本發(fā)明屬于用于腫瘤治療的生物制品領(lǐng)域，具體地，涉及HER1靶向性的嵌合抗原受體和NKT細(xì)胞及其制法和應(yīng)用。更具體地，涉及過繼免疫治療中的一種嵌合抗原受體HER1ScFv-CD8-CD137-CD3ζ及其基因和重組表達(dá)載體、工程化HER1靶向性的NKT細(xì)胞(CARHER1-NKT細(xì)胞)及其應(yīng)用。

背景技術(shù)：

EGFR(epithelial growth factor receptor，表皮生長因子受體)即HER1，是原癌基因c-erbB1的表達(dá)產(chǎn)物，屬于人類表皮生長因子受體(HER)家族，其本身具有酪氨酶激酶活性，一旦與表皮生長因子(EGF)組合可啟動細(xì)胞核內(nèi)的有關(guān)基因，從而促進(jìn)細(xì)胞分裂增殖。HER1在多種惡性腫瘤中高表達(dá)，研究發(fā)現(xiàn)HER1表達(dá)于大多數(shù)肺癌患者，表達(dá)水平達(dá)到80％，其表達(dá)水平與肺癌疾病的進(jìn)展及轉(zhuǎn)移有關(guān)。盡管最近肺癌的治療已經(jīng)獲得一定的進(jìn)展，但是仍然未提高患者的生存率，因此亟需探討新的療法來克服這一困擾。

目前，在治療進(jìn)展期HER1陽性肺癌患者時，HER1酪氨酸激酶抑制劑(tyrosine kinase inhibitors,TKIs)已經(jīng)處于臨床研究階段，但是，臨床結(jié)果表明，僅部分肺癌患者采用HER1酪氨酸激酶抑制劑治療有效，并且患者最終會產(chǎn)生一定的耐藥性，從而影響藥物的療效。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是為了克服現(xiàn)有技術(shù)中采用HER1酪氨酸激酶抑制劑治療進(jìn)展期HER1陽性肺癌患者時引起的耐藥性的缺陷，提供一種嵌合抗原受體HER1ScFv-CD8-CD137-CD3ζ及其基因和重組表達(dá)載體、工程化HER1靶向性的NKT細(xì)胞(CARHER1-NKT細(xì)胞)及其應(yīng)用，嵌合抗原受體HER1ScFv-CD8-CD137-CD3ζ修飾的NKT細(xì)胞在治療進(jìn)展期HER1陽性肺癌時，能夠有效避免采用HER1酪氨酸激酶抑制劑時引起的耐藥性，對肺癌細(xì)胞具有一定的特異靶向殺傷活性。

本發(fā)明的第一方面，提供了一種嵌合抗原受體(CAR)，所述嵌合抗原受體以CD8的絞鏈區(qū)和跨膜區(qū)及CD137和CD3ζ的胞內(nèi)信號結(jié)構(gòu)域串聯(lián)而成的結(jié)構(gòu)為信號傳導(dǎo)結(jié)構(gòu)域。

在另一優(yōu)選例中，所述嵌合抗原受體為HER1ScFv-CD8-CD137-CD3ζ，由HER1ScFv、CD8的鉸鏈區(qū)和跨膜區(qū)、CD137的胞內(nèi)信號結(jié)構(gòu)域和CD3ζ的胞內(nèi)信號結(jié)構(gòu)域串聯(lián)構(gòu)成。

在另一優(yōu)選例中，所述嵌合抗原受體的胞外結(jié)構(gòu)域為抗HER1的單鏈抗體。

在另一優(yōu)選例中，所述嵌合抗原受體的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

在另一優(yōu)選例中，所述CD8的鉸鏈區(qū)和跨膜區(qū)選自下組：

(A)具有SEQ ID NO:17所示氨基酸序列的多肽；

(B)具有與SEQ ID NO:17所示氨基酸序列≥80％同源性(優(yōu)選地，≥90％的同源性；等優(yōu)選地≥95％的同源性；最優(yōu)選地，≥97％的同源性)的多肽；(C)將SEQ ID NO:17中任一所示氨基酸序列經(jīng)過1-5個氨基酸殘基的取代、缺失或添加而形成的衍生多肽。

在另一優(yōu)選例中，所述CD137的胞內(nèi)信號結(jié)構(gòu)域選自下組：

(A)具有SEQ ID NO:18所示氨基酸序列的多肽；

(B)具有與SEQ ID NO:18所示氨基酸序列≥80％同源性(優(yōu)選地，≥90％的同源性；優(yōu)選地≥95％的同源性；最優(yōu)選地，≥97％的同源性)，并且能夠轉(zhuǎn)導(dǎo)效應(yīng)子功能信號的多肽；

(C)將SEQ ID NO:18中任一所示氨基酸序列經(jīng)過1-5個氨基酸殘基的取代、缺失或添加而形成的衍生多肽。

在另一優(yōu)選例中，所述CD3ζ的胞內(nèi)信號結(jié)構(gòu)域選自下組：

(A)具有SEQ ID NO:19所示氨基酸序列的多肽；

(B)具有與SEQ ID NO:19所示氨基酸序列≥80％同源性(優(yōu)選地，≥90％的同源性；等優(yōu)選地≥95％的同源性；最優(yōu)選地，≥97％的同源性)，并且能夠轉(zhuǎn)導(dǎo)效應(yīng)子功能信號的多肽；

(C)將SEQ ID NO:19中任一所示氨基酸序列經(jīng)過1-5個氨基酸殘基的取代、缺失或添加而形成的衍生多肽。

在另一優(yōu)選例中，所述CAR包括SEQ ID NO:9所示的氨基酸序列。

在另一優(yōu)選例中，所述嵌合抗原受體(CAR)還包括抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域。

在另一優(yōu)選例中，所述抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域為抗體或其抗原結(jié)合片段。

在另一優(yōu)選例中，所述抗原結(jié)合片段為Fab或scFv。

在另一優(yōu)選例中，所述抗原包括腫瘤抗原。

在另一優(yōu)選例中，所述腫瘤抗原與血液惡性腫瘤相關(guān)。

在另一優(yōu)選例中，所述腫瘤抗原與實體瘤相關(guān)。

在另一優(yōu)選例中，所述腫瘤抗原選自下組：HER1、CD19、CD20、CD30。

在另一優(yōu)選例中，所述嵌合抗原受體(CAR)為分離的。

在另一優(yōu)選例中，所述嵌合抗原受體(CAR)的氨基酸序列如SEQ ID NO.:1所示。

本發(fā)明的第二方面，提供了一種核酸分子，所述核酸分子編碼本發(fā)明第一方面所述的嵌合抗原受體(CAR)。

在另一優(yōu)選例中，所述核酸分子包含選自下組的編碼所述CD8的鉸鏈區(qū)和跨膜區(qū)的核酸序列：

(a)編碼如SEQ ID NO.:17所示多肽的多核苷酸；

(b)序列如SEQ ID NO.:3所示的多核苷酸；

(c)核苷酸序列與SEQ ID NO.:3所示序列的同源性≥90％(較佳地≥95％)，并 且編碼SEQ ID NO.:17所示氨基酸序列的多核苷酸；

(d)與(a)-(c)任一所述的多核苷酸互補(bǔ)的多核苷酸。

在另一優(yōu)選例中，所述核酸分子包含選自下組的編碼所述CD137的胞內(nèi)信號結(jié)構(gòu)域的核酸序列：

(a)編碼如SEQ ID NO.:18所示多肽的多核苷酸；

(b)序列如SEQ ID NO.:4所示的多核苷酸；

(c)核苷酸序列與SEQ ID NO.:4所示序列的同源性≥90％(較佳地≥95％)，并且編碼SEQ ID NO.:18所示氨基酸序列的多核苷酸；

(d)與(a)-(c)任一所述的多核苷酸互補(bǔ)的多核苷酸。

在另一優(yōu)選例中，所述核酸分子包含選自下組的編碼所述CD3ζ的胞內(nèi)信號結(jié)構(gòu)域的核酸序列：

(a)編碼如SEQ ID NO.:19所示多肽的多核苷酸；

(b)序列如SEQ ID NO.:5所示的多核苷酸；

(c)核苷酸序列與SEQ ID NO.:5所示序列的同源性≥90％(較佳地≥95％)，并且編碼SEQ ID NO.:19所示氨基酸序列的多核苷酸；

(d)與(a)-(c)任一所述的多核苷酸互補(bǔ)的多核苷酸。

在另一優(yōu)選例中，所述核酸分子包含選自下組的核酸序列：

(a)編碼如SEQ ID NO.:9所示多肽的多核苷酸；

(b)序列如SEQ ID NO.:10所示的多核苷酸；

(c)核苷酸序列與SEQ ID NO.:10所示序列的同源性≥95％(較佳地≥98％)，并且編碼SEQ ID NO.:9所示氨基酸序列的多核苷酸；

(d)與(a)-(c)任一所述的多核苷酸互補(bǔ)的多核苷酸。

在另一優(yōu)選例中，所述核酸分子為分離的。

在另一優(yōu)選例中，所述核酸分子還包括編碼前導(dǎo)序列(信號肽)的多核苷酸，所述前導(dǎo)序列的氨基酸序列如SEQ ID NO.:21所示：

在另一優(yōu)選例中，所述核酸分子的序列如SEQ ID NO.:2所示。

本發(fā)明的第三方面，提供了一種載體，所述的載體含有本發(fā)明第二方面所述的核酸分子。

在另一優(yōu)選例中，所述載體為慢病毒載體。

本發(fā)明的第四方面，提供了一種細(xì)胞，所述的細(xì)胞中含有本發(fā)明第三方面所述的載體或染色體中整合有外源的本發(fā)明第二方面所述的核酸分子。

在另一優(yōu)選例中，所述細(xì)胞為分離的細(xì)胞，和/或所述細(xì)胞為基因工程化的細(xì)胞。

在另一優(yōu)選例中，所述細(xì)胞為哺乳動物細(xì)胞。

在另一優(yōu)選例中，所述細(xì)胞為NKT細(xì)胞、或T細(xì)胞。

在另一優(yōu)選例中，所述T細(xì)胞為NKT細(xì)胞。

本發(fā)明的第五方面，提供了一種藥物組合物，所述組合物含有藥學(xué)上可接受 的載體以及本發(fā)明第一方面所述的嵌合抗原受體、本發(fā)明第二方面所述的核酸分子、本發(fā)明第三方面所述的載體、或本發(fā)明第四方面所述的細(xì)胞。

本發(fā)明的第六方面，提供了本發(fā)明第一方面所述的嵌合抗原受體、本發(fā)明第二方面所述的核酸分子、本發(fā)明第三方面所述的載體、或本發(fā)明第四方面所述的細(xì)胞的用途，用于制備治療腫瘤的藥物或制劑。

在另一優(yōu)選例中，所述的腫瘤包括肺癌。

在另一優(yōu)選例中，所述肺癌是指進(jìn)展期HER1陽性的肺癌。

本發(fā)明的第七方面，提供了一種治療疾病的方法，包括給需要治療的對象施用適量的本發(fā)明第一方面所述的嵌合抗原受體、本發(fā)明第二方面所述的核酸分子、本發(fā)明第三方面所述的載體、本發(fā)明第四方面所述的細(xì)胞、或本發(fā)明第五方面所述的藥物組合物。

在另一優(yōu)選例中，所述疾病為腫瘤。

本發(fā)明的第八方面，提供了一種嵌合抗原受體，所述嵌合抗原受體以CD8的hinge區(qū)和跨膜區(qū)及CD137和CD3ζ的胞內(nèi)信號結(jié)構(gòu)域串聯(lián)而成的結(jié)構(gòu)為信號傳導(dǎo)結(jié)構(gòu)域，所述信號傳導(dǎo)結(jié)構(gòu)域氨基酸序列如SEQ ID NO：9所示。

本發(fā)明的第九方面，提供了一種NKT細(xì)胞群，所述NKT細(xì)胞群中：

CD3⁺CD8⁺NKT細(xì)胞/CD3⁺CD4⁺NKT細(xì)胞的比率為8/1～2/1(優(yōu)選為6/1～3/1)；并且CD3⁺CD56⁺NKT細(xì)胞/CD3⁺CD8⁺NKT細(xì)胞的比率為1/18～10/18(優(yōu)選為5/18～10/18，如可以為1/8、1/6、1/4、1/3)。

在另一優(yōu)選例中，所述NKT細(xì)胞群中：

CD3+細(xì)胞比率≥95％；CD3⁺CD8⁺細(xì)胞比率≥90.99％；CD3⁺CD56⁺細(xì)胞比率≥15％(優(yōu)選地，≥18％；更優(yōu)選地≥20％；最優(yōu)選地≥22％，如≥24％、≥26％、≥28％、≥30％)；CD8⁺CD56⁺細(xì)胞比率≥15％(優(yōu)選地，≥18％；更優(yōu)選地≥20％；最優(yōu)選地≥22％，如≥24％、≥26％、≥28％、≥30％)。

在另一優(yōu)選例中，所述NKT細(xì)胞包括表達(dá)嵌合抗原受體的NKT細(xì)胞。

在另一優(yōu)選例中，所述NKT細(xì)胞包括本發(fā)明第四方面所述的細(xì)胞。

本發(fā)明的第十方面，提供了一種本發(fā)明第九方面所述的NKT細(xì)胞群的方法，所述方法包括步驟：

(a)將單個核細(xì)胞(PBMCs)培養(yǎng)于NKT細(xì)胞培養(yǎng)基中，所述NKT細(xì)胞培養(yǎng)基含有抗CD3單克隆抗體、白介素-2、和白介素-15，進(jìn)行第一階段培養(yǎng)。

在另一優(yōu)選例中，通過所述第一階段培養(yǎng)，從而分離單個核細(xì)胞中原始的NKT細(xì)胞并刺激其增殖。

在另一優(yōu)選例中，所述第一階段培養(yǎng)所用的細(xì)胞培養(yǎng)容器是經(jīng)RetroNectin包被的。

在另一優(yōu)選例中，所述抗CD3單克隆抗體的濃度為20ng/ml-80ng/ml(優(yōu) 選為30ng/ml-70ng/ml，更優(yōu)選為40ng/ml-60ng/ml，最優(yōu)選為約50ng/ml)；和/或

