP1缺失啟動子驅動GUS基因和GFP基因的轉化植株的不同組織中GUS蛋白活性檢測和GFP定量分析結果見圖8。

結果顯示，BIP1-1F2R轉基因植株各組織的GUS活性遠低于BIP1轉基因植株，尤其是根，莖桿，種子和穗的GUS活性低于BIP1轉基因植株相應組織的10％。由此可以推斷，Region 1能夠大幅度提升BIP1的3’方向的轉錄活性。與此同時，BIP1-1F2R轉基因植株各組織的GFP表達量也明顯低于BIP1轉基因植株。以上結果表明，Region 1是一個雙向轉錄增強區(qū)段。進一步截短BIP1的3’端導致BIP1-1F3R轉基因植株的GUS活性完全喪失，而BIP1-1F3R轉基因植株各組織的GFP表達量與BIP1-1F2R轉基因植株相比并無明顯降低。該結果表明，Region 2調控BIP1的3’方向的基本轉錄活性，而與5’方向的轉錄活性無關。BIP1-2F1R和BIP1-2F2R轉基因植株均檢測不到GFP表達，說明Region 3的缺失導致BIP1的5’方向的轉錄活性完全喪失。BIP1-2F1R轉基因植株的GUS分析結果顯示，Region 3的缺失對于BIP1在大多數(shù)組織中3’方向的表達活性影響微弱，但對啟動子在根中3’方向的表達活性卻影響很大，BIP1-2F1R轉基因植株根的GUS活性明顯低于BIP1轉基因植株。上述結果表明，Region 3調控BIP1的5’方向的基本轉錄活性，同時，它還能夠正向調控BIP1的3’方向在根中的轉錄活性。

實施例7：啟動子BIP1在禾本科植物中的保守性分析

由于啟動子并不像基因編碼區(qū)有產物可以限制其在進化過程中的變異，因此，除了保守的順式調控元件之外，啟動子的序列存在高度變異。故研究啟動子的保守性可以通過其調控的下游基因入手。本發(fā)明利用Ensembl Plants數(shù)據(jù)庫(http://plants.ensembl.org/index.html)中的信息分析四組基因對在禾本科植物中“頭對頭結構”的保守性。若一組基因對在另一物種中均存在同源基因，且同源基因的排列方式仍然呈現(xiàn)“頭對頭結構”，則將調控它們的啟動子視為保守的雙向啟動子(c-BIP)；反之，若同源基因的排列方式不呈現(xiàn)“頭對頭結構”，則將調控它們的啟動子視為非保守的雙向啟動子(n-BIP)。

表2啟動子BIP1在不同禾本科植物間的保守性分析

表2的結果顯示，本發(fā)明克隆的啟動子BIP1在六個禾本科植物中的4個物種：水稻、高粱、二穗短柄草和玉米中均為保守，表明它調控的兩個基因在進化過程中相對保守，在多數(shù)物種中均維持了這樣的“頭對頭結構”。同時，受到雙向啟動子BIP1調控的兩個基因，LOC_Os02g42314和LOC_Os02g42320的功能注釋分別為泛素偶聯(lián)酶和蛋白酶，都屬于保守的結構基因。而且，它們在功能上也存在一定的相關性，進一步佐證其共進化的關系。

本發(fā)明獲得了一個在水稻中組成型高強度表達的雙向啟動子BIP1，為基因工程和分子育種提供了高效的雙向啟動子資源。同時，本發(fā)明結合生物信息學方法和實驗手段，根據(jù)雙向啟動子調控基因的位置信息和表達信息，建立了一個雙向啟動子的篩選、克隆及功能分析的完整方法。