本發(fā)明涉及一種檢測北美H3N1亞型豬流感病毒的引物組及其應(yīng)用。

背景技術(shù)：

A型流感病毒可以感染不同物種，并在不同宿主間傳播，尤其是人類和豬。豬作為流感病毒的“混合器”，可以同時(shí)被禽源、人源流感病毒感染，產(chǎn)生具有新的抗原性、遺傳特性、致病特性的基因重排病毒，進(jìn)而使病毒可能突破種間障礙、擴(kuò)大感染譜系，危害動物及人類健康。

豬流感病毒主要包括H1與H3兩種亞型。1998年，美國首次報(bào)道H3N2亞型豬流感病毒，之后出現(xiàn)由經(jīng)典H1N1病毒和H3N2亞型豬流感病毒基因片段重排而成的H1N1亞型豬流感病毒和H1N2亞型豬流感病毒。2004年，在美國有咳嗽癥狀豬群中首次鑒定出新遺傳類型-H3N1亞型豬流感病毒，該亞型病毒主要是由H3N2亞型豬流感病毒和H1N1亞型豬流感病毒重排產(chǎn)生。

H3N1亞型豬流感病毒，又稱H3N1豬流感病毒。H3N1亞型豬流感病毒影響豬的發(fā)育，延緩豬的生長及出欄時(shí)間，給養(yǎng)殖業(yè)帶來重大經(jīng)濟(jì)損失。并且，H3N1亞型豬流感病毒感染豬后可引起肺臟損傷，并通過鼻腔排毒，這表明該病毒具有由豬傳播給人類的潛在性。因此，加強(qiáng)對H3N1亞型豬流感病毒的監(jiān)測和控制對于有效阻止病毒種間傳播有重要意義。

目前中國不存在北美H3N1亞型豬流感病毒，而且隨著國際貿(mào)易的增加，北美H3N1亞型豬流感病毒傳入我國風(fēng)險(xiǎn)加大，因此建立一種快速有效的檢測北美H3N1亞型豬流感病毒的方法，有助于實(shí)現(xiàn)對該疾病的實(shí)時(shí)監(jiān)測，對于外來疫情的防控有重大意義。

傳統(tǒng)的流感病毒檢測方法為采用雞胚進(jìn)行病毒的分離培養(yǎng)(需時(shí)2-3天)，然后采用血凝抑制試驗(yàn)進(jìn)行流感病毒亞型及分支的鑒定(需時(shí)1天)。一方面耗時(shí)很長，另一方面對于外來疫病，由于缺乏相應(yīng)血清，不能采用血凝抑制試驗(yàn)來鑒定。收集有血凝性的雞胚尿囊液，提取RNA，運(yùn)用流感病毒基因的通用引物進(jìn)行全長擴(kuò)增并克隆測序，進(jìn)行外來流感病毒亞型鑒定(需時(shí)2天)，這種檢測方法費(fèi)時(shí)、費(fèi)力而且特異性差，不能做出快速及時(shí)而準(zhǔn)確的診斷。因此，臨床上，迫切需要一種能快速準(zhǔn)確診斷北美H3N1亞型豬流感病毒的方法。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是提供一種檢測北美H3N1亞型豬流感病毒的引物組及其應(yīng)用。

本發(fā)明首先提供了一種引物組，包括引物對甲和引物對乙；所述引物對甲由引物F1和引物R1組成；所述引物對乙由引物F2和引物R2組成。

所述引物F1為如下(a1)或(a2)；

(a1)序列表的序列1所示的單鏈DNA分子；

(a2)將序列1經(jīng)過一個(gè)或幾個(gè)核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且與序列1具有相同功能的DNA分子；

所述引物R1為如下(a3)或(a4)；

(a3)序列表的序列2所示的單鏈DNA分子；

(a4)將序列2經(jīng)過一個(gè)或幾個(gè)核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且與序列2具有相同功能的DNA分子。

所述引物F2為如下(b1)或(b2)；

(b1)序列表的序列3所示的單鏈DNA分子；

(b2)將序列3經(jīng)過一個(gè)或幾個(gè)核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且與序列3具有相同功能的DNA分子；