所述白介素-2的濃度為200U/mL-800U/mL(優(yōu)選為300U/mL-700U/mL，更優(yōu)選為400U/mL-600U/mL，最優(yōu)選為約500U/mL)；和/或

所述白介素-15的濃度為20ng/mL-80ng/mL(優(yōu)選為30ng/mL-70ng/mL，更優(yōu)選為40ng/mL-60ng/mL，最優(yōu)選為約50ng/mL)。

在另一優(yōu)選例中，所述第一階段的培養(yǎng)時間為2天-6天；優(yōu)選為3天-5天；更優(yōu)選為4天。

在另一優(yōu)選例中，所述NKT細(xì)胞培養(yǎng)基為GT-T551培養(yǎng)基。

在另一優(yōu)選例中，所述NKT細(xì)胞培養(yǎng)基中還包含血清；優(yōu)選地所述血清為自體血清或胎牛血清；更優(yōu)地所述血清為自體血清。

在另一優(yōu)選例中，所述血清含量為0.4％(v/v)-0.8％(v/v)；優(yōu)選為0.6％(v/v)。

在另一優(yōu)選例中，所述單個核細(xì)胞(PBMCs)來源于哺乳動物，更優(yōu)選地來源于人。

在另一優(yōu)選例中，所述方法包括步驟：

(b)將所述第一階段培養(yǎng)的細(xì)胞轉(zhuǎn)移到培養(yǎng)瓶中，加入NKT細(xì)胞培養(yǎng)基，進(jìn)行第二階段培養(yǎng)，其中，所述NKT細(xì)胞培養(yǎng)基中含有白介素-2；優(yōu)選地，所述白介素-2的濃度為200U/mL-800U/mL(優(yōu)選為300U/mL-700U/mL，更優(yōu)選為400U/mL-600U/mL，最優(yōu)選為約500U/mL)。

在另一優(yōu)選例中，通過所述第二階段培養(yǎng)從而實現(xiàn)NKT細(xì)胞體外的擴(kuò)增。

在另一優(yōu)選例中，用于所述第二階段培養(yǎng)的培養(yǎng)瓶是未包被的。

在另一優(yōu)選例中，用于所述第二階段培養(yǎng)的所述NKT細(xì)胞培養(yǎng)基中還包含血清；優(yōu)選地所述血清為自體血清或胎牛血清；更優(yōu)地所述血清為自體血清。

在另一優(yōu)選例中，所述血清含量為0.4％(v/v)-0.8％(v/v)；優(yōu)選為0.6％(v/v)。

在另一優(yōu)選例中，所述第二階段的培養(yǎng)時間為8天-20天；優(yōu)選為10天-18天；更優(yōu)選為為12天-16天。

在另一優(yōu)選例中，所述方法還包括步驟；

(c)將嵌合抗原受體(CAR)基因整合于所述NKT細(xì)胞中，從而制備表達(dá)嵌合抗原受體的NKT細(xì)胞。

本發(fā)明還提供了一種信號傳導(dǎo)結(jié)構(gòu)域序列，所述信號傳導(dǎo)結(jié)構(gòu)域由CD8的絞鏈區(qū)和跨膜區(qū)及CD137和CD3ζ的胞內(nèi)信號結(jié)構(gòu)域串聯(lián)而成，優(yōu)選地，各結(jié)構(gòu)單元如上所述。

本發(fā)明還提供了一種嵌合抗原受體，所述嵌合抗原受體為HER1ScFv-CD8-CD137-CD3ζ，由HER1ScFv、CD8的鉸鏈區(qū)和跨膜區(qū)、CD137的胞內(nèi)信號結(jié)構(gòu)域和CD3ζ的胞內(nèi)信號結(jié)構(gòu)域串聯(lián)構(gòu)成。

優(yōu)選地，所述嵌合抗原受體的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

本發(fā)明還提供了編碼上述嵌合抗原受體的基因。

優(yōu)選地，所述基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

本發(fā)明還提供了含有上述基因的重組表達(dá)載體。

優(yōu)選地，所述重組表達(dá)載體為慢病毒表達(dá)載體；更優(yōu)選地，所述慢病毒表達(dá)載體為pWPT-HER1ScFv-CD8-CD137-CD3ζ。

本發(fā)明還提供了一種工程化HER1靶向性的NKT細(xì)胞，所述NKT細(xì)胞是由上述的嵌合抗原受體修飾的NKT細(xì)胞。

本發(fā)明還提供了上述工程化HER1靶向性的NKT細(xì)胞在制備用于治療腫瘤的制劑中的應(yīng)用；優(yōu)選地，所述腫瘤是指進(jìn)展期HER1陽性肺癌。

本發(fā)明的發(fā)明人在研究中意外發(fā)現(xiàn)，采用嵌合抗原受體HER1ScFv-CD8-CD137-CD3ζ修飾的NKT細(xì)胞治療進(jìn)展期HER1陽性肺癌時，能夠有效避免采用HER1酪氨酸激酶抑制劑時引起的耐藥性，對肺癌細(xì)胞具有一定的特異靶向殺傷活性。

因此，為了實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供了一種嵌合抗原受體，所述嵌合抗原受體為HER1ScFv-CD8-CD137-CD3ζ，由HER1ScFv、CD8的鉸鏈區(qū)(hinge區(qū))和跨膜區(qū)、CD137的胞內(nèi)信號結(jié)構(gòu)域和CD3ζ的胞內(nèi)信號結(jié)構(gòu)域串聯(lián)構(gòu)成。

本發(fā)明還提供了編碼上述嵌合抗原受體的基因。

本發(fā)明還提供了含有上述基因的重組表達(dá)載體。

本發(fā)明還提供了一種工程化HER1靶向性的NKT細(xì)胞，所述NKT細(xì)胞是上述嵌合抗原受體HER1ScFv-CD8-CD137-CD3ζ修飾的NKT細(xì)胞。

本發(fā)明還提供了上述工程化HER1靶向性的NKT細(xì)胞在制備用于治療腫瘤的制劑中的應(yīng)用。

在治療進(jìn)展期HER1陽性肺癌時，本發(fā)明的嵌合抗原受體HER1ScFv-CD8-CD137-CD3ζ修飾的NKT細(xì)胞，即工程化HER1靶向性的NKT細(xì)胞能夠特異性結(jié)合HER1抗原，明顯延長免疫細(xì)胞在患者體內(nèi)的存活時間，增強(qiáng)免疫細(xì)胞靶向識別肺癌細(xì)胞表面HER1抗原的能力，加強(qiáng)對肺癌細(xì)胞的特異殺傷活性，而且確實能夠有效避免采用HER1酪氨酸激酶抑制劑時引起的耐藥性。本發(fā)明的工程化HER1靶向性的NKT細(xì)胞為治療進(jìn)展期HER1陽性肺癌提供了一種新的選擇，具有良好的產(chǎn)業(yè)應(yīng)用前景。

本發(fā)明的其它特征和優(yōu)點將在隨后的具體實施方式部分予以詳細(xì)說明。

應(yīng)理解，在本發(fā)明范圍內(nèi)中，本發(fā)明的上述各技術(shù)特征和在下文(如實施例)中具體描述的各技術(shù)特征之間都可以互相組合，從而構(gòu)成新的或優(yōu)選的技術(shù)方案。限于篇幅，在此不再一一累述。

附圖說明

圖1為流式細(xì)胞術(shù)對分離培養(yǎng)的NKT細(xì)胞表型分析的結(jié)果。

圖2為本發(fā)明的慢病毒表達(dá)載體pWPT-CD8-CD137-CD3ζ的限制性內(nèi)切酶MluI/SalI雙酶切片段的電泳鑒定圖。

圖3為本發(fā)明的慢病毒表達(dá)載體pWPT-HER1ScFv-CD8-CD137-CD3ζ的限制性內(nèi)切酶BamHI/SalI雙酶切片段的電泳鑒定圖。

圖4為本發(fā)明的慢病毒表達(dá)載體pWPT-HER1ScFv-CD8-CD137-CD3ζ的結(jié)構(gòu)示意圖，其中，逆時針序列為正向基因片度，順時針為反向基因片段。

圖5為流式細(xì)胞術(shù)檢測含有嵌合抗原受體HER1ScFv-CD8-CD137-CD3ζ的病毒濃縮液對NKT細(xì)胞的感染效率。

圖6為流式細(xì)胞術(shù)檢測嵌合抗原受體HER1ScFv-CD8-CD137-CD3ζ修飾的NKT細(xì)胞(CARHER1-NKT細(xì)胞)表型鑒定的結(jié)果。

圖7為本發(fā)明的CARHER1-NKT細(xì)胞對腫瘤細(xì)胞殺傷作用的細(xì)胞毒性分析圖。

圖8為本發(fā)明的CARHER1-NKT細(xì)胞對進(jìn)展期HER1陽性肺癌患者治療過程中，患者病灶部位HER1陽性肺癌細(xì)胞數(shù)目的變化。

圖9為本發(fā)明的CARHER1-NKT細(xì)胞對進(jìn)展期HER1陽性肺癌患者治療過程中，患者病灶部位影像圖變化。

圖10為為采用ELISA試劑盒分析細(xì)胞分泌白介素2的水平。

具體實施方式

以下對本發(fā)明的具體實施方式進(jìn)行詳細(xì)說明。應(yīng)當(dāng)理解的是，此處所描述的具體實施方式僅用于說明和解釋本發(fā)明，并不用于限制本發(fā)明。

本發(fā)明提供了一種嵌合抗原受體，所述嵌合抗原受體為HER1ScFv-CD8-CD137-CD3ζ，由HER1ScFv、CD8的鉸鏈區(qū)和跨膜區(qū)、CD137的胞內(nèi)信號結(jié)構(gòu)域和CD3ζ的胞內(nèi)信號結(jié)構(gòu)域串聯(lián)構(gòu)成。優(yōu)選情況下，嵌合抗原受體的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

本發(fā)明提供了編碼上述嵌合抗原受體的基因。優(yōu)選情況下，編碼上述嵌合抗原受體的基因的核苷酸序列如SEQID NO.2所示。

本發(fā)明提供了含有上述基因的重組表達(dá)載體。優(yōu)選情況下，重組表達(dá)載體為慢病毒表達(dá)載體。對于慢病毒表達(dá)載體沒有特別的限定，只要能夠與輔助載體共轉(zhuǎn)染包裝細(xì)胞如293T包裝細(xì)胞，獲得病毒濃縮液及嵌合抗原受體HER1ScFv-CD8-CD137-CD3ζ修飾的NTK細(xì)胞即可，優(yōu)選情況下，慢病毒表達(dá)載體為pWPT-HER1ScFv-CD8-CD137-CD3ζ。

對于慢病毒表達(dá)載體pWPT-HER1ScFv-CD8-CD137-CD3ζ的制備方法沒有特別的限定，可以為本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠想到的各種方法，優(yōu)選情況下，慢病毒表達(dá)載體pWPT-HER1ScFv-CD8-CD137-CD3ζ的制備方法包括以下步驟：

(1)從NKT細(xì)胞cDNA中分別擴(kuò)增CD8的hinge區(qū)和跨膜區(qū)、CD137的胞內(nèi)信號結(jié)構(gòu)域和CD3ζ的胞內(nèi)信號結(jié)構(gòu)域，并克隆至載體pWPT-GFP中，構(gòu)建得到pWPT-CD8-CD137-CD3ζ；

(2)合成編碼大鼠生長激素信號肽和HER1ScFv的核苷酸序列，并克隆至pWPT-CD8-CD137-CD3ζ中，經(jīng)測序驗證后得到序列正確的pWPT-HER1ScFv-CD8-CD137-CD3ζ。

步驟(1)中，對于從NKT細(xì)胞cDNA中分別擴(kuò)增CD8的hinge區(qū)和跨膜區(qū)、CD137的胞內(nèi)信號結(jié)構(gòu)域和CD3ζ的胞內(nèi)信號結(jié)構(gòu)域的方法沒有特別的限定，可以為本領(lǐng)域常用的各種方法，例如可以為RT-PCR法。其中，NKT細(xì)胞可以通過分離人靜脈血中的單個核細(xì)胞，然后進(jìn)行培養(yǎng)獲得。

具體地，得到pWPT-CD8-CD137-CD3ζ的方法可以包括：提取NKT細(xì)胞的總RNA，逆轉(zhuǎn)錄獲得NKT細(xì)胞cDNA，以得到的NKT細(xì)胞cDNA為模板，利用引物P1(SEQID NO.11)和P2(SEQID NO.12)進(jìn)行PCR擴(kuò)增獲得CD8基因的hinge區(qū)和跨膜區(qū)(SEQID NO.3)；利用引物P3(SEQID NO.13)和P4(SEQID NO.14)進(jìn)行PCR擴(kuò)增獲得CD137基因的胞內(nèi)信號結(jié)構(gòu)域(SEQID NO.4)；利用引物P5(SEQID NO.15)和P6(SEQID NO.16)進(jìn)行PCR擴(kuò)增獲得CD3ζ基因的胞內(nèi)信號結(jié)構(gòu)域(SEQID NO.5)，將獲得的PCR產(chǎn)物分別進(jìn)行雙酶切，然后與MluI/SalI雙酶切后的慢病毒表達(dá)載體pWPT-GFP連接。

步驟(2)中，對于合成編碼大鼠生長激素信號肽和HER1ScFv的核苷酸序列的方法沒有特別的限定，可以為本領(lǐng)域常用的各種方法，例如可以通過全基因合成技術(shù)合成。

具體地，得到序列正確的pWPT-HER1ScFv-CD8-CD137-CD3ζ的方法可以包括：通過全基因合成技術(shù)合成編碼大鼠生長激素信號肽和HER1ScFv融合基因的核苷酸序列(SEQID NO.8)，克隆至載體pGSI中，得到pGSI-HER1ScFv；然后將pGSI-HER1ScFv進(jìn)行EcoRⅤ/MluI雙酶切，與經(jīng)限制性內(nèi)切酶BamHI單酶切，用Klenow Fragment酶平頭，再用MluI單酶切后的步驟(1)得到的重組質(zhì)粒pWPT-CD8-CD137-CD3ζ連接，經(jīng)測序鑒定，得到序列正確的pWPT-HER1ScFv-CD8-CD137-CD3ζ。其中，大鼠生長激素信號肽的核苷酸序列如SEQID NO.6所示，HER1ScFv核苷酸序列如SEQID NO.7所示。

