本發(fā)明屬于卵黃抗體監(jiān)測技術領域，具體涉及一種新的H5亞型禽流感卵黃抗體代替血清抗體監(jiān)測的方法。

背景技術：

H5亞型禽流感屬于高致病性禽流感，是最嚴重的家禽傳染病之一，可造成養(yǎng)禽業(yè)(包括雞、鴨、鴿、鵪鶉等)的重大經(jīng)濟損失，免疫接種是我國最主要的防控措施，免疫產生的抗體效價高低直接決定著免疫質量和防控成敗。由于免疫接種容易受到多種因素的影響，如疫苗因素、動物因素、飼養(yǎng)管理因素、疾病因素等，而且動物的免疫反應看不到、摸不著，所以免疫質量存在很大的不確定性，這給防控帶來極大的困難?？贵w監(jiān)測是檢驗免疫質量最直接、最有效的方法，通過抗體監(jiān)測可以確定科學的免疫程序、合理的免疫時間，選擇優(yōu)質的疫苗、準確的免疫劑量，從而確保免疫效果。抗體監(jiān)測還可以提示H5亞型禽流感發(fā)生的風險，如果抗體效價低于4log2，雞群的抗體不足以抵抗病毒的侵襲，發(fā)病的風險增大，定期進行H5亞型禽流感抗體監(jiān)測可以評估疫苗免疫質量和預警疫病的發(fā)生，是預防控制H5亞型禽流感的重要措施。

抗體監(jiān)測是利用免疫學試驗的原理，用已知抗原檢測相應特異性抗體的方法，其在免疫質量評估、疫病診斷、疫病監(jiān)測、疫情預警、疫病控制等方面發(fā)揮重要作用，是動物疫病防控的主要技術手段?？贵w監(jiān)測主要以血清抗體效價為標準，利用血清學試驗檢測血清抗體，常用的方法有血凝試驗(HA)、血凝抑制試驗(HI)和酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)等，其中HA和HI是禽流感抗體監(jiān)測的最常用方法。血清抗體監(jiān)測具有結果準確、可靠的優(yōu)點，但同時具有操作繁瑣、影響雞健康和生產性能的缺點。因為需要采血和分離血清，操作過程繁瑣，浪費人力和時間，同時采血引起的應激會給養(yǎng)雞生產造成不良影響，從而導致血清抗體監(jiān)測在實踐應用中受到一定的限制。然而，與血清制備相比，卵黃制備更加簡便和安全，只需要收集雞蛋，不需要采血，所以用卵黃代替血清進行抗體監(jiān)測具有一定的優(yōu)勢和推廣價值，我國早在20世紀80年代就有用卵黃抗體代替血清抗體進行新城疫抗體監(jiān)測的報道。

卵黃抗體(IgY)是禽類在抗原刺激下產生的沉積于卵黃中的針對特定抗原的抗體，是禽類在長期進化過程中形成的用于提高雛禽抵抗力的物質。當家禽受到外來抗原刺激后，法氏囊內的B細胞分化成為漿細胞，分泌特異性抗體進入血液循環(huán)；當血液流經(jīng)卵巢時，特異性抗體選擇性地(主要是IgG)轉移并沉積到卵黃，形成卵黃抗體；IgG在卵細胞中具有蓄積作用，所以卵黃抗體的濃度高于血清中的抗體濃度。自1893年KIemperer首次報道雞蛋中存在抗體以來，人們對卵黃抗體的認識不斷加深，相關研究也愈來愈受到關注，其中用卵黃抗體代替血清抗體進行抗體監(jiān)測是其中內容之一。當前用于檢測禽流感卵黃抗體的方法有多種，如氯仿提取法、生理鹽水提取法、磷酸鹽緩沖液提取法等，其中氯仿提取法使用最多。雖然氯仿提取法是最接近血清抗體的方法，但是結果仍然存在準確性和穩(wěn)定性的問題，這是卵黃抗體代替血清抗體進行禽流感抗體監(jiān)測最大的難題。卵黃抗體監(jiān)測雖然具有操作簡便、安全的優(yōu)點，但同時具有結果不準確、不可靠的缺點。