所述引物R2為如下(b3)或(b4)；

(b3)序列表的序列4所示的單鏈DNA分子；

(b4)將序列4經(jīng)過一個(gè)或幾個(gè)核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且與序列4具有相同功能的DNA分子。

本發(fā)明還保護(hù)一種特異引物對，即所述引物對乙。

所述引物組或所述特異引物對的用途為如下(c1)或(c2)：(c1)輔助鑒定北美H3N1亞型豬流感病毒；(c2)輔助鑒定待測樣本中是否含有北美H3N1亞型豬流感病毒。

本發(fā)明還保護(hù)所述引物組或所述特異引物對在制備試劑盒中的應(yīng)用；所述試劑盒的用途為如下(c1)或(c2)：(c1)輔助鑒定北美H3N1亞型豬流感病毒；(c2)輔助鑒定待測樣本中是否含有北美H3N1亞型豬流感病毒。

本發(fā)明還保護(hù)一種試劑盒，包括所述引物組或所述特異引物對；所述試劑盒的用途為如下(c1)或(c2)：(c1)輔助鑒定北美H3N1亞型豬流感病毒；(c2)輔助鑒定待測樣本中是否含有北美H3N1亞型豬流感病毒。

所述試劑盒還包括標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)粒。具體來說，所述試劑盒包括標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)粒甲和/或標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)粒乙。所述標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)粒甲為具有序列表的序列5所示DNA分子的質(zhì)粒。所述標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)粒甲為具有序列表的序列5第409-840位核苷酸所示DNA分子的質(zhì)粒。所述標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)粒甲為將序列表的序列5所示DNA分子插入pMD18-T載體得到的重組質(zhì)粒。所述標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)粒甲為將序列表的序列5第409-840位核苷酸所示DNA分子插入pMD18-T載體得到的重組質(zhì)粒。所述標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)粒乙為具有序列表的序列6所示DNA分子的質(zhì)粒。所述標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)粒乙為具有序列表的序列6第546-1155位核苷酸所示DNA分子的質(zhì)粒。所述標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)粒乙為將序列表的序列6所示DNA分子插入pMD18-T載體得到的重組質(zhì)粒。所述標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)粒乙為將序列表的序列6第546-1155位核苷酸所示DNA分子插入pMD18-T載體得到的重組質(zhì)粒。

本發(fā)明還保護(hù)用于檢測DNA分子甲的物質(zhì)和用于檢測DNA分子乙的物質(zhì)在制備試劑盒中的應(yīng)用；所述DNA分子甲為北美H3N1亞型豬流感病毒cDNA中所述引物對甲的靶序列；所述DNA分子乙為北美H3N1亞型豬流感病毒cDNA中所述引物對乙的靶序列；所述試劑盒的用途為如下(c1)或(c2)：(c1)輔助鑒定北美H3N1亞型豬流感病毒；(c2)輔助鑒定待測樣本中是否含有北美H3N1亞型豬流感病毒。所述DNA分子甲具體如序列表的序列5第409-840位核苷酸所示。所述DNA分子乙具體如序列6第546-1155位核苷酸所示。

本發(fā)明還保護(hù)用于檢測以上任一所述DNA分子乙的物質(zhì)在制備試劑盒中的應(yīng)用；所述試劑盒的用途為如下(c1)或(c2)：(c1)輔助鑒定北美H3N1亞型豬流感病毒；(c2)輔助鑒定待測樣本中是否含有北美H3N1亞型豬流感病毒。

本發(fā)明還保護(hù)一種輔助鑒定北美H3N1亞型豬流感病毒的方法，包括如下步驟：以待測病毒的cDNA為模板，分別采用所述引物對甲和所述引物對乙進(jìn)行PCR擴(kuò)增，如果均得到PCR擴(kuò)增產(chǎn)物(采用所述引物對甲時(shí)，具體可為400-500bp的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，更具體可為432bp的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物；采用所述引物對乙時(shí)，具體可為600-700bp的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，更具體可為610bp的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物)、待測病毒為候選的北美H3N1亞型豬流感病毒，如果不滿足上述條件、待測病毒為候選的非北美H3N1亞型豬流感病毒。