本發(fā)明還提供了一種工程化HER1靶向性的NKT細(xì)胞，所述NKT細(xì)胞是由上述嵌合抗原受體HER1ScFv-CD8-CD137-CD3ζ修飾的NKT細(xì)胞(即CARHER1-NKT細(xì)胞)。

對于工程化HER1靶向性的NKT細(xì)胞的制備方法沒有特別的限定，可以為本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠想到的任何方法，優(yōu)選情況下，該方法包括：包裝攜帶pWPT-HER1ScFv-CD8-CD137-CD3ζ編碼基因的慢病毒；利用得到的慢病毒感染NKT細(xì)胞，使NKT細(xì)胞表達(dá)嵌合抗原受體HER1ScFv-CD8-CD137-CD3ζ。

對于包裝攜帶pWPT-HER1ScFv-CD8-CD137-CD3ζ編碼基因的慢病毒的方法沒有特別的限定，可以為本領(lǐng)域技術(shù)人員常用的各種方法，優(yōu)選情況下，將慢病毒表達(dá)載體pWPT-HER1ScFv-CD8-CD137-CD3ζ與輔助質(zhì)粒(如psPAX2、pMD2.G)共轉(zhuǎn)染293T包裝細(xì)胞，轉(zhuǎn)染48-72h時收集病毒上清，離心、過濾，在濾液中添加5×PEG6000-NaCl進(jìn)行混勻，離心后棄上清，沉淀用0-4℃預(yù)冷的無菌PBS溶解，獲得病毒濃縮液。

對于慢病毒感染NKT細(xì)胞的方法沒有特別限定，可以為本領(lǐng)域常用的各種方法，優(yōu)選情況下，該方法包括：取1×10⁷-5×10⁷個NKT細(xì)胞，棄掉舊的培養(yǎng)液，加入2-4mL新鮮GT-T551培養(yǎng)液，再加入200-400μL病毒濃縮液、2-4μL 1×10^-6mg/mL魚精蛋白和終濃度為800-1200U/mL的IL-2，置于30-37℃、飽和濕度為3-6％的CO₂培養(yǎng)箱中感染12-16h后，棄培養(yǎng)液，將細(xì)胞轉(zhuǎn)至未包被的培養(yǎng)瓶中，加入20-50mL的GT-T551培養(yǎng)基，再加入終濃度為800-1200U/mL的IL-2，于30-37℃、飽和濕度為3-6％的CO₂培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12-18h，獲得嵌合抗原受體HER1ScFv-CD8-CD137-CD3ζ修飾的NKT細(xì)胞。

進(jìn)一步優(yōu)選地，慢病毒感染NKT細(xì)胞的方法還包括：將上述培養(yǎng)后獲得的慢病毒感染的NKT細(xì)胞用IL-2的終濃度為800-1200U/mL的GT-T551培養(yǎng)液進(jìn)行體外誘導(dǎo)，待細(xì)胞的密度為80-90％時將細(xì)胞轉(zhuǎn)入細(xì)胞培養(yǎng)袋中，隔1.5-2.5天加入IL-2的終濃度為800-1200U/mL的新鮮GT-T551培養(yǎng)液進(jìn)行擴(kuò)增培養(yǎng)并將細(xì)胞擴(kuò)增至總量為1×10⁹-2×10⁹個細(xì)胞。

嵌合抗原受體HER1ScFv-CD8-CD137-CD3ζ修飾的NKT細(xì)胞表達(dá)的嵌合抗原受體的成熟蛋白氨基酸序列如SEQID NO.1所示。其中，本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)該理解的是，嵌合抗原受體前體蛋白由信號肽、HER1ScFv、CD8的hinge區(qū)和跨膜區(qū)、CD137的胞內(nèi)信號結(jié)構(gòu)域和CD3ζ的胞內(nèi)信號結(jié)構(gòu)域串聯(lián)構(gòu)成，蛋白質(zhì)翻譯后在細(xì)胞內(nèi)粗面型內(nèi)質(zhì)網(wǎng)切除信號肽后成為成熟嵌合抗原受體蛋白，分泌輸出后并定位于NKT細(xì)胞的細(xì)胞膜上。該嵌合抗原受體的成熟蛋白氨基酸序列對應(yīng)的基因編碼序列如SEQID NO.2所示。該嵌合抗原受體以基因CD8的hinge區(qū)和跨膜區(qū)及CD137和CD3ζ的胞內(nèi)信號結(jié)構(gòu)域串聯(lián)而成的結(jié)構(gòu)為信號傳導(dǎo)結(jié)構(gòu)域，其氨基酸序列如SEQID NO.9所示，對應(yīng)的基因編碼序列如SEQID NO.10所示。

本發(fā)明還提供了上述方法制備得到的工程化HER1靶向性的NKT細(xì)胞。

本發(fā)明還提供了工程化HER1靶向性的NKT細(xì)胞在制備用于治療腫瘤的制劑中的應(yīng)用。優(yōu)選情況下，腫瘤是指進(jìn)展期HER1陽性肺癌，尤其為復(fù)發(fā)難治的進(jìn)展期HER1陽性肺癌。

本發(fā)明提供了治療癌癥等疾病的組合物和方法。該癌癥可為實體瘤、原發(fā)腫瘤或轉(zhuǎn)移性腫瘤或血液學(xué)惡性腫瘤。優(yōu)選地，該癌癥為HER1陽性的腫瘤，和更優(yōu)選地，該腫瘤為肺癌。利用本發(fā)明的組合物和方法可治療的其他疾病包括病毒、細(xì)菌和寄生蟲感染以及自身免疫疾病。

NKT細(xì)胞

自然殺傷細(xì)胞(NKT)是一種特殊類型的T淋巴細(xì)胞亞群，具有T細(xì)胞和NK細(xì)胞兩重性質(zhì)。NKT細(xì)胞能表達(dá)T細(xì)胞的TCR與NK細(xì)胞的NKR-P1兩種受體，在TCR和NKR介導(dǎo)下，NKT細(xì)胞能夠產(chǎn)生大量的IL-4及INFγ，對腫瘤細(xì)胞發(fā)揮細(xì)胞殺傷作用。NKT細(xì)胞通過自身表面的CD16與特異性抗體的Fc段結(jié)合，發(fā)揮ADCC(antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity)作用。

NKT細(xì)胞的功能主要包括免疫調(diào)節(jié)和細(xì)胞毒作用，NKT細(xì)胞受到刺激后，可以分泌大量的IL-4,IFN-γ，GM-CSF,IL-13和其它細(xì)胞因子和趨化因子，發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用，NKT細(xì)胞是聯(lián)系固有免疫和獲得性免疫的橋梁之一。NKT細(xì)胞活化后具有NK細(xì)胞樣細(xì)胞毒活性，可溶解NK細(xì)胞敏感的靶細(xì)胞，主要效應(yīng)分子為穿孔素，F(xiàn)as配體以及IFN-γ。

但在抗體依賴的細(xì)胞介導(dǎo)的殺傷作用過程中，由于抗體能與靶細(xì)胞上的相應(yīng)抗原表位特異性結(jié)合，NKT細(xì)胞可殺傷任何已與抗體結(jié)合的靶細(xì)胞，因此抗體與靶細(xì)胞上的抗原結(jié)合是特異性的，但NKT細(xì)胞對靶細(xì)胞的殺傷作用是非特異性的。

NKT細(xì)胞的制備方法

本領(lǐng)域中已存在已知的NKT細(xì)胞、T細(xì)胞的制備方法，以及活化和擴(kuò)增方法，例如可以分別參考文獻(xiàn)：Motohashi,S.,Nagato,K.,Kunii,N.,Yamamoto,H.,Yamasaki,K.,Okita,K.,Hanaoka,H.,Shimizu,N.,Suzuki,M.,Yoshino,I.,Taniguchi,M.,Fujisawa,T.and Nakayama,T.,A phase I-II study of alpha-galactosylceramide-pulsed IL-2/GM-CSF-cultured peripheral blood mononuclear cells in patients with advanced and recurrent non-small cell lung cancer.J Immunol2009.182:2492-2501；D.L.Porter,B.L.Levine,M.Kalos,A.Bagg,C.H.June,Chimeric antigen receptor-modified T cells in chronic lymphoid leukemia,The New England journal of medicine,2011.365:725-733.

在本發(fā)明的一個較佳的實施方式中，改良的制備NKT細(xì)胞的方法如下。

(1)取人靜脈血于含肝素的真空管中。采用淋巴細(xì)胞分離液，通過密度梯度離心方法分離獲得單個核細(xì)胞(PBMCs)。

(2)PBMCs洗三次后，采用含有0.6體積％的人自體血清的NKT細(xì)胞培養(yǎng)基GT-T551調(diào)整細(xì)胞終濃度為2×10⁶個細(xì)胞/mL；將細(xì)胞接種于預(yù)先經(jīng)過終濃度為10μg/mL的retronectin包被的75cm²細(xì)胞培養(yǎng)瓶中。然后在培養(yǎng)基里加入終濃度為500U/mL的重組人白介素2，50ng/ml CD3單克隆抗體，50ng/mL的重組人白介素-15，在37℃、飽和濕度為5％的CO₂培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

(3)培養(yǎng)第4天，將細(xì)胞轉(zhuǎn)移至未包被的培養(yǎng)瓶中，并每2-3天按照細(xì)胞生長狀況加入培養(yǎng)液，及人重組IL-2濃度為500U/ml；第12-16天，得到NKT細(xì)胞，流式細(xì)胞術(shù)對NKT細(xì)胞表型進(jìn)行分析。

采用本發(fā)明方法制得的NKT細(xì)胞群中，CD3+CD8+NKT細(xì)胞/CD3+CD4+NKT細(xì)胞的比率為10/1～4/1(優(yōu)選為9/1～6/1)；并且CD3+CD56+NKT細(xì)胞/CD3+CD8+NKT細(xì)胞的比率為1/18～10/18(優(yōu)選為5/18～10/18)。

并且NKT細(xì)胞群中，CD3+細(xì)胞比率≥95％；CD3⁺CD8⁺細(xì)胞比率≥90.99％；CD3⁺CD56⁺細(xì)胞比率≥15％(優(yōu)選地，≥18％；更優(yōu)選地≥20％；最優(yōu)選地≥22％，如≥24％、≥26％、≥28％、≥30％)；CD8⁺CD56⁺細(xì)胞比率≥15％(優(yōu)選地，≥18％；更優(yōu)選地≥20％；最優(yōu)選地≥22％，如≥24％、≥26％、≥28％、≥30％)。。

NKT細(xì)胞的細(xì)胞表型為CD3+和CD56+，表達(dá)T細(xì)胞受體(TCR)的可變區(qū)基因和天然殺傷(NK)細(xì)胞表面標(biāo)記NK1·1(NKR-P1C)，兼具有T淋巴細(xì)胞強(qiáng)大的抗瘤活性和NK細(xì)胞的非MHC限制性殺瘤優(yōu)點。在殺傷發(fā)面，彌補(bǔ)了T細(xì)胞MHC限制性的局限性，殺瘤譜、殺傷能力都大大優(yōu)于T細(xì)胞。

與傳統(tǒng)T細(xì)胞不同，NKT細(xì)胞是一群兼具NK功能和T細(xì)胞特點的特殊免疫細(xì)胞。NKT細(xì)胞具有高度保守的TCR表型(TCRVα24/Vβ11-人),同時共表達(dá)NK細(xì)胞特有標(biāo)志CD161，它不識別由經(jīng)典的MHC-Ⅰ或Ⅱ類分子遞呈的肽類抗原,而是識別由非經(jīng)典的MHC-Ⅰ類分子呈遞的糖脂類分子抗原。NKT細(xì)胞識別由CD1d分子提呈的特異糖脂分子,并能夠分泌大量細(xì)胞因子,參與機(jī)體的先天性免疫和獲得性免疫反應(yīng)。目前，多項研究證實NKT細(xì)胞在抗腫瘤免疫、抗感染免疫、自身免疫病、免疫調(diào)節(jié)中發(fā)揮了重要作用，許多生理病理過程均有NKT細(xì)胞的參與。

傳統(tǒng)的T細(xì)胞在體外存活時間比較短暫，而根據(jù)本發(fā)明的NKT細(xì)胞在體外存活時間較久，能夠貼壁感染，感染率高。而T細(xì)胞感染效率低，而且感染后的T細(xì)胞死亡率也高。

嵌合抗原受體

本發(fā)明提供了包括細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域、跨膜結(jié)構(gòu)域、和細(xì)胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域的嵌合抗原受體(CAR)。胞外結(jié)構(gòu)域包括靶-特異性結(jié)合元件(也稱為抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域)。細(xì)胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域包括共刺激信號傳導(dǎo)區(qū)和ζ鏈部分。共刺激信號傳導(dǎo)區(qū)指包括共刺激分子的細(xì)胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域的一部分。共刺激分子為淋巴細(xì)胞對抗原的有效應(yīng)答所需要的細(xì)胞表面分子，而不是抗原受體或它們的配體。

在CAR的胞外結(jié)構(gòu)域和跨膜結(jié)構(gòu)域之間，或在CAR的胞漿結(jié)構(gòu)域和跨膜結(jié)構(gòu)域之間，可并入接頭。如本文所用的，術(shù)語“接頭”通常指起到將跨膜結(jié)構(gòu)域連接至多肽鏈的胞外結(jié)構(gòu)域或胞漿結(jié)構(gòu)域作用的任何寡肽或多肽。接頭可包括0-300個氨基酸，優(yōu)選地2至100個氨基酸和最優(yōu)選地3至50個氨基酸。

