本發(fā)明屬于一種測(cè)定或檢驗(yàn)核酸的分子信標(biāo)，特別涉及一種測(cè)定或檢驗(yàn)血清UHRF1 DNA的分子信標(biāo)。

背景技術(shù)：

循環(huán)DNA廣泛存在于人和動(dòng)物的體液中，是一段500bp～30kb的雙螺旋DNA結(jié)構(gòu)，可用于腫瘤的診斷和預(yù)后評(píng)估。隨著微量定量檢測(cè)技術(shù)的飛速發(fā)展，循環(huán)DNA，特別是血液循環(huán)DNA，作為一種微創(chuàng)檢查中的生物大分子標(biāo)志物，日益受到人們的關(guān)注。目前用于檢測(cè)臨床血清標(biāo)本中循環(huán)DNA的方法主要以PCR為基礎(chǔ)，存在步驟多、耗時(shí)長(zhǎng)、試劑/儀器昂貴等缺點(diǎn)。此外，循環(huán)DNA是一段雙鏈DNA，以復(fù)合體的形式存在或者通過蛋白質(zhì)結(jié)合在細(xì)胞表面。因此，在現(xiàn)有檢測(cè)循環(huán)DNA技術(shù)中，有兩個(gè)首要問題需要解決：1、將循環(huán)DNA與復(fù)合體或蛋白質(zhì)分離開來；2、解螺旋。

循環(huán)DNA的檢測(cè)被認(rèn)為是一個(gè)潛在的腫瘤早期診斷和預(yù)后判斷的有力手段。通過對(duì)腫瘤相關(guān)循環(huán)DNA的分析，將有助于臨床上對(duì)腫瘤進(jìn)行診斷、分期及預(yù)后的估計(jì)。研究發(fā)現(xiàn)，乳腺癌血清中UHRF1 DNA水平與無進(jìn)展期生存負(fù)相關(guān)。分子信標(biāo)具有背景信號(hào)低、靈敏度高、特意識(shí)別性強(qiáng)、操作簡(jiǎn)單、不必與未反應(yīng)的探針分離即可實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)、可用于活體分析等優(yōu)點(diǎn)。本發(fā)明選擇與乳腺癌診斷及預(yù)后相關(guān)的UHRF1 DNA進(jìn)行檢測(cè)，但常規(guī)分子信標(biāo)用于檢測(cè)血清標(biāo)本時(shí)，由于核酸酶對(duì)分子信標(biāo)骨架的降解和破壞作用，常導(dǎo)致假陽性信號(hào)的產(chǎn)生。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是提供一種能夠抵抗血清中核酸酶的降解作用，與雙鏈DNA雜交形成三股螺旋，無須變性直接對(duì)雙鏈DNA進(jìn)行檢測(cè)分析，能夠識(shí)別雙鏈DNA分子，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)乳腺癌的診斷與預(yù)后評(píng)估的特殊分子信標(biāo)。

為了解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明提供如下技術(shù)方案：一種經(jīng)過鎖核酸修飾的分子信標(biāo)，用于乳腺癌的診斷。所述分子信標(biāo)其序列為

5’-6-FAM-tCgA-tGtCaTtCaGgCgGaCcTcGtAg-TcGa-DABCYL-3’，其中tCgA為5’端莖部序列，TcGa為3’端莖部序列，熒光基團(tuán)為6-FAM，淬滅基團(tuán)為DABCYL，tGtCaTtCaGgCgGaCcTcGtAg為環(huán)狀序列，其中環(huán)狀序列中用小寫表示的堿基是鎖核酸修飾處理后的堿基。

針對(duì)待測(cè)基因選取特異性強(qiáng)的DNA片段，并以此序列信息來設(shè)計(jì)分子信標(biāo)，分子信標(biāo)的具體設(shè)計(jì)依據(jù)網(wǎng)站(www.molecular-beacons.org)中分子信標(biāo)的設(shè)計(jì)原則來進(jìn)行，環(huán)狀探針結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)原則為：長(zhǎng)度在15～30個(gè)堿基之間；與目標(biāo)DNA能互補(bǔ)配對(duì)。莖狀序列結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)原則：探針序列的長(zhǎng)度為4～6個(gè)堿基；GC含量一般在70～80％之間；融鏈溫度比檢測(cè)溫度要7～10℃；G堿基不能連接熒光基團(tuán)。熒光基團(tuán)與淬滅基團(tuán)的選擇：熒光基團(tuán)能被相應(yīng)的淬滅基團(tuán)所淬滅，兩個(gè)基團(tuán)有一高的信號(hào)背景比(2.0以上)。