卵黃抗體是指禽類經(jīng)免疫后卵黃內含有的特異性抗體；血清抗體是禽類經(jīng)免疫后血清內含有的特異性抗體；血凝抑制試驗是指某些具有凝集紅細胞能力的病毒(或抗原)能被相應抗體抑制，原理是相應抗體與病毒(或抗原)結合后，阻止病毒(或抗原)表面血凝素與紅細胞結合，常用于正粘病毒、副粘病毒的診斷和抗體監(jiān)測；抗體監(jiān)測是通過免疫學實驗的方法，即用已知抗原檢測被檢樣品中有無相應的特異性抗體，其主要作用是檢驗免疫性與免疫效果，對于抗體監(jiān)測中發(fā)現(xiàn)免疫效果不好則可提示需要加強免疫或調整免疫程序，是動物疫病預防控制工作中重要的技術手段，具備重要的參考價值，并非疾病的診斷與治療方法。

在禽類疫病的抗體監(jiān)測中，血清抗體檢測結果可靠眾所周知，但是血清抗體監(jiān)測需要采血，在生產中有一定的技術難度，還會產生應激，影響家禽的健康和生產性能；卵黃抗體檢測不需要采血，只需要提供禽蛋，不會產生應激，不會影響家禽的健康和生產性能。新城疫和禽流感病毒的抗體監(jiān)測一直以血清抗體效價為標準，而卵黃抗體效價與血清抗體效價存在一定的差距，致使卵黃抗體檢測在生產中得不到認可。近年來產生了很多希望以卵黃抗體監(jiān)測替代血清抗體監(jiān)測的方法，但是卵黃抗體的情況與血清抗體有一定差距，之間的關聯(lián)性難以保證，往往導致監(jiān)測結果不可靠?，F(xiàn)有技術有很多對于兩者之間的關聯(lián)性進行了分析，但是結果往往僅僅局限于測得效價的數(shù)值對比，試圖從中總結出簡單的數(shù)值規(guī)律來，以意圖使得卵黃抗體的監(jiān)測能夠代替血清抗體，但這是不足取信的。卵黃抗體的效價的確定是卵黃代替血清的最關鍵點，相較于血清抗體的效價確定技術非常成熟，卵黃抗體存在于卵黃中，也存在于蛋清中，又屬于非均相液態(tài)物混合，現(xiàn)有的技術中很難保證卵黃中的所有抗體均參與了抗體監(jiān)測實驗，根據(jù)實際采取方法的不同，往往不是少引入了，就是將抗體誤算至更多了，單一方法很難保證所得的卵黃抗體效價的可信性。

技術實現(xiàn)要素：

申請人通過實驗發(fā)現(xiàn)，針對卵黃進行H5亞型禽流感抗體效價監(jiān)測，用氯仿處理一般效價偏低，而用水處理一般效價偏高，申請人認為其基于以下的機理：

卵黃中含有水分約48.0％、蛋白質約17.8％和脂肪約30.5％,其中大部分蛋白質與脂肪結合以脂蛋白的形式存在，其中包括卵黃抗體。正因為卵黃抗體不易簡單分離，所以在實際測定中很難測準卵黃抗體效價。

對于常用的氯仿法提取測效價，氯仿能夠溶解卵黃中的脂肪，用它處理的卵黃經(jīng)離心后分為3層，最下層淡黃色，為氯仿層；中間層為凝固的脂肪層；最上層澄清透明，為提純的卵黃抗體溶液。處理過程中，會丟失部分卵黃抗體，丟失在脂肪層或者是氯仿層中溶解的脂肪中，所以會導致血凝抑制抗體效價偏低。

而另一種處理路線，水溶性處理液，如生理鹽水、枸櫞酸鈉溶液、磷酸鹽緩沖液等，處理卵黃主要起到單純的稀釋作用，于是，在實際測定中，除抗體和抗原發(fā)生特異性結合以外，卵黃其它成份也和抗原發(fā)生了非異性結合，所以會導致血凝抑制抗體效價測定值偏高。