在本發(fā)明的一個較佳的實施方式中，本發(fā)明提供了經(jīng)過基因工程改造以表達(dá)CAR的細(xì)胞(例如，T細(xì)胞、NKT細(xì)胞)，其顯示顯著的抗腫瘤性質(zhì)。本發(fā)明的CAR還可以包括胞外結(jié)構(gòu)域，所述胞外結(jié)構(gòu)域具有融合至T細(xì)胞抗原受體復(fù)合物ζ鏈(例如，CD3ζ)的細(xì)胞內(nèi)信號傳導(dǎo)結(jié)構(gòu)域的抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域。本發(fā)明的CAR當(dāng)在NKT細(xì)胞中表達(dá)時，能夠基于抗原結(jié)合特異性改變抗原識別。示例性抗原為HER1，因為該抗原在肺癌細(xì)胞上表達(dá)。然而，本發(fā)明不限于靶向HER1。相反地，本發(fā)明包括任何抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域，當(dāng)其結(jié)合其關(guān)聯(lián)抗原時，影響腫瘤細(xì)胞，導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞不生長、被促使死亡或以其他方式被影響，并導(dǎo)致患者的腫瘤負(fù)荷縮小或消除?？乖Y(jié)合結(jié)構(gòu)域優(yōu)選與來自共刺激分子和ζ鏈中的一個或多個的細(xì)胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域融合。優(yōu)選地，抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域與CD137(4-1BB)信號傳導(dǎo)結(jié)構(gòu)域、和CD3ζ信號結(jié)構(gòu)域組合的細(xì)胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域融合。

在一個實施方式中，本發(fā)明的CAR包括包含本發(fā)明特定信號傳導(dǎo)結(jié)構(gòu)域(CD8的hinge區(qū)和跨膜區(qū)、CD137和CD3ζ的胞內(nèi)信號結(jié)構(gòu)域串聯(lián)而成)。，與其他方式的CAR相比，本發(fā)明的信號傳導(dǎo)結(jié)構(gòu)域顯著增加了抗腫瘤活性和CART細(xì)胞的體內(nèi)持久性。

抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域

在一個實施方式中，本發(fā)明的CAR包括被稱為抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域的靶-特異性結(jié)合元件?？乖Y(jié)合結(jié)構(gòu)域的選擇取決于限定靶細(xì)胞表面的配體的類型和數(shù)目。例如，可選擇抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域，以識別用作與具體疾病狀態(tài)相關(guān)的靶細(xì)胞上的細(xì)胞表面標(biāo)記的配體。因此，細(xì)胞表面標(biāo)記的例子包括與病毒、細(xì)菌和寄生蟲感染，自身免疫疾病和癌細(xì)胞相關(guān)的那些標(biāo)記。

在本發(fā)明的內(nèi)容中，“腫瘤抗原”指由引起免疫應(yīng)答特別是T-細(xì)胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答的腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生的蛋白質(zhì)。本發(fā)明的抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域的選擇將取決于待治療癌癥的具體類型。腫瘤抗原在本領(lǐng)域中是公知的，并包括但并不限于：HER1、CD19、神經(jīng)膠質(zhì)瘤相關(guān)的抗原、癌胚抗原(CEA)、β-人絨毛膜促性腺素、α-胎蛋白(AFP)、凝集素-反應(yīng)的AFP、甲狀腺球蛋白、RAGE-1、MN-CA IX、人端粒酶反轉(zhuǎn)錄酶、RU1、RU2(AS)、腸羧酸酯酶、mut hsp70-2、M-CSF、前列腺酶、前列腺-特異性抗原(PSA)、PAP、NY-ESO-1、LAGE-la、p53、prostein、PSMA、Her2/neu、 存活素和端粒酶、前列腺-癌腫瘤抗原-1(PCTA-1)、MAGE、ELF2M、中性白細(xì)胞彈性蛋白酶、ephrinB2、CD22、胰島素生長因子(IGF)-I、IGF-II、IGF-I受體和間皮素。

在一個實施方式中，腫瘤抗原包括與惡性腫瘤相關(guān)的一個或多個抗原癌癥表位。惡性腫瘤表達(dá)可用作免疫攻擊的靶抗原的許多蛋白。這些分子包括但不限于組織-特異性抗原諸如MART-1、黑素瘤中的酪氨酸酶和GP100、和前列腺癌中的前列腺酸性磷酸酶(PAP)和前列腺-特異性抗原(PSA)。其他靶分子屬于轉(zhuǎn)化相關(guān)分子諸如致癌基因HER-2/Neu/ErbB-2。而另一組的靶抗原為胎性癌抗原諸如癌胚抗原(CEA)。在B-細(xì)胞淋巴瘤中，腫瘤-特異性個體基因型免疫球蛋白構(gòu)成對個體腫瘤唯一的真正的腫瘤-特異性免疫球蛋白抗原。B-細(xì)胞分化抗原諸如CD19、CD20和CD37是B-細(xì)胞淋巴瘤中靶抗原的其他候選物。這些抗原中的一些(CEA、HER-2、CD19、CD20、個體基因型)已經(jīng)有限成功地用作利用單克隆抗體的被動免疫療法的標(biāo)靶。

在本發(fā)明優(yōu)選的實施方式中，所述抗原包括：HER1、CD19、CD20、CD30等。

本發(fā)明中提及的該類型腫瘤抗原也可為腫瘤-特異性抗原(TSA)或腫瘤相關(guān)抗原(TAA)。TSA為對腫瘤細(xì)胞唯一的，并不發(fā)生在身體的其他細(xì)胞上。TAA相關(guān)的抗原不是對腫瘤細(xì)胞唯一的，并且相反，其在不能誘導(dǎo)對抗原的免疫耐受狀態(tài)的病癥下，也在正常細(xì)胞上進(jìn)行表達(dá)。腫瘤上的抗原表達(dá)可在使免疫系統(tǒng)能夠響應(yīng)抗原的病癥下發(fā)生。TAA可為在胚胎發(fā)育期間，當(dāng)免疫系統(tǒng)不成熟并且不能響應(yīng)時，在正常細(xì)胞上表達(dá)的抗原，或它們可為在正常細(xì)胞上以極低的水平正常存在的抗原，但其在腫瘤細(xì)胞上以高得多的水平進(jìn)行表達(dá)。

TSA或TAA抗原的非限制性例子包括以下：分化抗原諸如MART-l/MelanA(MART-1)、gp100(Pmel17)、酪氨酸酶、TRP-1、TRP-2和腫瘤-特異性多譜系抗原諸如MAGE-1、MAGE-3、BAGE、GAGE-1、GAGE-2、p15；過表達(dá)的胚胎抗原諸如CEA；過表達(dá)的致癌基因和突變的腫瘤-抑制基因諸如p53、Ras、HER-2/neu；由染色體易位產(chǎn)生的獨特的腫瘤抗原諸如BCR-ABL、E2A-PRL、H4-RET、1GH-IGK、MYL-RAR；和病毒抗原，諸如Epstein

Barr病毒抗原EBVA和人乳頭瘤病毒(HPV)抗原E6和E7。其他大的、基于蛋白的抗原包括TSP-180、MAGE-4、MAGE-5、MAGE-6、RAGE、NY-ESO、p185erbB2、p180erbB-3、c-met、nm-23H1、PSA、TAG-72、CA19-9、CA72-4、CAM17.1、NuMa、K-ras、β-聯(lián)蛋白、CDK4、Mum-1、p15、p16、43-9F、5T4、791Tgp72、α-胎蛋白、β-HCG、BCA225、BTAA、CA125、CA15-3\CA27.29\BCAA、CA195、CA242、CA-50、CAM43、CD68\P1、CO-029、FGF-5、G250、Ga733\EpCAM、HTgp-175、M344、MA-50、MG7-Ag、MOV18、NB/70K、NY-CO-1、RCAS1、SDCCAG16、TA-90\Mac-2結(jié)合蛋白\親環(huán)蛋白C相關(guān)蛋白、TAAL6、TAG72、TLP和TPS。

在優(yōu)選的實施方式中，CAR的抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域靶向某一抗原，所述抗原包括但不限于HER1、CD19、CD20、CD22、CD30、RORl、間皮素、CD33/IL3Ra、c-Met、PSMA、糖脂F(xiàn)77、EGFRvIII、GD-2、MY-ESO-1TCR、MAGE A3TCR等等。

取決于待靶向的期望抗原，本發(fā)明的CAR可被工程改造以包括對期望抗原靶特異性的適當(dāng)?shù)目乖Y(jié)合結(jié)構(gòu)域。例如，如果HER1是待靶向的期望抗原，則HER1的抗體可用作抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域，并入本發(fā)明的CAR。

在一個實施方式中，本發(fā)明的CAR的抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域靶向HER1。優(yōu)選地，本發(fā)明的CAR中的抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域為抗-HER1scFV(single—chain antibody fragment，scFv)，其中抗-HER1scFV的核酸序列包括SEQ ID NO:7中提出的序列。在一個實施方式中，抗-HER1scFV包括編碼SEQ ID NO:20的氨基酸序列的核酸序列。在另一個實施方式中，本發(fā)明的CAR的抗-HER1scFV如SEQ ID NO:20所示。

LPLMAQVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGGTFSSYAISWVRQAPGQGLEWMGGIIPIFGTANYAQKFQGRVTITADESTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARTRLKHQWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGSALSSELTQDPAVSVALGQTVRITCQGDSLRSYYASWYQQKPGQAPVLVIYGKNNRPSGIPDRFSGSSSGNTASLTITGAQAEDEADYYCNSRDSSGPVFGGGTKLTVLGAAA(SEQ ID NO.:20)。

絞鏈區(qū)和跨膜區(qū)

對于絞鏈區(qū)和跨膜區(qū)(跨膜結(jié)構(gòu)域)，CAR可被設(shè)計以包括融合至CAR的胞外結(jié)構(gòu)域的跨膜結(jié)構(gòu)域。在一個實施方式中，使用天然與CAR中的結(jié)構(gòu)域之一相關(guān)聯(lián)的跨膜結(jié)構(gòu)域。在一些例子中，可選擇跨膜結(jié)構(gòu)域，或通過氨基酸置換進(jìn)行修飾，以避免將這樣的結(jié)構(gòu)域結(jié)合至相同或不同的表面膜蛋白的跨膜結(jié)構(gòu)域，從而最小化與受體復(fù)合物的其他成員的相互作用。

跨膜結(jié)構(gòu)域可源于天然來源或合成來源。在天然來源中，該結(jié)構(gòu)域可源于任何膜結(jié)合蛋白或跨膜蛋白。具體用于本發(fā)明的跨膜區(qū)可源于T-細(xì)胞受體的α、β或ζ鏈、CD28、CD3ε、CD45、CD4、CD5、CD8、CD9、CD16、CD22、CD33、CD37、CD64、CD80、CD86、CD134、CD137、CD154(即至少包括上述中的跨膜區(qū)(一個或多個))。

優(yōu)選地，本發(fā)明的CAR中的絞鏈區(qū)和跨膜區(qū)為CD8的絞鏈區(qū)和跨膜區(qū)。在一個實施方式中，編碼CD8的絞鏈區(qū)和跨膜區(qū)的核苷酸序列包括SEQ ID NO:3的核酸序列。在本發(fā)明的一個優(yōu)選的實施方式中，CD8的絞鏈區(qū)和跨膜區(qū)包括以下氨基酸序列：

LSNSIMYFSHFVPVFLPAKPTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYC(SEQ ID NO.:17)

胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域

本發(fā)明的CAR的胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域或另外的細(xì)胞內(nèi)信號傳導(dǎo)結(jié)構(gòu)域是造成其中已放置CAR的免疫細(xì)胞的至少一種正常效應(yīng)子功能的活化的原因。術(shù)語“效應(yīng)子功能”指的是細(xì)胞的專有功能。例如，T細(xì)胞的效應(yīng)子功能可為包括細(xì)胞因子分泌的細(xì)胞溶解活性或輔助活性。因此術(shù)語“細(xì)胞內(nèi)信號傳導(dǎo)結(jié)構(gòu)域”指的是轉(zhuǎn)導(dǎo)效應(yīng)子功能信號并指導(dǎo)細(xì)胞實施專有功能的蛋白部分。盡管通?？墒褂谜麄€細(xì)胞內(nèi)信號傳導(dǎo)結(jié)構(gòu)域，但在很多例子中，不必使用整個鏈。就使用細(xì)胞內(nèi)信號傳導(dǎo)結(jié)構(gòu)域的截短部分而言，這種截短部分可用于代替完整的鏈，只要它轉(zhuǎn)導(dǎo)效應(yīng)子功能信 號。術(shù)語細(xì)胞內(nèi)信號傳導(dǎo)結(jié)構(gòu)域因此指包括足以轉(zhuǎn)導(dǎo)效應(yīng)子功能信號的細(xì)胞內(nèi)信號傳導(dǎo)結(jié)構(gòu)域的任何截短部分。

用于本發(fā)明的CAR的細(xì)胞內(nèi)信號傳導(dǎo)結(jié)構(gòu)域的優(yōu)選例子包括T細(xì)胞受體(TCR)的胞漿序列和協(xié)同行動以在抗原受體結(jié)合后開始信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的共受體，以及這些序列的任何衍生物或變體和具有相同的功能能力的任何合成序列。

已知通過TCR單獨產(chǎn)生的信號不足以完全活化T細(xì)胞，并且也需要次級或共刺激信號。因此，T細(xì)胞活化可被認(rèn)為由兩個不同類的胞漿信號傳導(dǎo)序列介導(dǎo)：通過TCR(初級胞漿信號傳導(dǎo)序列)開始抗原-依賴性初級活化的那些和以抗原-非依賴性方式起作用以提供次級或共刺激信號(次級胞漿信號傳導(dǎo)序列)的那些。

初級胞漿信號傳導(dǎo)序列以刺激方式或以抑制方式調(diào)節(jié)TCR復(fù)合物的初級活化。以刺激方式起作用的初級胞漿信號傳導(dǎo)序列可包含信號傳導(dǎo)基序，其已知為基于免疫受體酪氨酸的活化基序或ITAM。

包含在本發(fā)明中具有具體用途的初級胞漿信號傳導(dǎo)序列的ITAM的例子包括源于TCRζ、FcRγ、FcRβ、CD3γ、CD3δ、CD3ε、CD5、CD22、CD79a、CD79b和CD66d的那些。特別優(yōu)選地，本發(fā)明的CAR中的胞漿信號傳導(dǎo)分子包括源于CD3ζ的胞漿信號傳導(dǎo)序列。

