本發(fā)明涉及生物工程
技術領域：
，具體涉及一種蘇云金芽孢桿菌及其應用。
背景技術：
：原油是未經加工的石油，是天然有機物質經過地質變遷而形成的一種粘稠的黑色或深棕色的液體或固體，一般情況下大多存在于地下或海底，且?guī)в写碳ば詺馕叮饕煞质翘細湓咏Y合形成的鏈狀化合物，其對水體環(huán)境具有極大的危害。水環(huán)境中維持生命所需的最小溶解氧量約為2mg/L，石油或含油廢水排入水體后一方面會漂浮在水面上，阻隔氧氣的進入，影響氣體交換，另一方面部分靠石油提供碳源繁殖的微生物也會消耗氧氣，導致水中溶解氧的缺乏。同時又會使厭氧生物迅速繁殖使水體水質惡化。同時芳香烴類化合物產生的毒性也影響藻類的生長，進而對食物鏈造成影響。此外，石油中的有毒成分也會影響水生生物的生長繁殖，它會沾附在魚鰓上使其窒息死亡或影響其卵化，多環(huán)芳烴會破壞水生生物的內分泌系統(tǒng)，當存在極低的濃度的多環(huán)芳烴時，魚類都會產生魚臭味，直接影響了魚類的正常生存，嚴重破壞了水環(huán)境中水生生物的多樣性。目前，對石油污染的水體的修復技術主要有物理修復技術、化學修復技術、光催化修復技術和生物修復技術；生物修復技術是一個具有政策、經濟和技術吸引力的處理方法，被認為是最具發(fā)展?jié)摿Φ募夹g方法，并且逐步發(fā)展成為一種經濟效益和環(huán)境效益俱佳的、解決復雜環(huán)境污染問題的最有效的手段。技術實現(xiàn)要素：針對現(xiàn)有技術中存在的問題，本發(fā)明的目的在于提供一種可用于降解原油污染水體的蘇云金芽孢桿菌，將該菌種直接投加入污染水體中，達到較好的降解效果，實現(xiàn)原油污染的治理。為了達到上述目的，本發(fā)明采用以下技術方案予以實現(xiàn)。(一)一種蘇云金芽孢桿菌，已于2016年09月12日保藏于北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號中國科學院微生物研究所的中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏號為CGMCCNo.13005；命名為蘇云金芽孢桿菌(Bacillusthuringiensis)3-1。將所述蘇云金芽孢桿菌在牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基上培養(yǎng)，菌株3-1在牛肉膏蛋白胨的平板上呈圓形，邊緣呈鋸齒狀，中間凸起，乳黃色，表面光滑，濕潤。菌體為短桿狀，大小為(1.2-1.5)μm×(3-5)μm，革蘭氏染色呈現(xiàn)陽性。(二)一種蘇云金芽孢桿菌(Bacillusthuringiensis)3-1在降解原油污染水體中的應用。與現(xiàn)有技術相比，本發(fā)明的有益效果為：本發(fā)明提供的蘇云金芽孢桿菌不但易于規(guī)模化生產，而且降解效率高，環(huán)境適應性強。所提供的蘇云金芽孢桿菌能在大量有機物存在的條件下順利生長，以原油為碳源，達到較好的降解效果。該菌能在原油濃度達1mL/100mL的原油污染水體中體現(xiàn)出較優(yōu)的降解效果，實現(xiàn)原油污染水體的修復處理，在原油污染廢水的生物修復中展現(xiàn)了良好的應用前景。附圖說明下面結合附圖和具體實施例對本發(fā)明做進一步詳細說明。圖1為本發(fā)明的蘇云金芽孢桿菌(Bacillusthuringiensis)3-1在牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基平板上的菌落形態(tài)圖；圖2為本發(fā)明的蘇云金芽孢桿菌(Bacillusthuringiensis)3-1在顯微鏡下的的菌體形態(tài)圖，圖中，放大倍數(shù)為4000倍；圖3為本發(fā)明實施例3中I號原油的波長-吸光度曲線圖；圖中，橫坐標為波長，單位為nm，縱坐標為吸光度，單位為1；圖4為本發(fā)明實施例3中I號原油的標準曲線圖；圖中，橫坐標為濃度，單位為mg/L，縱坐標為吸光度，單位為1。具體實施方式下面將結合實施例對本發(fā)明的實施方案進行詳細描述，但是本領域的技術人員將會理解，下列實施例僅用于說明本發(fā)明，而不應視為限制本發(fā)明的范圍。實施例1菌株的分離純化(1)菌株來源本發(fā)明提供一種蘇云金芽孢桿菌(Bacillusthuringiensis)3-1，分離自延長石油集團的七里洞采油場集油站落地原油污染土壤中，土壤的理化性質為：銨態(tài)氮15.09ppm，硝態(tài)氮0.72ppm；氮含量15.81ppm，磷含量82.05ppm，鉀含量17.45ppm，有機質含量1.43％，pH為7.65。(2)菌株的分離純化將10g石油污染土壤樣品加入100mL富集液體培養(yǎng)基中，28℃、130r/min搖床培養(yǎng)7d。待培養(yǎng)液混濁后，吸取5mL培養(yǎng)液重新轉接入新鮮富集培養(yǎng)基中，與上述培養(yǎng)條件相同連續(xù)轉接富集培養(yǎng)3次。