而現(xiàn)有技術中，針對血清抗體效價的監(jiān)測一般比較準確，因為血清中抗體的分離技術成熟，準確，可重現(xiàn)性強，但用卵黃抗體監(jiān)測雖然樣本收集簡單，不影響禽只的優(yōu)點，但有測定結果不準確的缺點，不克服這一缺點是很難替代血清抗體監(jiān)測的。

本發(fā)明因此想到了將氯仿處理的卵黃提取液與磷酸鹽緩沖液處理的卵黃提取液合并，由此抵沖兩者分別偏高和偏低的技術偏差，從而得到比較可靠的卵黃抗體效價，抗體效價再經(jīng)修訂可以更接近血清的抗體效價?？贵w監(jiān)測在防控中具有重要作用，在生產中將得到越來越多的應用，本發(fā)明是對應采集商品蛋雞的血液和雞蛋，分別檢測血清、磷酸鹽緩沖液提取卵黃液和氯仿提取卵黃液的H5亞型禽流感血凝抑制抗體效價，在磷酸鹽緩沖液提取卵黃液和氯仿提取卵黃液效價數(shù)值相對于血清抗體偏離方向客觀分析的基礎上，建立一種卵黃抗體代替血清抗體進行抗體監(jiān)測的方法，解決了卵黃抗體結果不準確、不可靠的問題。本發(fā)明的方法操作簡便、安全，結果準確、可靠，可以用卵黃取代血清進行蛋禽、種禽的H5亞型禽流感抗體禽流感病毒抗體監(jiān)測，避免了采血的麻煩和影響，易于推廣和應用。

本發(fā)明的方法是基于這樣的客觀情況的分析，即使得兩種常用方法處理卵黃以監(jiān)測效價的方法予以互補，這里指的是用氯仿和用磷酸鹽緩沖液。

本發(fā)明提供一種利用卵黃樣本代替血清樣本，利用磷酸鹽緩沖液提取卵黃液和氯仿提取卵黃液進行H5亞型禽流感抗體監(jiān)測代替血清抗體監(jiān)測的方法。其特征在于，抗體監(jiān)測過程中不需要采血，只需要收集禽蛋，不會對家禽產生應激，不會影響家禽的健康和生產性能；抗體監(jiān)測過程中用兩種卵黃提取液的混合液抗體效價經(jīng)進一步修訂值代替血清抗體效價，主要用于蛋禽和種禽的H5亞型禽流感抗體監(jiān)測，也可用于評估雛禽禽H5亞型禽流感抗體水平以確定首免時間。

本發(fā)明的有益效果是：以禽蛋作為檢測樣品，用磷酸鹽緩沖液提取卵黃液和氯仿提取卵黃液，兩種提取液進行等量混合，進行混合液的H5亞型禽流感抗體效價測定，經(jīng)適當修訂后代替血清抗體效價。修訂系數(shù)為0～1，是受疫苗種類、免疫時期、免疫程序等因素影響。通過該方法，抗體監(jiān)測操作更簡便、更安全，結果更準確、更可靠，大大提高H5亞型禽流感抗體監(jiān)測在生產中的適用性。

本發(fā)明要求保護一種新的檢測卵黃中H5亞型禽流感抗體的方法，其特征在于：

1)卵黃原料采集步驟

雞蛋采集是在養(yǎng)禽場中隨機采集雞蛋20枚或以上，保證采集的雞蛋來自整個雞群的分散度；將禽蛋用鑷子在殼上輕輕敲開直徑約1cm的小洞，撕開殼膜將蛋清完全倒出，再打開蛋殼將蛋黃完整倒入培養(yǎng)皿，進而挑開卵黃囊，用注射器直接避開表面蛋清抽取卵黃，將抽取到的卵黃注入到小燒杯中，玻棒攪勻使全部提取卵黃充分混勻，備用。