在優(yōu)選的實施方式中，CAR的胞漿結(jié)構(gòu)域可被設(shè)計以本身包括CD3-ζ信號傳導(dǎo)結(jié)構(gòu)域，或可與在本發(fā)明的CAR的內(nèi)容中有用的任何其他期望的胞漿結(jié)構(gòu)域(一個或多個)聯(lián)合。例如，CAR的胞漿結(jié)構(gòu)域可包括CD3ζ鏈部分和共刺激信號傳導(dǎo)區(qū)。共刺激信號傳導(dǎo)區(qū)指的是包括共刺激分子的細(xì)胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域的一部分CAR。共刺激分子是淋巴細(xì)胞對抗原的有效應(yīng)答所需的細(xì)胞表面分子，而不是抗原受體或它們的配體。這種分子的例子包括CD27、CD28、4-1BB(CD137)、OX40、CD30、CD40、PD-1、ICOS、淋巴細(xì)胞功能相關(guān)抗原-1(LFA-1)、CD2、CD7、LIGHT、

NKG2C、B7-H3和與CD83特異性結(jié)合的配體等等。因此，盡管本發(fā)明主要以4-1BB作為共刺激信號傳導(dǎo)元件的例子，但其他共刺激元件也位于本發(fā)明的范圍內(nèi)。

本發(fā)明的CAR的胞漿信號傳導(dǎo)部分內(nèi)的胞漿信號傳導(dǎo)序列可以隨機(jī)或以規(guī)定的順序相互連接。任選地，短的寡肽或多肽連接體，優(yōu)選長度在2和10個氨基酸，可形成該連接。甘氨酸-絲氨酸雙聯(lián)體提供了特別合適的連接體。

在一個實施方式中，胞漿結(jié)構(gòu)域被設(shè)計以包括CD3ζ的信號傳導(dǎo)結(jié)構(gòu)域和CD28的信號傳導(dǎo)結(jié)構(gòu)域。在另一個實施方式中，胞漿結(jié)構(gòu)域被設(shè)計以包括CD3ζ的信號傳導(dǎo)結(jié)構(gòu)域和CD137的信號傳導(dǎo)結(jié)構(gòu)域。

在一個實施方式中，本發(fā)明的CAR中的胞漿結(jié)構(gòu)域被設(shè)計以包括CD137的信號傳導(dǎo)結(jié)構(gòu)域和CD3ζ的信號傳導(dǎo)結(jié)構(gòu)域，其中CD137的信號傳導(dǎo)結(jié)構(gòu)域包括SEQ ID NO:4中提出的核酸序列和CD3-ζ的信號傳導(dǎo)結(jié)構(gòu)域包括SEQ ID NO:5中提出的核酸序列。

在一個實施方式中，本發(fā)明的CAR中的胞漿結(jié)構(gòu)域被設(shè)計以包括CD137的信號傳導(dǎo)結(jié)構(gòu)域和CD3ζ的信號傳導(dǎo)結(jié)構(gòu)域，其中CD137的信號傳導(dǎo)結(jié)構(gòu)域包括編碼SEQ ID NO:18的氨基酸序列的核酸序列，和CD3ζ的信號傳導(dǎo)結(jié)構(gòu)域包括編碼SEQ ID NO:19的氨基酸序列的核酸序列。

在一個實施方式中，本發(fā)明的CAR中的胞漿結(jié)構(gòu)域被設(shè)計以包括CD137的信號傳導(dǎo)結(jié)構(gòu)域和CD3ζ的信號傳導(dǎo)結(jié)構(gòu)域，其中CD137的信號傳導(dǎo)結(jié)構(gòu)域包括SEQ ID NO:18中提出的氨基酸序列，和CD3ζ的信號傳導(dǎo)結(jié)構(gòu)域包括SEQ ID NO:19中提出的氨基酸序列。

優(yōu)選地，CD137的胞內(nèi)信號結(jié)構(gòu)域包含如下氨基酸序列：

KRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCEL(SEQ ID NO.:18)

優(yōu)選地，CD3ζ的胞內(nèi)信號結(jié)構(gòu)域包含如下氨基酸序列：

RVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR(SEQ ID NO.:19)

載體

本發(fā)明包括包含CAR序列的DNA構(gòu)建體，其中該序列包括可操作地連接至信號傳導(dǎo)結(jié)構(gòu)域的核酸序列的抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域的核酸序列?？捎糜诒景l(fā)明的CAR的示例性的信號傳導(dǎo)結(jié)構(gòu)域包括抗-HER1scFv、CD8鉸鏈和跨膜區(qū)、和CD137和CD3ζ胞內(nèi)信號傳導(dǎo)結(jié)構(gòu)域。在一個實施方式中，本發(fā)明的CAR包括SEQ ID NO:10中提出的核酸序列。在另一個實施方式中，本發(fā)明的CAR包括編碼SEQ ID NO:9的氨基酸序列的核酸序列。在另一個實施方式中，本發(fā)明的CAR包括SEQ ID NO:9中提出的氨基酸序列。

編碼期望分子的核酸序列可利用在本領(lǐng)域中已知的重組方法獲得，諸如例如通過從表達(dá)基因的細(xì)胞中篩選文庫，通過從已知包括該基因的載體中得到該基因，或通過利用標(biāo)準(zhǔn)的技術(shù)，從包含該基因的細(xì)胞和組織中直接分離。可選地，感興趣的基因可被合成生產(chǎn)。

本發(fā)明也提供了其中插入本發(fā)明的DNA的載體。源于逆轉(zhuǎn)錄病毒諸如慢病毒的載體是實現(xiàn)長期基因轉(zhuǎn)移的合適工具，因為它們允許轉(zhuǎn)基因長期、穩(wěn)定的整合并且其在子細(xì)胞中增殖。慢病毒載體具有超過源自致癌逆轉(zhuǎn)錄病毒諸如鼠科白血病病毒的載體的優(yōu)點，因為它們可轉(zhuǎn)導(dǎo)非增殖的細(xì)胞，諸如肝細(xì)胞。它們也具有低免疫原性的優(yōu)點。

簡單概括，通常通過可操作地連接編碼CAR多肽或其部分的核酸至啟動子，并將構(gòu)建體并入表達(dá)載體，實現(xiàn)編碼CAR的天然或合成核酸的表達(dá)。該載體適合于復(fù)制和整合真核細(xì)胞。典型的克隆載體包含可用于調(diào)節(jié)期望核酸序列表達(dá)的轉(zhuǎn)錄和翻譯終止子、初始序列和啟動子。

本發(fā)明的表達(dá)構(gòu)建體也可利用標(biāo)準(zhǔn)的基因傳遞方案，用于核酸免疫和基因療法。基因傳遞的方法在本領(lǐng)域中是已知的。見例如美國專利號5,399,346、5,580,859、5,589,466，在此通過引用全文并入。在另一個實施方式中，本發(fā)明提供了基因療法載體。

該核酸可被克隆入許多類型的載體。例如，該核酸可被克隆入如此載體，其包括但不限于質(zhì)粒、噬菌粒、噬菌體衍生物、動物病毒和粘粒。特定的感興趣載體包括表達(dá)載體、復(fù)制載體、探針產(chǎn)生載體和測序載體。

進(jìn)一步地，表達(dá)載體可以以病毒載體形式提供給細(xì)胞。病毒載體技術(shù)在本領(lǐng) 域中是公知的并在例如Sambrook等(2001,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory,New York)和其他病毒學(xué)和分子生物學(xué)手冊中進(jìn)行了描述?？捎米鬏d體的病毒包括但不限于逆轉(zhuǎn)錄病毒、腺病毒、腺伴隨病毒、皰疹病毒和慢病毒。通常，合適的載體包含在至少一種有機(jī)體中起作用的復(fù)制起點、啟動子序列、方便的限制酶位點和一個或多個可選擇的標(biāo)記(例如，WO01/96584；WO01/29058；和美國專利號6,326,193)。

已經(jīng)開發(fā)許多基于病毒的系統(tǒng)，用于將基因轉(zhuǎn)移入哺乳動物細(xì)胞。例如，逆轉(zhuǎn)錄病毒提供了用于基因傳遞系統(tǒng)的方便的平臺。可利用在本領(lǐng)域中已知的技術(shù)將選擇的基因插入載體并包裝入逆轉(zhuǎn)錄病毒顆粒。該重組病毒可隨后被分離和傳遞至體內(nèi)或離體的對象細(xì)胞。許多逆轉(zhuǎn)錄病毒系統(tǒng)在本領(lǐng)域中是已知的。在一些實施方式中，使用腺病毒載體。許多腺病毒載體在本領(lǐng)域中是已知的。在一個實施方式中，使用慢病毒載體。

額外的啟動子元件，例如增強(qiáng)子，可以調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄開始的頻率。通常地，這些位于起始位點上游的30-110bp區(qū)域中，盡管最近已經(jīng)顯示許多啟動子也包含起始位點下游的功能元件。啟動子元件之間的間隔經(jīng)常是柔性的，以便當(dāng)元件相對于另一個被倒置或移動時，保持啟動子功能。在胸苷激酶(tk)啟動子中，啟動子元件之間的間隔可被增加隔開50bp，活性才開始下降。取決于啟動子，表現(xiàn)出單個元件可合作或獨立地起作用，以起動轉(zhuǎn)錄。

合適的啟動子的一個例子為即時早期巨細(xì)胞病毒(CMV)啟動子序列。該啟動子序列為能夠驅(qū)動可操作地連接至其上的任何多核苷酸序列高水平表達(dá)的強(qiáng)組成型啟動子序列。合適的啟動子的另一個例子為延伸生長因子-1α(EF-1α)。然而，也可使用其他組成型啟動子序列，包括但不限于類人猿病毒40(SV40)早期啟動子、小鼠乳癌病毒(MMTV)、人免疫缺陷病毒(HIV)長末端重復(fù)(LTR)啟動子、MoMuLV啟動子、鳥類白血病病毒啟動子、艾伯斯坦-巴爾(Epstein-Barr)病毒即時早期啟動子、魯斯氏肉瘤病毒啟動子、以及人基因啟動子，諸如但不限于肌動蛋白啟動子、肌球蛋白啟動子、血紅素啟動子和肌酸激酶啟動子。進(jìn)一步地，本發(fā)明不應(yīng)被限于組成型啟動子的應(yīng)用。誘導(dǎo)型啟動子也被考慮為本發(fā)明的一部分。誘導(dǎo)型啟動子的使用提供了分子開關(guān)，其能夠當(dāng)這樣的表達(dá)是期望的時，打開可操作地連接誘導(dǎo)型啟動子的多核苷酸序列的表達(dá)，或當(dāng)表達(dá)是不期望的時關(guān)閉表達(dá)。誘導(dǎo)型啟動子的例子包括但不限于金屬硫蛋白啟動子、糖皮質(zhì)激素啟動子、孕酮啟動子和四環(huán)素啟動子。

為了評估CAR多肽或其部分的表達(dá)，被引入細(xì)胞的表達(dá)載體也可包含可選擇的標(biāo)記基因或報道基因中的任一個或兩者，以便于從通過病毒載體尋求被轉(zhuǎn)染或感染的細(xì)胞群中鑒定和選擇表達(dá)細(xì)胞。在其他方面，可選擇的標(biāo)記可被攜帶在單獨一段DNA上并用于共轉(zhuǎn)染程序。可選擇的標(biāo)記和報道基因兩者的側(cè)翼都可具有適當(dāng)?shù)恼{(diào)節(jié)序列，以便能夠在宿主細(xì)胞中表達(dá)。有用的可選擇標(biāo)記包括例如抗生素抗性基因，諸如neo等等。

報道基因用于鑒定潛在轉(zhuǎn)染的細(xì)胞并用于評價調(diào)節(jié)序列的功能性。通常地，報道基因為以下基因：其不存在于受體有機(jī)體或組織或由受體有機(jī)體或組織進(jìn)行表達(dá)，并且其編碼多肽，該多肽的表達(dá)由一些可容易檢測的性質(zhì)例如酶活性清楚 表示。在DNA已經(jīng)被引入受體細(xì)胞后，報道基因的表達(dá)在合適的時間下進(jìn)行測定。合適的報道基因可包括編碼熒光素酶、β-半乳糖苷酶、氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶、分泌型堿性磷酸酶或綠色螢光蛋白基因的基因(例如，Ui-Tei等，2000FEBS Letters479:79-82)。合適的表達(dá)系統(tǒng)是公知的并可利用已知技術(shù)制備或從商業(yè)上獲得。通常，顯示最高水平的報道基因表達(dá)的具有最少5個側(cè)翼區(qū)的構(gòu)建體被鑒定為啟動子。這樣的啟動子區(qū)可被連接至報道基因并用于評價試劑調(diào)節(jié)啟動子-驅(qū)動轉(zhuǎn)錄的能力。

將基因引入細(xì)胞和將基因表達(dá)入細(xì)胞的方法在本領(lǐng)域中是已知的。在表達(dá)載體的內(nèi)容中，載體可通過在本領(lǐng)域中的任何方法容易地引入宿主細(xì)胞，例如，哺乳動物、細(xì)菌、酵母或昆蟲細(xì)胞。例如，表達(dá)載體可通過物理、化學(xué)或生物學(xué)手段轉(zhuǎn)移入宿主細(xì)胞。

將多核苷酸引入宿主細(xì)胞的物理方法包括磷酸鈣沉淀、脂質(zhì)轉(zhuǎn)染法、粒子轟擊、微注射、電穿孔等等。生產(chǎn)包括載體和/或外源核酸的細(xì)胞的方法在本領(lǐng)域中是公知的。見例如Sambrook等(2001,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory,New York)。將多核苷酸引入宿主細(xì)胞的優(yōu)選方法為磷酸鈣轉(zhuǎn)染。

將感興趣的多核苷酸引入宿主細(xì)胞的生物學(xué)方法包括使用DNA和RNA載體。病毒載體，特別是逆轉(zhuǎn)錄病毒載體，已經(jīng)成為最廣泛使用的將基因插入哺乳動物例如人細(xì)胞的方法。其他病毒載體可源自慢病毒、痘病毒、單純皰疹病毒I、腺病毒和腺伴隨病毒等等。見例如美國專利號5,350,674和5,585,362。