本發(fā)明還保護(hù)一種輔助鑒定待測樣本中是否含有北美H3N1亞型豬流感病毒的方法，包括如下步驟：以待測樣本的cDNA為模板，分別采用所述引物對甲和所述引物對乙進(jìn)行PCR擴(kuò)增，如果均得到PCR擴(kuò)增產(chǎn)物(采用所述引物對甲時(shí)，具體可為400-500bp的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，更具體可為432bp的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物；采用所述引物對乙時(shí)，具體可為600-700bp的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，更具體可為610bp的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物)、待測樣本疑似含有北美H3N1亞型豬流感病毒，如果不滿足上述條件、待測樣本疑似不含有北美H3N1亞型豬流感病毒。

本發(fā)明還保護(hù)一種輔助鑒定北美H3N1亞型豬流感病毒的方法，包括如下步驟：以待測病毒的cDNA為模板，采用所述引物對乙進(jìn)行PCR擴(kuò)增，如果得到PCR擴(kuò)增產(chǎn)物(具體可為600-700bp的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，更具體可為610bp的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物)、待測病毒為候選的北美H3N1亞型豬流感病毒，如果沒有得到PCR擴(kuò)增產(chǎn)物、待測病毒為候選的非北美H3N1亞型豬流感病毒。

本發(fā)明還保護(hù)一種輔助鑒定待測樣本中是否含有北美H3N1亞型豬流感病毒的方法，包括如下步驟：以待測樣本的cDNA為模板，采用所述引物對乙進(jìn)行PCR擴(kuò)增，如果得到PCR擴(kuò)增產(chǎn)物(具體可為600-700bp的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，更具體可為610bp的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物)、待測樣本疑似含有北美H3N1亞型豬流感病毒，如果沒有得到PCR擴(kuò)增產(chǎn)物、待測樣本疑似不含有北美H3N1亞型豬流感病毒。

以上任一所述方法中，可采用電泳檢測PCR擴(kuò)增產(chǎn)物。所述電泳的凝膠中，預(yù)先加入GelRed核酸染料。所述電泳具體可為2％瓊脂糖凝膠電泳。

以上任一所述方法中，采用所述引物對甲時(shí)，PCR擴(kuò)增的反應(yīng)程序具體可為：94℃5min；94℃30s、59℃30s、72℃45s，31個(gè)循環(huán)；72℃10min。

以上任一所述方法中，采用所述引物對乙時(shí)，PCR擴(kuò)增的反應(yīng)程序具體可為：94℃5min；94℃30s、58℃30s、72℃50s，30個(gè)循環(huán)；72℃10min。

以上任一所述方法中，采用所述引物對甲時(shí)，PCR擴(kuò)增的反應(yīng)體系具體可為：2×Taq Master Mix 12.5μL、引物F1 0.5μL、引物R1 0.5μL、模板2μL，加雙蒸水至25μl。體系中，引物F1的濃度和引物R1的濃度均為0.4μM。

以上任一所述方法中，采用所述引物對乙時(shí)，PCR擴(kuò)增的反應(yīng)體系具體可為：2×Taq Master Mix 12.5μL、引物F2 0.5μL、引物R2 0.5μL、模板2μL，加雙蒸水至25μl。體系中，引物F2的濃度和引物R2的濃度均為0.4μM。

采用本發(fā)明提供的引物組、試劑盒進(jìn)行檢測，特異性好、敏感性高，只需要4-5小時(shí)的時(shí)間即可對臨床樣品進(jìn)行檢測，操作簡單、容易推廣，便于基層操作和應(yīng)用，對于北美H3N1亞型豬流感病毒疫病診斷和流行病學(xué)調(diào)查具有重大的應(yīng)用價(jià)值。

附圖說明

圖1為實(shí)施例4的結(jié)果。

圖2為實(shí)施例5的結(jié)果。

具體實(shí)施方式

以下的實(shí)施例便于更好地理解本發(fā)明，但并不限定本發(fā)明。下述實(shí)施例中的實(shí)驗(yàn)方法，如無特殊說明，均為常規(guī)方法。下述實(shí)施例中所用的試驗(yàn)材料，如無特殊說明，均為自常規(guī)生化試劑商店購買得到的。以下實(shí)施例中的定量試驗(yàn)，均設(shè)置三次重復(fù)實(shí)驗(yàn)，結(jié)果取平均值。