2)卵黃抗體提取

A、磷酸鹽緩沖液提取卵黃中抗體

吸取2ml提取卵黃加入離心管中，再加入2ml磷酸鹽緩沖液，充分振蕩混勻，室溫放置1h，得到渾濁的卵黃抗體提取液A，備用。

B、氯仿提取卵黃中抗體

吸取2ml提取卵黃加入離心管中，加入2ml磷酸鹽緩沖液，混合后加入4ml氯仿，充分振蕩混勻，室溫放置1h，期間攪拌混勻3次，再通過3000r/min離心10min，出現(xiàn)分層，上層為卵黃抗體提取液B，分離備用。

3)兩種提取方式卵黃液的混合

將步驟2所得到的卵黃抗體提取液A與B按等量比例混合得混合液，即為監(jiān)測用卵黃抗體樣本。

4)血凝試驗

在微量血凝板上，自第1列孔至第12列孔，每孔加25μl PBS，吸取一定倍數(shù)稀釋的抗原25μl加于第1列孔，充分混合后移出25μl至第2列孔，依次類推做等量倍比稀釋至第11列孔，第11列孔棄去25μL；設立第12列孔為紅細胞對照；每孔再加25μl PBS；每孔各加入0.75％雞紅細胞懸液25μl；立即置微型振蕩器上混合1min，或手持血凝板繞圓圈混勻1min；在室溫下作用30min，或在4℃下作用60min；觀察數(shù)次，直至對照的紅細胞全部沉淀為一個圓點，將血凝板傾斜，觀察紅細胞有無淚珠樣流掛，根據(jù)血凝圖像判定結果；血凝效價高于211時可繼續(xù)增加稀釋的孔數(shù)，以出現(xiàn)完全凝集的抗原最大稀釋度為該抗原的血凝效價，此時血凝效價為2n，n>11，再根據(jù)初始稀釋度計算抗原的血凝單位；并根據(jù)測定的抗原的血凝效價，計算4個血凝單位抗原的稀釋倍數(shù)，制備4個血凝單位抗原。

5)血凝抑制試驗與效價確認

在微量血凝板上，自第1列孔至第12列孔，每孔加25μl PBS。

將步驟3的混合液，取體積25μl于第1列孔，混勻后由左向右順序倍比稀釋至第11列孔，最后棄去25μl；第1列孔至第12列孔分別加25μl含4個血凝單位的抗原；立即置微型振蕩器上混合1min，或手持血凝板繞圓圈混勻1min；在室溫下作用30min，或在4℃下作用60min；每孔加0.75％雞紅細胞懸液25μl；混合后置室溫下作用40min或在4℃下作用60min，此時對照的紅細胞已沉淀為一個圓點；血凝抑制效價高于211時可繼續(xù)增加稀釋的孔數(shù)，以完全抑制紅細胞凝集的最大稀釋倍數(shù)為該混合液的血凝抑制效價，測定抗體效價加上修訂系數(shù)即為卵黃抗體替代血清抗體的血凝抑制效價。

6)主要試劑及配制

PBS：

配制20倍PB：稱量5.157g Na2HPO4.12H2O和0.874g NaH2PO4.2H2O，加蒸餾水至100ml；配制1倍PBS：量取50ml 20倍PB，加入8.5g NaCl，加蒸餾水至1000ml；用NaOH或HCl調pH值至7.2；121℃高壓蒸汽滅菌15min。

0.75％雞紅細胞懸液：

采集至少3只SPF公雞或無H5亞型禽流感抗體的健康公雞的血液與等體積阿氏液混合，用前述PBS液洗滌3次，每次均以1000r/min離心5-10min，洗滌后用前述PBS配成0.75％紅細胞懸液，4℃保存?zhèn)溆?，所?.75％為體積比。