為了提高分子信標(biāo)檢測(cè)的靈敏度和穩(wěn)定性，并實(shí)現(xiàn)直接檢測(cè)雙鏈DNA的目的，采用鎖核酸來修飾本發(fā)明所述的分子信標(biāo)。鎖核酸(LNA)是一種寡核苷酸衍生物，與DNA或RNA具有相同的磷酸鹽骨架，在識(shí)別DNA或RNA上具有明顯的優(yōu)勢(shì)。LNA有以下幾個(gè)特點(diǎn)：1、LNA與DNA的結(jié)合能力高于DNA與DNA的結(jié)合能力；2、LNA/DNA雙鏈比DNA/DNA雙鏈穩(wěn)定性高；3、LNA對(duì)核酸酶的抗性高。除了以上優(yōu)越性，選擇鎖核酸作為分子信標(biāo)修飾方式的最主要原因是，鎖核酸能夠直接識(shí)別雙鏈DNA，省去解螺旋及其后續(xù)的一系列復(fù)雜步驟。

附圖說明

圖1.鎖核酸修飾的分子信標(biāo)與雙鏈DNA雜交示意圖

圖2.鎖核酸修飾的分子信標(biāo)結(jié)構(gòu)示意圖

具體實(shí)施方式

本發(fā)明用于乳腺癌診斷的分子信標(biāo)，所述分子信標(biāo)其序列為

5’-6-FAM-tCgA-tGtCaTtCaGgCgGaCcTcGtAg-TcGa-DABCYL-3’，其中tCgA為5’端莖部序列，TcGa為3’端莖部序列，熒光基團(tuán)為6-FAM，淬滅基團(tuán)為DABCYL，tGtCaTtCaGgCgGaCcTcGtAg為環(huán)狀序列，其中環(huán)狀序列中用小寫表示的堿基是鎖核酸修飾處理后的堿基。

現(xiàn)介紹本發(fā)明用于乳腺癌診斷的分子信標(biāo)設(shè)計(jì)及其制備方法。

a.針對(duì)待測(cè)基因選取特異性強(qiáng)的DNA片段。通過序列比對(duì)軟件如Blast來保證所選的序列的唯一性：選擇的UHRF1 DNA片段為：5’-TCGACTACGAGGTCCGCCTGAATGACA-3’。

b.根據(jù)所選序列設(shè)計(jì)需要合成的分子信標(biāo)。設(shè)計(jì)的UHRF1 DNA的分子信標(biāo)環(huán)狀序列為TGTCATTCAGGCGGACCTCGTAG，熒光基團(tuán)為6-FAM，淬滅基團(tuán)為DABCYL。為了有效避免黏末端結(jié)合，分子信標(biāo)的一端莖部區(qū)域與目標(biāo)序列互補(bǔ)。

c.確定鎖核酸修飾的位置和數(shù)量。查詢文獻(xiàn)可知，在保證雜交速率的前提下，使得分子信標(biāo)抗核酸酶分解，則分子信標(biāo)需要每隔一個(gè)DNA堿基修飾一個(gè)鎖核酸。即合成的分子信標(biāo)序列為

5’-6-FAM-tCgA-tGtCaTtCaGgCgGaCcTcGtAg-TcGa-DABCYL-3’，其中tCgA為5’端莖部序列，TcGa為3’端莖部序列，熒光基團(tuán)為6-FAM，淬滅基團(tuán)為DABCYL，tGtCaTtCaGgCgGaCcTcGtAg為環(huán)狀序列，其中環(huán)狀序列中用小寫表示的堿基是鎖核酸修飾處理后的堿基。

根據(jù)上述確定的分子信標(biāo)序列可交由相關(guān)公司(如生工)進(jìn)行合成。

本發(fā)明分子信標(biāo)使用方法：用QIAamp DNA提取試劑盒抽提游離DNA，分別加入2μL提取的DNA，10nM分子信標(biāo)于Tris-HCI緩沖液中(含100mM NaCl，5mM KCl，5mg MgCl2·6H2O)，形成200μL體系，室溫放置30min，用熒光儀檢測(cè)熒光強(qiáng)度。