2×Taq Master Mix：南京諾唯贊生物科技有限公司-Vazyme Biotech Co.,Ltd；產(chǎn)品貨號L/N：7E062E6。

實(shí)施例1、引物組的設(shè)計(jì)

經(jīng)過大量序列分析獲得多個(gè)引物對，通過預(yù)實(shí)驗(yàn)對每個(gè)引物對的特異性和靈敏度進(jìn)行檢測，最終篩選出兩個(gè)用于鑒定北美H3N1亞型豬流感病毒的引物對。

引物對甲(靶序列位于HA基因，退火溫度為59℃)由引物F1和引物R1組成。

引物對乙(靶序列位于NA基因，退火溫度為58℃)由引物F2和引物R2組成。

引物F1(序列表的序列1)：5’-CTCCCTTAGGTCACTAGTTGCCTCA-3’；

引物R1(序列表的序列2)：5’-TTCCCTGTGCTGTTAATCAAAAGTA-3’。

引物F2(序列表的序列3)：5’-TGCATGCCATGATGGAGTGGGATGG-3’；

引物R2(序列表的序列4)：5’-ACTATCAGTTTCTGTCCATCCATTT-3’。

實(shí)施例2、方法的建立

1、提取待測樣本的總RNA并反轉(zhuǎn)錄為cDNA。

待測樣本可為待測組織或待測病毒。待測組織可為豬的肝組織、豬的腦組織、豬的肺組織、豬的鼻腔拭子等。

2、以步驟1得到的cDNA為模板，采用實(shí)施例1設(shè)計(jì)的引物對甲進(jìn)行PCR擴(kuò)增。

PCR擴(kuò)增的反應(yīng)體系(25μl)：2×Taq Master Mix 12.5μL、引物F1 0.5μL、引物R1 0.5μL、cDNA 2μL，加雙蒸水至25μl。

PCR擴(kuò)增的反應(yīng)程序：94℃5min；94℃30s、59℃30s、72℃45s，31個(gè)循環(huán)；72℃10min；4℃保存。

3、以步驟1得到的cDNA為模板，采用實(shí)施例1設(shè)計(jì)的引物對乙進(jìn)行PCR擴(kuò)增。

PCR擴(kuò)增的反應(yīng)體系(25μl)：2×Taq Master Mix 12.5μL、引物F2 0.5μL、引物R2 0.5μL、cDNA 2μL，加雙蒸水至25μl。

PCR擴(kuò)增的反應(yīng)程序：94℃5min；94℃30s、58℃30s、72℃50s，30個(gè)循環(huán)；72℃10min；4℃保存。

4、分別將步驟2得到的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物和步驟3得到的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行2％瓊脂糖凝膠電泳。凝膠中預(yù)先加入GelRed核酸染料，每種PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的上樣量為4μL，用紫外檢測儀觀察結(jié)果。

5、進(jìn)行結(jié)果判斷

當(dāng)待測樣本為待測組織時(shí)，如果電泳圖譜中，待測樣本步驟2得到的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物顯示具有432bp的條帶且步驟3得到的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物顯示具有610bp的條帶，待測樣本為候選的具有北美H3N1亞型豬流感病毒的組織。

當(dāng)待測樣本為待測病毒時(shí)，如果電泳圖譜中，待測樣本步驟2得到的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物顯示具有432bp的條帶且步驟3得到的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物顯示具有610bp的條帶，待測樣本為候選的北美H3N1亞型豬流感病毒。

實(shí)施例3、標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)粒的制備

一、標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)粒甲的制備

序列表的序列5所示的DNA分子為北美H3N1亞型豬流感病毒HA基因片段。將序列表的序列5所示的DNA分子插入pMD18-T載體，得到標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)粒甲。

二、標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)粒乙的制備

序列表的序列6所示的DNA分子為北美H3N1亞型豬流感病毒NA基因片段。將序列表的序列6所示的DNA分子插入pMD18-T載體，得到標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)粒乙。

實(shí)施例4、特異性

本實(shí)施例中所用的H3N2亞型禽流感病毒為毒株A/duck/Anhui/D293/2014(H3N2)，記載于如下文獻(xiàn)：北美H7亞型禽流感病毒RT-PCR檢測方法的建立；王晨曦、張谞霄、孫洪磊、蒲娟；中國獸醫(yī)雜志，2016年(第52卷)第6期，28-32。