前述的制備方法，其特征在于：

其中所述抗原是H5亞型禽流感抗原；

前述的步驟3中的按等量比例，是卵黃抗體提取液A：50％，卵黃抗體提取液B：50％；

前述的制備方法，其中的雞紅細胞懸液可以現(xiàn)配即用，也可以利用紅細胞保存液制備，該紅細胞保存阿氏液配制方法：稱葡萄糖2.05g、檸檬酸鈉0.8g、檸檬酸0.055g、氯化鈉0.42g，加蒸餾水至100ml，溶解后調pH值至6.1，115℃高壓蒸汽滅菌20min，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

附圖說明

圖1是本發(fā)明提供的替代H5亞型禽流感血清抗體監(jiān)測的卵黃抗體混合液的制備方法的流程圖。

圖2是本發(fā)明提供的替代H5亞型禽流感血清抗體監(jiān)測的卵黃抗體樣品的計算方法的流程圖。

具體實施方式

以下實施例將有助于本領域的普通技術人員進一步理解本發(fā)明，但不以任何形式限制本發(fā)明。

實施例

1)卵黃原料采集步驟

雞蛋采集是在蛋雞場中隨機采集雞蛋24枚，保證采集的雞蛋來自整個雞群的分散度；將禽蛋用鑷子在殼上輕輕敲開直徑約1cm的小洞，撕開殼膜將蛋清完全倒出，再打開蛋殼將蛋黃完整倒入培養(yǎng)皿，進而挑開卵黃囊，用注射器直接避開表面蛋清抽取卵黃，將抽取到的卵黃注入到小燒杯中，玻棒攪勻使全部提取卵黃充分混勻，備用。

2)卵黃抗體提取

A、磷酸鹽緩沖液提取卵黃中抗體

充分攪拌吸取2ml提取卵黃加入離心管中，再加入2ml磷酸鹽緩沖液，充分振蕩混勻，室溫放置1h，得到渾濁的卵黃抗體提取液A，備用。

B、氯仿提取卵黃中抗體

吸取2ml提取卵黃加入離心管中，加入2ml磷酸鹽緩沖液，混合后加入4ml氯仿，充分振蕩混勻，室溫放置1h，期間攪拌混勻3次，再通過3000r/min離心10min，出現(xiàn)分層，上層為卵黃抗體提取液B，分離備用。

3)兩種提取方式卵黃液的混合

將步驟2所得到的卵黃抗體提取液A與B按等量比例混合得混合液，即為監(jiān)測用卵黃抗體樣本。

4)血凝試驗

在微量血凝板上，自第1列孔至第12列孔，每孔加25μl PBS，吸取一定倍數(shù)稀釋的禽流感抗原25μl加于第1列孔，充分混合后移出25μl至第2列孔，依次類推做等量倍比稀釋至第11列孔，第11列孔棄去25μL；設立第12列孔為紅細胞對照；每孔再加25μl PBS；每孔各加入0.75％雞紅細胞懸液25μl；立即置微型振蕩器上混合1min；在室溫下作用30min；觀察數(shù)次，直至對照的紅細胞全部沉淀為一個圓點，將血凝板傾斜，觀察紅細胞有無淚珠樣流掛，根據(jù)血凝圖像判定結果。根據(jù)測定的抗原的血凝效價，計算4個血凝單位抗原的稀釋倍數(shù)，制備4個血凝單位抗原。H5亞型禽流感(Re-7)血凝效價為210，4血凝單位抗原為28稀釋。

5)血凝抑制試驗與效價確認

在微量血凝板上，自第1列孔至第12列孔，每孔加25μl PBS。

將步驟3的混合液，取體積25μl于第1列孔，混勻后由左向右順序倍比稀釋至第11列孔，最后棄去25μl；第1列孔至第12列孔分別加25μl含4個血凝單位的禽流感抗原；立即置微型振蕩器上混合1min；在室溫下作用30min；每孔加0.75％雞紅細胞懸液25μl；混合后置室溫下作用40min，此時對照的紅細胞已沉淀為一個圓點；以完全抑制紅細胞凝集的最大稀釋倍數(shù)為該混合液的血凝抑制效價，測定抗體效價加上修訂系數(shù)0.8即為H5亞型禽流感卵黃抗體替代血清抗體的血凝抑制效價。為了證實本發(fā)明方法的有效性，特將實測單用氯仿法以及單用磷酸緩沖液提取測定的卵黃數(shù)值與本發(fā)明數(shù)值產生的結果進行簡單比較。列表如下：