將多核苷酸引入宿主細(xì)胞的化學(xué)手段包括膠體分散系統(tǒng)，諸如大分子復(fù)合物、納米膠囊、微球、珠；和基于脂質(zhì)的系統(tǒng)，包括水包油乳劑、膠束、混合膠束和脂質(zhì)體。用作體外和體內(nèi)傳遞工具(delivery vehicle)的示例性膠體系統(tǒng)為脂質(zhì)體(例如，人造膜囊)。

在使用非病毒傳遞系統(tǒng)的情況下，示例性傳遞工具為脂質(zhì)體?？紤]使用脂質(zhì)制劑，以將核酸引入宿主細(xì)胞(體外、離體(ex vivo)或體內(nèi))。在另一方面，該核酸可與脂質(zhì)相關(guān)聯(lián)。與脂質(zhì)相關(guān)聯(lián)的核酸可被封裝入脂質(zhì)體的水性內(nèi)部中，散布在脂質(zhì)體的脂雙層內(nèi)，經(jīng)與脂質(zhì)體和寡核苷酸兩者都相關(guān)聯(lián)的連接分子附接至脂質(zhì)體，陷入脂質(zhì)體，與脂質(zhì)體復(fù)合，分散在包含脂質(zhì)的溶液中，與脂質(zhì)混合，與脂質(zhì)聯(lián)合，作為懸浮液包含在脂質(zhì)中，包含在膠束中或與膠束復(fù)合，或以其他方式與脂質(zhì)相關(guān)聯(lián)。與組合物相關(guān)聯(lián)的脂質(zhì)、脂質(zhì)/DNA或脂質(zhì)/表達(dá)載體不限于溶液中的任何具體結(jié)構(gòu)。例如，它們可存在于雙分子層結(jié)構(gòu)中，作為膠束或具有“坍縮的(collapsed)”結(jié)構(gòu)。它們也可簡單地被散布在溶液中，可能形成大小或形狀不均一的聚集體。脂質(zhì)為脂肪物質(zhì)，其可為天然發(fā)生或合成的脂質(zhì)。例如，脂質(zhì)包括脂肪小滴，其天然發(fā)生在細(xì)胞質(zhì)以及包含長鏈脂肪族烴和它們的衍生物諸如脂肪酸、醇類、胺類、氨基醇類和醛類的該類化合物中。

在本發(fā)明的一個優(yōu)選地實施方式中，所述載體為慢病毒載體，更優(yōu)選地為pWPT-GFP慢病毒載體。本發(fā)明人研究證實，使用該慢病毒載體構(gòu)建本發(fā)明CAR，對NKT細(xì)胞的轉(zhuǎn)染效率較高，且具有高度的可重復(fù)性。

在本發(fā)明的一個優(yōu)選地實施方式中，所述載體中還包括信號肽序列。優(yōu)選地，所述信號肽序列連接在所述抗原結(jié)核結(jié)構(gòu)域核酸序列的上游。

優(yōu)選地，所述信號肽為大鼠生長激素信號肽；更優(yōu)選的，所述大鼠生長激素信號肽的核酸序列如SEQ ID NO.:6所示。本發(fā)明人在研究中，意外地發(fā)現(xiàn)，在本發(fā)明的載體為慢病毒載體時，使用大鼠生長激素信號肽能夠顯著提高包含本發(fā)明CAR的慢病毒載體對NKT細(xì)胞的轉(zhuǎn)染效率。

治療性應(yīng)用

本發(fā)明包括用慢病毒載體(LV)轉(zhuǎn)導(dǎo)的細(xì)胞(例如，NKT細(xì)胞、T細(xì)胞)。例如，LV編碼將特異性抗體的抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域與CD3-ζ、CD137組合的細(xì)胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域聯(lián)合的CAR。因此，在一些例子中，轉(zhuǎn)導(dǎo)的NKT細(xì)胞可引起CAR-介導(dǎo)的NKT-細(xì)胞應(yīng)答。

因此，本發(fā)明也提供了刺激對哺乳動物的靶細(xì)胞群或組織的NKT細(xì)胞-介導(dǎo)的免疫應(yīng)答的方法，其包括以下步驟：施用給哺乳動物表達(dá)CAR的NKT細(xì)胞，其中CAR包括特異性地與預(yù)定標(biāo)靶相互作用的結(jié)合部分，包括例如人CD3ζ的細(xì)胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域的ζ鏈部分，和共刺激信號傳導(dǎo)區(qū)。

在一個實施方式中，本發(fā)明包括一類細(xì)胞療法，其中NKT細(xì)胞被基因修飾以表達(dá)CAR，和CAR-NKT細(xì)胞被注入需要其的接受者中。注入的細(xì)胞能夠殺死接受者的腫瘤細(xì)胞。不像抗體療法，CAR-NKT細(xì)胞能夠體內(nèi)復(fù)制，產(chǎn)生可導(dǎo)致持續(xù)腫瘤控制的長期持久性。

在一個實施方式中，本發(fā)明的CAR-NKT細(xì)胞可經(jīng)歷穩(wěn)固的體內(nèi)NKT細(xì)胞擴(kuò)展并可持續(xù)延長的時間量。另外，CAR介導(dǎo)的免疫應(yīng)答可為過繼免疫療法步驟的一部分，其中CAR-修飾NKT細(xì)胞誘導(dǎo)對CAR中的抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域特異性的免疫應(yīng)答。例如，抗HER1CAR-NKT細(xì)胞引起抗表達(dá)HER1的細(xì)胞的特異性免疫應(yīng)答。

盡管本文公開的數(shù)據(jù)具體公開了包括抗-HER1scFv、CD8鉸鏈和跨膜區(qū)、和CD137和CD3ζ信號傳導(dǎo)結(jié)構(gòu)域的慢病毒載體，但本發(fā)明應(yīng)被解釋為包括對構(gòu)建體組成部分中的每一個的任何數(shù)量的變化。

可治療的癌癥包括沒有被血管化或基本上還沒有被血管化的腫瘤，以及血管化的腫瘤。癌癥可包括非實體瘤(諸如血液學(xué)腫瘤，例如白血病和淋巴瘤)或可包括實體瘤。用本發(fā)明的CAR治療的癌癥類型包括但不限于癌、胚細(xì)胞瘤和肉瘤，和某些白血病或淋巴惡性腫瘤、良性和惡性腫瘤、和惡性瘤，例如肉瘤、癌和黑素瘤。也包括成人腫瘤/癌癥和兒童腫瘤/癌癥。

血液學(xué)癌癥為血液或骨髓的癌癥。血液學(xué)(或血原性)癌癥的例子包括白血病，包括急性白血病(諸如急性淋巴細(xì)胞白血病、急性髓細(xì)胞白血病、急性骨髓性白血病和成髓細(xì)胞性、前髓細(xì)胞性、粒-單核細(xì)胞型、單核細(xì)胞性和紅白血病)、慢性白血病(諸如慢性髓細(xì)胞(粒細(xì)胞性)白血病、慢性骨髓性白血病和慢性淋巴細(xì)胞白血病)、真性紅細(xì)胞增多癥、淋巴瘤、霍奇金氏疾病、非霍奇金氏淋巴瘤(無痛和高等級形式)、多發(fā)性骨髓瘤、瓦爾登斯特倫氏巨球蛋白血癥、重鏈疾病、骨髓增生異常綜合征、多毛細(xì)胞白血病和脊髓發(fā)育不良。

實體瘤為通常不包含囊腫或液體區(qū)的組織的異常腫塊。實體瘤可為良性或惡 性的。不同類型的實體瘤以形成它們的細(xì)胞類型命名(諸如肉瘤、癌和淋巴瘤)。實體瘤諸如肉瘤和癌的例子包括纖維肉瘤、粘液肉瘤、脂肪肉瘤間皮瘤、淋巴惡性腫瘤、胰腺癌卵巢癌、。

在一個實施方式中，本發(fā)明的CAR的抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域被設(shè)計以治療具體的癌癥。例如，被設(shè)計以靶向HER1的CAR可用于治療癌癥和紊亂，包括但不限于肺癌等。

在一個實施方式中，癌癥和紊亂包括但不限于前-BALL(兒童指征)，成人ALL、套細(xì)胞淋巴瘤、擴(kuò)散大B-細(xì)胞淋巴瘤、同種骨髓移植后的補(bǔ)救等等，其可利用靶向CD19、CD20、CD22和ROR1的CAR的組合進(jìn)行治療。

在一個實施方式中，CAR可被設(shè)計以靶向間皮素，來治療間皮瘤、胰腺癌、卵巢癌等等。

在一個實施方式中，CAR可被設(shè)計以靶向CD33/IL3Ra，來治療急性骨髓性白血病等等。

然而，本發(fā)明不應(yīng)被解釋為僅限于本文公開的抗原標(biāo)靶和疾病。相反地，本發(fā)明應(yīng)被解釋為包括任何與可使用CAR治療的疾病相關(guān)的抗原標(biāo)靶。

本發(fā)明的CAR-修飾T細(xì)胞也可用作對哺乳動物離體免疫和/或體內(nèi)療法的疫苗類型。優(yōu)選地，哺乳動物為人。

對于離體免疫，以下中的至少一項在將細(xì)胞施用進(jìn)入哺乳動物前在體外發(fā)生：i)擴(kuò)展細(xì)胞，ii)將編碼CAR的核酸引入細(xì)胞，和/或iii)冷凍保存細(xì)胞。

離體程序在本領(lǐng)域中是公知的，并在以下更完全地進(jìn)行討論。簡單地說，細(xì)胞從哺乳動物(優(yōu)選人)中分離并用表達(dá)本文公開的CAR的載體進(jìn)行基因修飾(即，體外轉(zhuǎn)導(dǎo)或轉(zhuǎn)染)。CAR-修飾的細(xì)胞可被施用給哺乳動物接受者，以提供治療益處。哺乳動物接受者可為人，和CAR-修飾的細(xì)胞可相對于接受者為自體的?？蛇x地，細(xì)胞可相對于接受者為同種異基因的、同基因的(syngeneic)或異種的。

在此通過引用并入的在美國專利號5,199,942中描述的造血干細(xì)胞和祖細(xì)胞的離體擴(kuò)展程序，可被應(yīng)用至本發(fā)明的細(xì)胞。其他合適的方法在本領(lǐng)域中是已知的，因此本發(fā)明不限于細(xì)胞離體擴(kuò)展的任何具體方法。簡單地說，T細(xì)胞的離體培養(yǎng)和擴(kuò)展包括：(1)從外周血收獲物或骨髓外植體收集來自哺乳動物的CD34+造血干細(xì)胞和祖細(xì)胞；和(2)離體擴(kuò)展這樣的細(xì)胞。除了美國專利號5,199,942中描述的細(xì)胞生長因子，其他因子諸如flt3-L、IL-1、IL-3和c-kit配體，也可用于培養(yǎng)和擴(kuò)展細(xì)胞。

除了就離體免疫而言使用基于細(xì)胞的疫苗之外，本發(fā)明也提供了體內(nèi)免疫以引起針對患者中抗原的免疫應(yīng)答的組合物和方法。

通常地，如本文所述活化和擴(kuò)展的細(xì)胞可用于治療和預(yù)防無免疫應(yīng)答的個體中產(chǎn)生的疾病。特別地，本發(fā)明的CAR-修飾的T細(xì)胞用于治療CCL。在某些實施方式中，本發(fā)明的細(xì)胞用于治療處于形成CCL風(fēng)險中的患者。因此，本發(fā)明提供了治療或預(yù)防CCL的方法，其包括施用給需要其的對象治療有效量的本發(fā)明的CAR-修飾的T細(xì)胞。

本發(fā)明的CAR-修飾的T細(xì)胞可被單獨施用或作為藥物組合物與稀釋劑和/或 與其他組分諸如IL-2或其他細(xì)胞因子或細(xì)胞群結(jié)合施用。簡單地說，本發(fā)明的藥物組合物可包括如本文所述的靶細(xì)胞群，與一種或多種藥學(xué)或生理學(xué)上可接受載體、稀釋劑或賦形劑結(jié)合。這樣的組合物可包括緩沖液諸如中性緩沖鹽水、硫酸鹽緩沖鹽水等等；碳水化合物諸如葡萄糖、甘露糖、蔗糖或葡聚糖、甘露醇；蛋白質(zhì)；多肽或氨基酸諸如甘氨酸；抗氧化劑；螯合劑諸如EDTA或谷胱甘肽；佐劑(例如，氫氧化鋁)；和防腐劑。本發(fā)明的組合物優(yōu)選配制用于靜脈內(nèi)施用。

本發(fā)明的藥物組合物可以以適于待治療(或預(yù)防)的疾病的方式施用。施用的數(shù)量和頻率將由這樣的因素確定，如患者的病癥、和患者疾病的類型和嚴(yán)重度——盡管適當(dāng)?shù)膭┝靠捎膳R床試驗確定。

當(dāng)指出“免疫學(xué)上有效量”、“抗腫瘤有效量”、“腫瘤-抑制有效量”或“治療量”時，待施用的本發(fā)明組合物的精確量可由醫(yī)師確定，其考慮患者(對象)的年齡、重量、腫瘤大小、感染或轉(zhuǎn)移程度和病癥的個體差異?？赏ǔＶ赋觯喊ū疚拿枋龅腡細(xì)胞的藥物組合物可以以10⁴至10⁹個細(xì)胞/kg體重的劑量，優(yōu)選10⁵至10⁶個細(xì)胞/kg體重的劑量(包括那些范圍內(nèi)的所有整數(shù)值)施用。T細(xì)胞組合物也可以以這些劑量多次施用。細(xì)胞可通過使用免疫療法中公知的注入技術(shù)(見例如Rosenberg等，NewEng.J.of Med.319:1676，1988)施用。對于具體患者的最佳劑量和治療方案可通過監(jiān)測患者的疾病跡象并因此調(diào)節(jié)治療由醫(yī)學(xué)領(lǐng)域技術(shù)人員容易地確定。

對象組合物的施用可以以任何方便的方式進(jìn)行，包括通過噴霧法、注射、吞咽、輸液、植入或移植。本文描述的組合物可被皮下、皮內(nèi)、瘤內(nèi)、結(jié)內(nèi)、脊髓內(nèi)、肌肉內(nèi)、通過靜脈內(nèi)(i.v.)注射或腹膜內(nèi)施用給患者。在一個實施方式中，本發(fā)明的NKT細(xì)胞組合物通過皮內(nèi)或皮下注射被施用給患者。在另一個實施方式中，本發(fā)明的NKT細(xì)胞組合物優(yōu)選通過i.v.注射施用。NKT細(xì)胞的組合物可被直接注入腫瘤，淋巴結(jié)或感染位置。