本實(shí)施例中所用的H3N2亞型豬流感病毒為毒株A/swine/Taiwan/7310/70(H3N2)，記載于如下文獻(xiàn)：Epidemic Status of Swine Influenza VIrus in China；Weili Kong,Jiahui Ye,Shangsong Guan,Jinhua Liu,Juan Pu；Indian J Microbiol(Jan-Mar2014)54(1):3-11。

本實(shí)施例中所用的歐洲類禽H1N1豬流感病毒為毒株A/Swine/Fujian/204/2007，記載于如下文獻(xiàn)：Transmission and pathogenicity of novel reassortants derived from Eurasian avian-like and 2009 pandemic H1N1 influenza viruses in mice and guinea pigs；Weili Kong,Qinfang Liu,Yipeng Sun,Yu Wang,Huijie Gao,Lirong Liu,Zhihua Qin,Qiming He,Honglei Sun,Juan Pu,Dayan Wang,Xin Guo,Hanchun Yang,Kin-Chow Chang,Yuelong Shu,Jinhua Liu；Scientific Reports|6:27067|DOI:10.1038/srep27067。

本實(shí)施例中所用的H1N1亞型人流感病毒[pH1N1病毒(CA04))，為A/Beijing/7/2009(BJ09)，記載于如下文獻(xiàn)：Naturally Occurring Mutations in the PA Gene Are Key Contributors to Increased Virulence of Pandemic H1N1/09Influenza Virus in Mice；Yipeng Sun,Qi Xu,Ye Shen,Linqing Liu,Kai Wei,Honglei Sun,Juan Pu,Kin-Chow Chang,Jinhua Liu；Journal of Virology,2014Apr；88(8):4600-4.doi:10.1128。

本實(shí)施例中所用的H5N1亞型禽流感病毒為A/chicken/China/0603/2008(CN0603)，H5N2亞型禽流感病毒為A/duck/Eastern China/S0131/2014(DK/EC/S0131/14)，H5N6亞型禽流感病毒為A/duck/Eastern China/S0711/2014(DK/EC/S0711/14)，均記載于如下文獻(xiàn)：Characterization of clade 2.3.4.4highly pathogenic H5avian influenza viruses in ducks and chickens；Honglei Sun,Juan Pu,Jiao Hu,Litao Liu,Guanlong Xu,George F.Gao,Xiufan Liu,Jinhua Liu；Veterinary Microbiology,2016；182:116-22.doi:10.1016。

一、引物對甲的特異性

1、提取待測樣本的總RNA并反轉(zhuǎn)錄為cDNA。

待測樣本分別為：H1N1亞型人流感病毒、歐洲類禽H1N1豬流感病毒、H3N2亞型豬流感病毒或H3N2亞型禽流感病毒。

2、以標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)粒甲或步驟1得到的cDNA為模板，采用實(shí)施例1設(shè)計(jì)的引物對甲進(jìn)行PCR擴(kuò)增。

PCR擴(kuò)增的反應(yīng)體系(25μl)：2×Taq Master Mix 12.5μL、引物F1 0.5μL、引物R1 0.5μL、模板2μL，加雙蒸水至25μl。體系中，引物F1的濃度和引物R1的濃度均為0.4μM。體系中，模板DNA的含量約為100ng。

用2μL雙蒸水代替模板，作為陰性對照。

PCR擴(kuò)增的反應(yīng)程序：94℃5min；94℃30s、59℃30s、72℃45s，31個(gè)循環(huán)；72℃10min；4℃保存。

3、將步驟2得到的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行2％瓊脂糖凝膠電泳。凝膠中預(yù)先加入GelRed核酸染料，每種PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的上樣量為4μL，用紫外檢測儀觀察結(jié)果。

電泳圖見圖1A。圖1A中，泳道1對應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)粒甲，泳道2對應(yīng)H1N1亞型人流感病毒，泳道3對應(yīng)歐洲類禽H1N1豬流感病毒，泳道4對應(yīng)H3N2亞型豬流感病毒，泳道5對應(yīng)H3N2亞型禽流感病毒，泳道6對應(yīng)陰性對照。