表1 H5亞型禽流感(Re-7)3種卵黃抗體效價及對應血清抗體效價結果(以log2表示)

表1為H5亞型禽流感的卵黃抗體及對應血清抗體結果，磷酸鹽緩沖液提取卵黃液和氯仿提取卵黃液抗體效價與血清抗體效價偏差較大，符合度較低，而磷酸鹽緩沖液、氯仿提取卵黃液的等量混合液抗體效價加上修訂系數(shù)與血清抗體效價偏差較小，符合度較高，明顯優(yōu)于磷酸鹽緩沖液提取卵黃液抗體效價或氯仿提取卵黃液抗體效價，其效價值比較接近血清效價測算結果，而其操作起來又沒有血清效價檢測的儀器要求和繁瑣步驟，是一種可信度較高的，可在一定程度上代替H5亞型禽流感血清抗體監(jiān)測的方法。

6)主要試劑及配制

PBS：

配制20倍PB：稱量5.157g Na2HPO4.12H2O和0.874g NaH2PO4.2H2O，加蒸餾水至100ml；配制1倍PBS：量取50ml 20倍PB，加入8.5g NaCl，加蒸餾水至1000ml；用NaOH或HCl調pH值至7.2；121℃高壓蒸汽滅菌15min。

0.75％雞紅細胞懸液：

采集3只無H5亞型禽流感抗體的健康公雞的血液與等體積阿氏液混合，用前述PBS液洗滌3次，每次均以1000r/min離心10min，洗滌后用前述PBS配成0.75％紅細胞懸液，4℃保存?zhèn)溆?，所?.75％均為體積比。

步驟3中的按等量比例，是卵黃抗體提取液A：50％，卵黃抗體提取液B：50％。

前述的制備方法，其中的阿氏液配方為：

紅細胞保存阿氏液：稱葡萄糖2.05g、檸檬酸鈉0.8g、檸檬酸0.055g、氯化鈉0.42g，加蒸餾水至100ml，溶解后調pH值至6.1，115℃高壓蒸汽滅菌20min，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

本發(fā)明在實際測定中的注意事項：

(1)試驗所用抗原的效價一定得標定準確，每次監(jiān)測之前一定先準確測定抗原的效價，應該是同時測2～3遍取其平均值，然后根據(jù)其準確效價配制所需抗原液(4單位抗原)?？乖号渲坪煤?，要自測一次，即在不加血清的情況下，第1、第2孔的血球完全凝集，第3孔部分凝集(血球在孔壁凝成一紅圈而不是均勻的凝集)，說明4單位抗原的配制沒有問題，可以使用。

(2)紅細胞應采自沒有免疫過的成熟公雞，未成熟的公雞紅細胞較脆弱，易溶血，不能用。紅細胞經(jīng)過反復離心洗滌后配成0.75％為更好，實踐證明，1％的紅細胞都不如0.75％的好。紅細胞懸浮液最好是現(xiàn)配現(xiàn)用，存放時間過長紅細胞發(fā)生破裂，會影響試驗結果。

(3)修訂系數(shù)通常為0～1，實施例中確定為0.8，修訂系數(shù)與疫苗、免疫時期、免疫程序等有關，需要根據(jù)經(jīng)驗確定，可靠的修訂系數(shù)可進一步提高抗體效價的準確性。

以上所述僅為本發(fā)明的較佳實施例而已，并不用以限制本發(fā)明，凡在本發(fā)明的精神和原則之內所作的任何修改、等同替換和改進等，均應包含在本發(fā)明的保護范圍之內。本發(fā)明所涉及的組成成分和制備方法均可根據(jù)實施方式進行相應調整，但不能超出該發(fā)明保護范圍。