在本發(fā)明的某些實施方式中，利用本文描述的方法或本領(lǐng)域已知的其他將NKT細(xì)胞擴(kuò)展至治療性水平的方法活化和擴(kuò)展的細(xì)胞，與任何數(shù)量的有關(guān)治療形式結(jié)合(例如，之前、同時或之后)施用給患者，所述治療形式包括但不限于用以下試劑進(jìn)行治療：所述試劑諸如抗病毒療法、西多福韋和白細(xì)胞介素-2、阿糖胞苷(也已知為ARA-C)或?qū)S患者的那他珠單抗治療或?qū)εＦぐ_患者的厄法珠單抗治療或?qū)ML患者的其他治療。在進(jìn)一步的實施方式中，本發(fā)明的NKT細(xì)胞可與以下結(jié)合使用：化療、輻射、免疫抑制劑，諸如，環(huán)孢菌素、硫唑嘌呤、甲氨喋呤、麥考酚酯和FK506，抗體或其他免疫治療劑。在進(jìn)一步的實施方式中，本發(fā)明的細(xì)胞組合物與骨髓移植、利用化療劑諸如氟達(dá)拉濱、外部光束放射療法(XRT)、環(huán)磷酰胺結(jié)合(例如，之前、同時或之后)而施用給患者。例如，在一個實施方式中，對象可經(jīng)歷高劑量化療的標(biāo)準(zhǔn)治療，之后進(jìn)行外周血干細(xì)胞移植。在一些實施方式中，在移植后，對象接受本發(fā)明的擴(kuò)展的免疫細(xì)胞的注入。在一個額外的實施方式中，擴(kuò)展的細(xì)胞在外科手術(shù)前或外科手術(shù)后施用。

施用給患者的以上治療的劑量將隨著治療病癥的精確屬性和治療的接受者而變化。人施用的劑量比例可根據(jù)本領(lǐng)域接受的實踐實施。通常，每次治療或每個療程，可將1×10⁶個至1×10¹⁰個本發(fā)明經(jīng)修飾的NKT細(xì)胞(如，CARHER1-NKT 細(xì)胞)，通過例如靜脈回輸?shù)姆绞?，施用于患者?/p>

本發(fā)明的優(yōu)點包括：

1、本發(fā)明首次構(gòu)建了一種對腫瘤具有顯著殺傷效果的表達(dá)嵌合抗原受體的NKT細(xì)胞，并且該NKT細(xì)胞具有調(diào)節(jié)Car-T細(xì)胞群內(nèi)的免疫平衡狀態(tài)的功能；

2、傳統(tǒng)的表達(dá)嵌合抗原受體的T細(xì)胞在體外存活時間比較短暫，而本發(fā)明的表達(dá)嵌合抗原受體的NKT細(xì)胞在體外存活時間較久，而且能夠貼壁感染，感染效率高。而T細(xì)胞感染效率低，而且感染后的T細(xì)胞死亡率也高。

3、本發(fā)明的嵌合抗原受體，以CD8的絞鏈區(qū)和跨膜區(qū)及CD137和CD3ζ的胞內(nèi)信號結(jié)構(gòu)域串聯(lián)而成的結(jié)構(gòu)為信號傳導(dǎo)結(jié)構(gòu)域，能夠保持對NKT細(xì)胞的高效轉(zhuǎn)染，并且在NKT細(xì)胞內(nèi)能夠高效表達(dá)；

4、與傳統(tǒng)的表達(dá)嵌合抗原受體的T細(xì)胞相比，本發(fā)明的表達(dá)嵌合抗原受體的NKT細(xì)胞具有顯著更高的體外溶瘤活性；

5、本發(fā)明的表達(dá)嵌合抗原受體的NKT細(xì)胞回輸至患者體內(nèi)，在外周血和骨髓中可以大量擴(kuò)增，并且可以不依賴于白介素2而持續(xù)長久的存在。

實施例

以下的實施例將對本發(fā)明作進(jìn)一步的說明，但并不因此限制本發(fā)明。

以下實施例中的實驗方法，如無特殊說明，均為本領(lǐng)域常規(guī)方法。下述實施例中所用的實驗材料，如無特殊說明，均為自常規(guī)生化試劑商店購買得到，其中：

NKT細(xì)胞培養(yǎng)基GT-T551購自TaKaRa公司。

淋巴細(xì)胞分離液購自TBD公司。

CD3單克隆抗體、重組纖維連接蛋白(retronectin)均購自TaKaRa公司。

重組人蛋白干擾素-γ、重組人白介素2購自protech公司。

總RNA提取試劑盒RNAiso Reagent、高保真DNA聚合酶(HS DNA Polymerase)、T4DNA連接酶購自TaKaRa公司。

RevertAid^TMFirst Strand cDNA Synthesis Kit購自Fermentas公司。

BglⅡ、EcoRI、MluI、BamHI、SalI、EcoRⅤ購自Fermentas公司。

修飾酶Klenow Fragment購自Fermentas公司。

瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒、普通DNA產(chǎn)物純化試劑盒、質(zhì)粒小提試劑盒均購自天根生化科技有限公司。

pWPT-GFP、psPAX2、pMD2.G均購自Addgene公司。

pGSI購自北京天一輝遠(yuǎn)生物科技有限公司。

Trans1-T1 Phage Resistant化學(xué)感受態(tài)細(xì)胞購自北京全式金生物技術(shù)有限公司。

Lipofectamine^TM 2000Transfection Reagent轉(zhuǎn)染試劑購自Invitrogen公司。

293T包裝細(xì)胞購自美國ATCC。

PEG6000-NaCl中PEG6000終濃度為25.5質(zhì)量％，NaCl終濃度為1.2M，PEG6000和NaCl均購自上海索萊寶生物科技有限公司。

胎牛血清購自德國PAA公司。

高表達(dá)HER1的人肺腺癌細(xì)胞A549購自美國ATCC。

Cell Counting Kit-8(CCK8)試劑盒購自北京沃比森科技有限公司。

所有引物均由北京天一輝遠(yuǎn)生物科技有限公司合成。

實施例1 NKT細(xì)胞的制備

1.1制備NKT細(xì)胞

(1)取人靜脈血于含肝素的真空管中。采用淋巴細(xì)胞分離液，通過密度梯度離心方法分離獲得單個核細(xì)胞(PBMCs)。

(2)PBMCs洗三次后，采用含有0.6體積％的胎牛血清的NKT細(xì)胞培養(yǎng)基GT-T551調(diào)整細(xì)胞終濃度為2×10⁶個細(xì)胞/mL；將細(xì)胞接種于預(yù)先經(jīng)過終濃度為5μg/mL CD3單克隆抗體及終濃度為10μg/mL的retronectin包被的75cm²細(xì)胞培養(yǎng)瓶中。然后在培養(yǎng)基里加入終濃度為1000U/mL的重組人蛋白干擾素-γ和1000U/mL的重組人白介素2，在37℃、飽和濕度為5％的CO₂培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

(3)第四天，向培養(yǎng)瓶中補(bǔ)加100mL含有0.6體積％的胎牛血清的NKT細(xì)胞培養(yǎng)基GT-T551，并加入終濃度為1000U/mL的重組人白介素2。于37℃、飽和濕度為5％的CO₂培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4天，得到NKT細(xì)胞，流式細(xì)胞術(shù)對NKT細(xì)胞表型進(jìn)行分析。結(jié)果表明，其中CD3⁺：92.80％；CD3⁺CD4⁺:28.25％；CD3⁺CD8⁺:67.11％；CD3⁺CD56⁺:6.51％；CD8⁺CD56⁺:6.00％。

1.2改良的制備NKT細(xì)胞方法

(1)取人靜脈血于含肝素的真空管中。采用淋巴細(xì)胞分離液，通過密度梯度離心方法分離獲得單個核細(xì)胞(PBMCs)。

(2)PBMCs洗三次后，采用含有0.6體積％的人自體血清的NKT細(xì)胞培養(yǎng)基GT-T551調(diào)整細(xì)胞終濃度為2×10⁶個細(xì)胞/mL；將細(xì)胞接種于預(yù)先經(jīng)過終濃度為10μg/mL的retronectin包被的75cm²細(xì)胞培養(yǎng)瓶中。然后在培養(yǎng)基里加入終濃度為500U/mL的重組人白介素2，50ng/ml CD3單克隆抗體，50ng/mL的重組人白介素-15，在37℃、飽和濕度為5％的CO₂培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

(3)培養(yǎng)第4天，將細(xì)胞轉(zhuǎn)移至未包被的培養(yǎng)瓶中，并每2-3天按照細(xì)胞生長狀況加入培養(yǎng)液，及人重組IL-2濃度為500U/ml；第12-16天，得到NKT細(xì)胞，流式細(xì)胞術(shù)對NKT細(xì)胞表型進(jìn)行分析。

結(jié)果見圖1，其中，各類型細(xì)胞比例如下：

CD3⁺：95.04％；CD3⁺CD8⁺：90.99％；CD3⁺CD56⁺：24.12％；CD8⁺CD56⁺：24.63％。

CD3⁺CD8⁺NKT細(xì)胞/CD3⁺CD4⁺NKT細(xì)胞的比率為4/1；并且CD3⁺CD56⁺NKT細(xì)胞/CD3⁺CD8⁺NKT細(xì)胞的比率為約0.27。

本實施例的結(jié)果說明，采用本發(fā)明的改良的方法制備的NKT細(xì)胞，CD3⁺CD8⁺-CAR/CD3⁺CD4⁺-CAR比率較高，以及CD3⁺CD56⁺-CAR/CD3⁺CD8⁺-CAR比率與普通體外擴(kuò)增的T細(xì)胞相比，有明顯的提高，有助于提高體外溶瘤和體內(nèi)殺瘤活性，對調(diào)節(jié)CART細(xì)胞群內(nèi)的免疫平衡狀態(tài)，都有顯著優(yōu)勢。

實施例2 慢病毒表達(dá)載體pWPT-HER1ScFv-CD8-CD137-CD3ζ的構(gòu)建

(1)NKT細(xì)胞cDNA的制備

離心沉淀實施例1培養(yǎng)得到的NKT細(xì)胞，用總RNA提取試劑盒RNAiso Reagent提取細(xì)胞的總RNA，-80℃保存?zhèn)溆?。提取的總RNA用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒RevertAid^TMFirst Strand cDNA Synthesis Kit逆轉(zhuǎn)錄得NKT細(xì)胞cDNA，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

(2)慢病毒質(zhì)粒pWPT-CD8-CD137-CD3ζ的制備

設(shè)計并合成如下引物序列(其中，下劃線標(biāo)記為保護(hù)堿基，方框為酶切位點)：

以步驟(1)中NKT細(xì)胞cDNA為模板，用引物P1和P2進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到長287bp的CD8的hinge區(qū)和跨膜區(qū)，核苷酸序列如SEQID NO.3所示，兩端分別含有MluI和BglⅡ酶切位點和保護(hù)堿基；用引物P3和P4進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到長146bp的CD137胞內(nèi)信號結(jié)構(gòu)域，核苷酸序列如SEQID NO.4所示，兩端分別含有BglⅡ和EcoRI酶切位點及保護(hù)堿基；用引物P5和P6進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到長359bp的CD3ζ的胞內(nèi)信號結(jié)構(gòu)域，核苷酸序列如SEQID NO.5所示，兩端分別含有EcoRI和SalI酶切位點及保護(hù)堿基。各步PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系相同，以擴(kuò)增CD137胞內(nèi)信號結(jié)構(gòu)域為例，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR反應(yīng)條件參照HS DNA Polymerase的說明書，反應(yīng)體系(50μL)如下：

雙蒸水：32.5μL

5×反應(yīng)buffer：10μL

dNTP混合物(每種2.5mM)：4μL

P3(10mM):1μL

P4(10mM):1μL

NKT細(xì)胞cDNA(200ng/ul)：1μL

HS DNA Polymerase：0.5μL

將上述PCR產(chǎn)物用1％的瓊脂糖凝膠進(jìn)行分離，用瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒進(jìn)行DNA片段回收。得到片段后分別進(jìn)行雙酶切反應(yīng)，酶切產(chǎn)物用普通DNA產(chǎn)物純化試劑盒回收備用。

慢病毒表達(dá)載體pWPT-GFP用MluI/SalI雙酶切，酶切產(chǎn)物經(jīng)1％的瓊脂糖 凝膠進(jìn)行分離，用瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒回收大的載體片段，然后與之前回收的CD8、CD137、CD3ζ片段通過T4DNA連接酶連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化Trans1-T1 Phage Resistant化學(xué)感受態(tài)細(xì)胞，37℃培養(yǎng)16h后挑取單克隆，37℃，250rpm培養(yǎng)12h后用質(zhì)粒小提試劑盒提取質(zhì)粒。提取的質(zhì)粒經(jīng)限制性內(nèi)切酶MluI和SalI雙酶切鑒定，鑒定電泳圖見圖2，其中，1泳道：DNA分子量標(biāo)記D2000；2泳道：質(zhì)粒pWPT-GFP的酶切片段(835bp)；3泳道：質(zhì)粒pWPT-CD8-CD137-CD3ζ的酶切片段(756bp)。將鑒定正確的質(zhì)粒送北京天一輝遠(yuǎn)生物科技有限公司對插入的融合基因片段進(jìn)行測序。將測序結(jié)果正確的重組質(zhì)粒命名為pWPT-CD8-CD137-CD3ζ。