結(jié)果表明，標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)粒甲和H3N2亞型豬流感病毒均顯示400-500bp的條帶，H1N1亞型人流感病毒、歐洲類禽H1N1豬流感病毒、H3N2亞型禽流感病毒和陰性對照均不顯示400-500bp的條帶。結(jié)果表明，引物對甲檢測H3亞型豬流感病毒的HA基因特異性較好，但是因北美H3N1亞型豬流感病毒的HA基因與H3N2亞型豬流感病毒的HA基因同源性高，因此均顯示400-500bp的條帶，兩者不能區(qū)分。

二、引物對乙的特異性

1、提取待測樣本的總RNA并反轉(zhuǎn)錄為cDNA。

待測樣本分別為：H1N1亞型人流感病毒、歐洲類禽H1N1豬流感病毒、H3N2亞型豬流感病毒、H3N2亞型禽流感病毒、H5N1亞型禽流感病毒、H5N2亞型禽流感病毒、H5N6亞型禽流感病毒。

2、以標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)粒乙或步驟1得到的cDNA為模板，采用實(shí)施例1設(shè)計(jì)的引物對乙進(jìn)行PCR擴(kuò)增。

PCR擴(kuò)增的反應(yīng)體系(25μl)：2×Taq Master Mix 12.5μL、引物F2 0.5μL、引物R2 0.5μL、模板2μL，加雙蒸水至25μl。體系中，引物F2的濃度和引物R2的濃度均為0.4μM。體系中，模板DNA的含量約為100ng。

用2μL雙蒸水代替cDNA，作為陰性對照。

PCR擴(kuò)增的反應(yīng)程序：94℃5min；94℃30s、58℃30s、72℃50s，30個(gè)循環(huán)；72℃10min；4℃保存。

3、將步驟2得到的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行2％瓊脂糖凝膠電泳。凝膠中預(yù)先加入GelRed核酸染料，每種PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的上樣量為4μL，用紫外檢測儀觀察結(jié)果。

電泳圖見圖1B。圖1B中，1對應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)粒乙，泳道2對應(yīng)H1N1亞型人流感病毒，泳道3對應(yīng)歐洲類禽H1N1豬流感病毒，泳道4對應(yīng)H3N2亞型豬流感病毒，泳道5對應(yīng)H3N2亞型禽流感病毒，泳道6對應(yīng)H5N1亞型禽流感病毒，泳道7對應(yīng)H5N2亞型禽流感病毒，泳道8對應(yīng)H5N6亞型禽流感病毒，泳道9對應(yīng)陰性對照。

結(jié)果表明，標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)粒乙顯示600-700bp的條帶，H1N1亞型人流感病毒、歐洲類禽H1N1豬流感病毒、H3N2亞型豬流感病毒、H3N2亞型禽流感病毒、H5N1亞型禽流感病毒、H5N2亞型禽流感病毒、H5N6亞型禽流感病毒和陰性對照均不顯示600-700bp的條帶。結(jié)果表明，引物對乙檢測北美H3N1亞型豬流感病毒的NA基因的特異性非常好。

實(shí)施例5、靈敏度

一、引物對甲的靈敏度

用雙蒸水作為溶劑，10倍梯度稀釋標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)粒甲，得到DNA濃度為10ng/μL、1ng/μL、10^-1ng/μL、10^-2ng/μL、10^-3ng/μL、10^-4ng/μL、10^-5ng/μL、10^-6ng/μL、10^-7ng/μL或10^-8ng/μL的各個(gè)稀釋液。

1、以各個(gè)稀釋液為模板，采用實(shí)施例1設(shè)計(jì)的引物對甲進(jìn)行PCR擴(kuò)增。

PCR擴(kuò)增的反應(yīng)體系(25μl)：2×Taq Master Mix 12.5μL、引物F1 0.5μL、引物R1 0.5μL、模板2μL，加雙蒸水至25μl。體系中，引物F1的濃度和引物R1的濃度均為0.4μM。

PCR擴(kuò)增的反應(yīng)程序：94℃5min；94℃30s、59℃30s、72℃45s，31個(gè)循環(huán)；72℃10min；4℃保存。