(3)慢病毒質(zhì)粒pWPT-HER1ScFv-CD8-CD137-CD3ζ的制備

全基因合成編碼大鼠生長激素信號肽和HER1ScFv融合基因的核苷酸序列，序列如SEQID NO.8所示，由北京天一輝遠(yuǎn)生物科技有限公司合成，其5’端含有EcoRⅤ酶切位點、kozak序列，3’端含有MluI酶切位點，將前述融合基因克隆在質(zhì)粒pGSI中，命名為pGSI-HER1ScFv。質(zhì)粒經(jīng)EcoR Ⅴ/MluI雙酶切，酶切產(chǎn)物經(jīng)1％瓊脂糖凝膠進(jìn)行分離，用瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒回收目的片段備用。

pWPT-CD8-CD137-CD3ζ質(zhì)粒經(jīng)限制性內(nèi)切酶BamHI單酶切，再用Klenow Fragment酶平頭，然后進(jìn)行MluI單酶切，酶切產(chǎn)物經(jīng)1％瓊脂糖凝膠進(jìn)行分離，用瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒回收載體片段備用。然后與回收有大鼠生長激素信號肽和HER1 ScFv的DNA片段通過T4DNA連接酶進(jìn)行連接，具體方法見說明書。將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化Trans1-T1 Phage Resistant化學(xué)感受態(tài)細(xì)胞，37℃培養(yǎng)16h后挑取單克隆，37℃，250rpm培養(yǎng)12h后，用質(zhì)粒小提試劑盒提取質(zhì)粒。提取的質(zhì)粒經(jīng)限制性內(nèi)切酶BamHI/SalI雙酶切鑒定，鑒定結(jié)果如圖3所示，其中，M1：DNA分子量標(biāo)記D15000；1泳道：質(zhì)粒pWPT-HER1ScFv-CD8-CD137-CD3ζ的酶切片段(920bp)；2泳道：質(zhì)粒pWPT-CD8-CD137-CD3ζ的酶切片段(774bp)；3泳道：質(zhì)粒pWPT-GFP的酶切片段(853bp)；M2：DNA分子量標(biāo)記D2000。將鑒定正確的質(zhì)粒送北京天一輝遠(yuǎn)生物科技有限公司對插入的融合基因片段進(jìn)行測序。將測序結(jié)果正確的重組質(zhì)粒命名為pWPT-HER1ScFv-CD8-CD137-CD3ζ，其結(jié)構(gòu)示意圖如圖4所示，其中包括大鼠生長激素信號肽(核苷酸序列如SEQID NO.6所示)、抗HER1單鏈抗體(核苷酸序列如SEQID NO.7所示)、CD8的hinge區(qū)和跨膜區(qū)及CD137的胞內(nèi)信號結(jié)構(gòu)域和CD3ζ的胞內(nèi)信號結(jié)構(gòu)域，其中，該嵌合抗原受體以基因CD8的hinge區(qū)和跨膜區(qū)及CD137和CD3ζ的胞內(nèi)信號結(jié)構(gòu)域串聯(lián)而成的結(jié)構(gòu)為信號傳導(dǎo)結(jié)構(gòu)域，其氨基酸序列如SEQID NO.9所示，對應(yīng)的基因編碼序列如SEQID NO.10所示。

實施例3 嵌合抗原受體HER1ScFv-CD8-CD137-CD3ζ修飾的NKT細(xì)胞的制備

(1)慢病毒的包裝和濃縮

用分光光度計分別測定慢病毒表達(dá)質(zhì)粒 pWPT-HER1ScFv-CD8-CD137-CD3ζ和輔助質(zhì)粒psPAX2、pMD2.G的濃度，三種質(zhì)粒以4:2:1的質(zhì)量比用Lipofectamine^TM2000 Transfection Reagent轉(zhuǎn)染試劑共轉(zhuǎn)染293T包裝細(xì)胞。分別在轉(zhuǎn)染48h、72h時收集病毒上清于50mL EP管中，4℃，2000g離心10min，轉(zhuǎn)移兩次得到的上清至新EP管中，用4.5μm濾器過濾病毒上清；過濾的病毒上清與5×PEG6000-NaCl按照4:1的體積比混勻，4℃靜置2h，然后4℃，10000g離心20min，棄上清，沉淀用1mL的4℃預(yù)冷的無菌PBS溶解，即得嵌合抗原受體的病毒濃縮液，按每管100μL進(jìn)行分裝，-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

按照上述方法，利用慢病毒表達(dá)質(zhì)粒pWPT-GFP和輔助質(zhì)粒psPAX2、pMD2.G共轉(zhuǎn)染293T包裝細(xì)胞，收集病毒上清，濃縮，獲得表達(dá)GFP綠色熒光蛋白的慢病毒濃縮液。

(2)慢病毒感染NKT細(xì)胞及感染后細(xì)胞的擴(kuò)增培養(yǎng)

取實施例1.2的在75cm²培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)的1×10⁷個NKT細(xì)胞，棄掉舊的培養(yǎng)液，加入2mL新鮮NKT細(xì)胞培養(yǎng)基GT-T551、200μL步驟(1)得到的病毒濃縮液、2μL 1×10^-6mg/mL魚精蛋白，終濃度為1000U/mL的重組人白介素2，置于37℃、飽和濕度為5％的CO₂培養(yǎng)箱中感染12小時后，棄培養(yǎng)液，得到的NKT細(xì)胞稱為CARHER1-NKT細(xì)胞。同時用表達(dá)GFP綠色熒光蛋白的慢病毒濃縮液對NKT細(xì)胞進(jìn)行同步感染(得到的NKT細(xì)胞稱為CART-GFP細(xì)胞)，用于計算該病毒的感染效率。將感染后的細(xì)胞轉(zhuǎn)至未經(jīng)CD3和retronectin包被的75cm²培養(yǎng)瓶中，加入20mL的NKT細(xì)胞培養(yǎng)基GT-T551，再加入終濃度為1000U/mL的重組人白介素2，于37℃、飽和濕度為5％的CO₂培養(yǎng)箱中培養(yǎng)18h。用流式細(xì)胞術(shù)檢測該病毒的感染效率，結(jié)果如圖5所示，感染效率為約74.64％。

而使用實施例1.1中制備的NKT細(xì)胞，進(jìn)行慢病毒感染，感染率約為41.20％。

(3)體外誘導(dǎo)擴(kuò)增CARHER1-NKT細(xì)胞群

將上述培養(yǎng)后的NKT細(xì)胞(采用實施例1.2方法制備)用重組人白介素2的終濃度為1000U/mL的NKT細(xì)胞培養(yǎng)基GT-T551進(jìn)行體外誘導(dǎo)，待細(xì)胞的密度為85％時將細(xì)胞轉(zhuǎn)入細(xì)胞培養(yǎng)袋中，隔2天加入重組人白介素2的終濃度為1000U/mL的新鮮NKT細(xì)胞培養(yǎng)基GT-T551進(jìn)行擴(kuò)增培養(yǎng)，待細(xì)胞擴(kuò)增到總量為1.5×10⁹個細(xì)胞左右后，采用流式細(xì)胞儀對感染的細(xì)胞群體進(jìn)行鑒定，細(xì)胞表型一般達(dá)到CD3陽性細(xì)胞比例＞90％；CD3CD8陽性細(xì)胞比例>70％；CD3CD56雙陽性細(xì)胞比例>5％，結(jié)果見圖6，CD3⁺:90.12％；CD3⁺CD8⁺:76.86％；CD3⁺CD56⁺:22.91％；CD8⁺CD56⁺:19.79％。

而采用相同的方法，基于實施例1.1制備的NKT細(xì)胞進(jìn)行體外誘導(dǎo)擴(kuò)增CARHER1-NKT細(xì)胞群中，CD3⁺:96.46％；CD3⁺CD4⁺:16.71％；CD3⁺CD8⁺:75.68％；CD3⁺CD56⁺:5.44％；CD8⁺CD56⁺:3.65％。

實施例4 CARHER1-NKT細(xì)胞對人肺癌細(xì)胞殺傷作用的細(xì)胞毒性分析

取高表達(dá)HER1的人肺腺癌細(xì)胞A549、乳腺癌細(xì)胞MCF-7和不表達(dá)HER1的卵巢癌細(xì)胞A2780，接種于96孔板，37℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)過夜后，分別取實施例3中制備的CARHER1-NKT細(xì)胞、CARHER1-T細(xì)胞(表達(dá)相同CARHER1的普通T細(xì)胞)、CART-GFP細(xì)胞和實施例1中培養(yǎng)的NKT細(xì)胞，以效靶比(殺傷細(xì)胞：靶細(xì)胞；E/T)2.5:1，5:1，10:1，20:1與A549進(jìn)行共培養(yǎng)，經(jīng)過4h的共培養(yǎng)后，每個孔加入10μL的CCK8進(jìn)行染色。同時設(shè)置殺傷細(xì)胞對照組分別為實施例3中制備的CARHER1-NKT細(xì)胞、CARHER1-T細(xì)胞、CART-GFP細(xì)胞和實施例1中培養(yǎng)的NKT細(xì)胞，并加入相同量的CCK8進(jìn)行染色；以及設(shè)置靶細(xì)胞對照組為未加入免疫細(xì)胞殺傷處理的人肺腺癌細(xì)胞A549，并加入相同量的CCK8進(jìn)行染色。酶標(biāo)儀對細(xì)胞凋亡情況進(jìn)行檢測，細(xì)胞凋亡的量根據(jù)下面的公式計算：凋亡率＝{1-[(實驗組-殺傷細(xì)胞對照組-靶細(xì)胞對照組)/實驗組]}×100％，該公式中，殺傷細(xì)胞對照組為只有殺傷細(xì)胞而未加靶細(xì)胞測得的吸光值，靶細(xì)胞對照組為只有靶細(xì)胞而未加殺傷細(xì)胞測得的吸光值；實驗組為加入相對應(yīng)的效靶比(殺傷細(xì)胞：靶細(xì)胞)的免疫細(xì)胞殺傷處理后測得的吸光值，見圖7。嵌合抗原受體HER1ScFv-CD8-CD137-CD3ζ修飾的NKT和T細(xì)胞對高表達(dá)HER1的肺癌細(xì)胞均具有顯著地特異殺傷活性，且CARHER1-NKT細(xì)胞的特異殺傷活性明顯優(yōu)于CARHER1-T細(xì)胞和NKT細(xì)胞。CARHER1-NKT細(xì)胞組的凋亡率高于CARHER1-T細(xì)胞組10％以上。

實施例5 CARHER1-NKT細(xì)胞對進(jìn)展期HER1陽性肺癌患者的治療效果

取5×10⁸個HER1ScFv-CD8-CD137-CD3ζ修飾的NKT細(xì)胞(即CARHER1-NKT細(xì)胞)，經(jīng)過100ml生理鹽水稀釋后，連續(xù)三天靜脈回輸?shù)揭褜ER1酪氨酸激酶抑制劑產(chǎn)生耐藥性的進(jìn)展期HER1陽性肺癌患者(4期肺癌患者，在利用本發(fā)明的CARHER1-NKT細(xì)胞進(jìn)行靶向免疫治療前，已經(jīng)過多次治療(如手術(shù)治療、放療、化療及HER1酪氨酸激酶抑制劑治療等)，但均無明顯療效)體內(nèi)，回輸后對患者的治療狀況進(jìn)行評估。

圖8為免疫組化檢測CARHER1-NKT細(xì)胞回輸?shù)揭褜ER1酪氨酸激酶抑制劑產(chǎn)生耐藥性的進(jìn)展期HER1陽性肺癌患者體內(nèi)后，患者同一病灶部位HER1陽性肺癌細(xì)胞數(shù)目的變化。對患者同一病灶部位穿刺標(biāo)本結(jié)果表明，與治療前相比，經(jīng)過靶向免疫細(xì)胞治療三個月后，患者體內(nèi)HER1陽性的肺癌細(xì)胞明顯減少，說明CARHER1-NKT細(xì)胞能夠?qū)σ褜ER1酪氨酸激酶抑制劑產(chǎn)生耐藥性的進(jìn)展期HER1陽性肺癌患者體內(nèi)的靶細(xì)胞發(fā)揮殺傷活性。

如圖9所示，CT分析CARHER1-NKT細(xì)胞治療已對HER1酪氨酸激酶抑制劑產(chǎn)生耐藥性的進(jìn)展期HER1陽性肺癌患者后，患者病灶部位的影像圖變化。影像圖結(jié)果表明，與治療前相比，靶向免疫細(xì)胞治療后患者多處病灶有所回縮；并且與治療后一個月相比，治療三個月后病灶減少更加明顯，同時患者的胸水也明顯的減少，說明CARHER1-NKT細(xì)胞治療能夠使已對HER1酪氨酸激酶抑制劑產(chǎn)生耐藥性的進(jìn)展期HER1陽性肺癌患者的疾病有所緩解。

實施例6 CARHER1-NKT細(xì)胞體外釋放白介素2的能力分析

取1×10⁶個HER1ScFv-CD8-CD137-CD3ζ修飾的NKT細(xì)胞(即CARHER1-NKT細(xì)胞)，HER1ScFv-CD8-CD137-CD3ζ修飾的T細(xì)胞(CAR HER1-T細(xì)胞)和實施例1.2中培養(yǎng)的NKT細(xì)胞接種于25厘米的細(xì)胞培養(yǎng)瓶進(jìn)行培養(yǎng)，并持續(xù)收集細(xì)胞上清，采用ELISA試劑盒分析細(xì)胞分泌白介素2的水平，結(jié)果見圖10。結(jié)果顯示與普通T細(xì)胞制備的CARHER1-T細(xì)胞相比，CARHER1-NKT細(xì)胞在體外能持續(xù)分泌白介素2細(xì)胞因子，具有獨特的非依賴IL-2性的擴(kuò)增能力，避免了臨床使用時體外補(bǔ)充IL-2。

以上詳細(xì)描述了本發(fā)明的優(yōu)選實施方式，但是，本發(fā)明并不限于上述實施方式中的具體細(xì)節(jié)，在本發(fā)明的技術(shù)構(gòu)思范圍內(nèi)，可以對本發(fā)明的技術(shù)方案進(jìn)行多種簡單變型，這些簡單變型均屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。

另外需要說明的是，在上述具體實施方式中所描述的各個具體技術(shù)特征，在不矛盾的情況下，可以通過任何合適的方式進(jìn)行組合，為了避免不必要的重復(fù)，本發(fā)明對各種可能的組合方式不再另行說明。

此外，本發(fā)明的各種不同的實施方式之間也可以進(jìn)行任意組合，只要其不違背本發(fā)明的思想，其同樣應(yīng)當(dāng)視為本發(fā)明所公開的內(nèi)容。