2、將步驟1得到的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行2％瓊脂糖凝膠電泳。凝膠中預(yù)先加入GelRed核酸染料，每種PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的上樣量為4μL，用紫外檢測儀觀察結(jié)果。

結(jié)果見圖2A。圖2A中，泳道1至10依次為DNA濃度由高至低的各個(gè)稀釋液。結(jié)果表明，采用上述方法檢測，模板中標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)粒甲的最低檢測限為10^-4ng/μL。

二、引物對乙的靈敏度

用雙蒸水作為溶劑，10倍梯度稀釋標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)粒乙，得到DNA濃度為10ng/μL、1ng/μL、10^-1ng/μL、10^-2ng/μL、10^-3ng/μL、10^-4ng/μL、10^-5ng/μL、10^-6ng/μL、10^-7ng/μL或10^-8ng/μL的各個(gè)稀釋液。

1、以各個(gè)稀釋液為模板，采用實(shí)施例1設(shè)計(jì)的引物對乙進(jìn)行PCR擴(kuò)增。

PCR擴(kuò)增的反應(yīng)體系(25μl)：2×Taq Master Mix 12.5μL、引物F2 0.5μL、引物R2 0.5μL、模板2μL，加雙蒸水至25μl。體系中，引物F2的濃度和引物R2的濃度均為0.4μM。

PCR擴(kuò)增的反應(yīng)程序：94℃5min；94℃30s、58℃30s、72℃50s，30個(gè)循環(huán)；72℃10min；4℃保存。

2、將步驟1得到的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行2％瓊脂糖凝膠電泳。凝膠中預(yù)先加入GelRed核酸染料，每種PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的上樣量為4μL，用紫外檢測儀觀察結(jié)果。

結(jié)果見圖2B。圖2B中，泳道1至10依次為DNA濃度由高至低的各個(gè)稀釋液。結(jié)果表明，采用上述方法檢測，模板中標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)粒乙的最低檢測限為10^-4ng/μL。

SEQUENCE LISTING

<110> 中國農(nóng)業(yè)大學(xué)

<120> 一種檢測北美H3N1亞型豬流感病毒的引物組及其應(yīng)用

<130> GNCYX170233

<160> 6

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

ctcccttagg tcactagttg cctca 25

<210> 2

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

ttccctgtgc tgttaatcaa aagta 25

<210> 3

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

tgcatgccat gatggagtgg gatgg 25

<210> 4

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

actatcagtt tctgtccatc cattt 25

<210> 5

<211> 1792

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

tattcgtctc agggagcaaa agcaggggat atttctatta accatgaaga ctatcattgc 60

ttttagctac attttatgtc tgattttcgc tcaaaaactc cccggaagtg acaacagcat 120

ggcaacgctg tgcctgggac accatgcagt atcaaacgga acgttagtga aaacaatcac 180

ggataaccaa attgaagtga ctaatgctac tgagctggtt cagagttcct caataggtag 240

aatatgcaac agtcctcacc aaatccttga tgggaaaaat tgcacactga tagatgctct 300

attgggagac cctcattgtg atgacttcca aaacaaggaa tgggaccttt ttgttgaacg 360

aagcacagcc tacagcaact gttaccctta ttatgtgccg gattatgcct cccttaggtc 420

actagttgcc tcatccggca ccctggaatt tacccaagaa agcttcaatt ggactggagt 480

tgctcaaaat ggaacaagct atgcttgcag aagggaatct gttaacagtt tctttagtag 540

attgaattgg ttgcataatt tggattacaa atatccagcg ctgaacgtaa ctatgccaaa 600

caatgacaaa tttgacaaat tgtacatttg gggggttcac cacccgggta cggacaggga 660

ccaaaccaac ctatatgttc aagcatcagg gagagttaca gtctccacca aaagaagcca 720

acaaactgta atcccgaata tcgggtctag accctgggta aggggtgtct ccagcataat 780

aagcatctat tggacaatag taaaaccggg agacatactt ttgattagca gcacagggaa 840

tctaattgcc cctcggggtt acttcaaaat acaaagtggg aaaagctcaa taatggggtc 900

agatgcaccc attgacaact gcaattctga atgcattact ccaaatggaa gcatttccaa 960

tgacaaacct tttcaaaatg taaacaggat cacatatggg gcctgtccca gatatgttaa 1020

gcaaaacact ctgaaattgg caacagggat gcggaatgta ccagagaaac aaactagagg 1080

catattcggc gcaatcgcag gtttcataga aaatggttgg gaggggatgg tggacggttg 1140

gtacggtttc aggcatcaaa attctgaagg cacaggacaa gcagcagatc ttaaaagtac 1200

tcaggcagca atcaaccaaa tcaccgggaa actaaataga gtaatcaaga aaacgaacga 1260

gaaattccat caaatcgaaa aagaattctc agaagtagaa gggagaattc aggacctaga 1320

gaaatacgtt gaagacacta aaatagatct ctggtcttac aacgcggagc ttcttgttgc 1380

cctggagaac caacatacaa ttgatttaac tgactcagaa atgaacaaac tgttcgaaag 1440

aacaagaaag caactgcggg aaaatgctga ggacatgggg aatggttgct tcaaaatata 1500

ccacaaatgt gacaatgcct gcataggatc aatcagaaat ggaacttatg accatgatgt 1560

atacagagat gaggcattaa acaatcggtt ccagatcaaa ggtgttcagc tgaagtcagg 1620

atacaaagat tggatcctat ggatttcctt tgccatatca tgctttttgc tttgtgttgt 1680

tctgctgggg ttcattatgt gggcctgcca aaaaggcaac attaggtgca acatttgcat 1740

ttgagtgcat taattaaaaa cacccttgtt tctactaata cgagacgata ta 1792

<210> 6

<211> 1410

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

atgaatacaa accaaagaat aataaccatt gggacagtct gtctgatagt cggaacaatt 60

aatctattat tgcaaatagg gaatatagtc tcgttatgga taagccattt aattcagact 120

ggagggaaaa actactctaa tacctgcagt caaagtgtca ttacatatga aaataacaca 180

tgggtgaacc aaacttatgt aaacattagc aataccaaca ttgctgatga acagagagtg 240

tattcaaagg tactaaccgg caactcttcc ctttgcccaa taaatggatg ggctatatac 300

agcaaagata atagcataag gatcggttcc aaaggagaca tttttgttat aagagaacca 360

ttcatttcat gctctcattt agaatgcaga accttttttc tgacccaagg tgctctgctg 420

aatgacaggc attctaatgg aaccgtcaaa gacaggagcc cttacaggac cttaatgagt 480

tgtccgattg gtgaagcgcc atctccgtac aattcaaggt tcgaatcagt tgcttggtca 540

gcgagtgcat gccatgatgg agtgggatgg ctaacaatcg ggatttccgg tccagataat 600

ggagcagtgg ctgttttgaa atacaatggg ataataacag acacaataaa aagttggaag 660

aaacaaatac taagaacaca agagtctgaa tgtgtctgta tcaatggctc atgttttaca 720

ataatgactg atggcccaag caacaatcag gcctcataca aaatattcaa aataaagaaa 780

gggaaaatta ttaaatcagt tgagatggat gcacctaatt accactatga ggaatgctcc 840

tgttatcctg atacaggcaa agtgatgtgc gtgtgcagag acaattggca tgcttcgaat 900

cgaccatggg tctcttttga tcagaatctt aattatcaga ttgggtacat atgcagtgga 960

atttttggtg ataacccacg ttctaatgat gggagaggca attgtggccc agtactttct 1020

aatggggcga atggagtgaa aggattctca tttagatatg gcaatggtgt ttggataggg 1080

agaactaaaa acatcagctc tagaagtgga tttgagatga tttgggatcc aaatggatgg 1140

acagaaactg atagtatgtt ctctaaaaag caagatgtca tagcattgac cgattggtca 1200

ggatatagtg ggagttttgt ccaacatccc gaactaacag gaatgaactg catgaggcct 1260

tgtttctggg tagagttaat caraggacaa cccaaggaga gcacaatttg gaccagtgga 1320

agcagcatct ctttctgtgg cgtaratagt ggaaccgcaa gctggtcgtg gccagacgga 1380

gctgatctgc cattcagtgt tgacaagtag 1410