取1mL上述菌懸液，用無菌水系列稀釋后，分別接種于牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基中，29℃左右恒溫培養(yǎng)3d。其中，富集液體培養(yǎng)基的成分為：NaNO31.5g，(NH4)2SO41.5g，K2HPO41g，MgSO4·7H2O0.5g，KCl0.5g，F(xiàn)eSO4·7H2O0.01g，CaCl20.002g，蒸餾水1000mL，原油I號1％(體積比)，pH7.0。牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基的成分為：牛肉膏3.0g，蛋白胨10.0g，NaCl5.0g，營養(yǎng)瓊脂15.0g，蒸餾水1000mL，pH7.4-7.6。待平板菌落有效分離后，根據菌落顏色、形態(tài)特征及表面濕度的不同，分別用接種針挑選菌落進行平板劃線純化分離。將菌株接種于斜面，4℃冰箱冷藏備用。(3)溶油圈法篩選石油降解菌將上述純菌菌種接種于含油無機鹽固體培養(yǎng)基上，置于37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)10-15d，觀察有無嗜油圈，并根據嗜油圈直徑(D)與菌落直徑(d)的比值初步確定菌株的石油降解能力；其中，含油無機鹽固體培養(yǎng)基的成分為：NaNO31.5g，(NH4)2SO41.5g，K2HPO41g，MgSO4·7H2O0.5g，KCl0.5g，F(xiàn)eSO4·7H2O0.01g，CaCl20.002g，蒸餾水1000mL，原油1.5mL，pH7.0，pH值用1mol/L的氫氧化鈉或1mol/L氯化氫調至要求值。將初步篩選的石油降解菌接種于斜面培養(yǎng)基，4℃冰箱冷藏備用。實施例2菌株的鑒定(1)菌株的形態(tài)特征如圖1所示，將所述蘇云金芽孢桿菌在牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基上30℃恒溫培養(yǎng)24h后觀察菌落形態(tài)，菌株3-1在牛肉膏蛋白胨的平板上呈圓形，邊緣呈鋸齒狀，中間凸起，乳黃色，表面光滑，濕潤。如圖2所示，菌體為短桿狀，大小為(1.2-1.5)μm×(3-5)μm。(2)生化特性根據《伯杰氏細菌鑒定手冊》和《常見細菌系統(tǒng)鑒定手冊》對蘇云金芽孢桿菌進行生理生化鑒定，鑒定結果如表1所示。表1蘇云金芽孢桿菌3-1菌株的生理生化鑒定結果指標特性革蘭氏染色+葡糖糖+蔗糖+淀粉水解+酪素水解+M.P(甲基紅)試驗+硝酸鹽還原+產吲哚—V.P(乙酰甲基甲醇)試驗+過氧化氫酶+明膠水解+注：“—”表示反應為陰性；“+”表示反應為陽性(3)菌株的16SrDNA鑒定用DNA提取試劑盒提取蘇云金芽孢桿菌(Bacillusthuringiensis)3的基因組DNA，然后進行16SrDNA基因克隆、測序，其16SrDNA測序結果如SEQIDNo.1所示，具體如下：之后在GenBank中進行Blast比對，結果顯示，與其序列相似度達到98.56％均為蘇云金芽孢桿菌(Bacillusthuringiensis)，將其歸屬為單胞菌類并命名為蘇云金芽孢桿菌(Bacillusthuringiensis)3-1。實施例3蘇云金芽孢桿菌(Bacillusthuringiensis)3-1對原油污染水體的降解(1)蘇云金芽孢桿菌3-1菌懸液的制備在無菌條件下，挑取分離純化獲得的石油降解菌，接種于100mL的牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基中，搖床擴大培養(yǎng)48h；其中，牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基的成分是：牛肉膏3.0g，蛋白胨10.0g，NaCl5.0g，營養(yǎng)瓊脂15.0g，蒸餾水1000mL，pH7.4-7.6。pH值用1mol/L的氫氧化鈉或1mol/L氯化氫調至要求值。培養(yǎng)基滅菌條件是：溫度為121～126℃，時間為25min。(2)I號原油最大吸收波長的測定石油及其產品在紫外光區(qū)有一定的吸收特征，石油組分中帶有苯環(huán)的芳香族化合物波長一般為250～260nm，而帶有共軛雙鍵的化合物波長一般在215～230nm之間，有研究表明，在使用紫外分光光法測定時，255nm左右為原油和重質油的選擇范圍，225nm左右與為輕質油及煉油廠的油品的選擇范圍。在100mg/L濃度下，依據獲得的波長與吸光度數(shù)據，繪制供試I號原油的波長-吸光度曲線如圖3所示，其中，I號原油采自延長石油集團七里洞采油場集油站，密度為0.65g/mL。(3)I號原油標準曲線的繪制分別取0、2、2.5、5、6、7mgI號原油于50mL比色管中，用石油醚定容，此時的濃度分別為0、40、50、100、120、140mg/L，在258nm波長下，以石油醚為參比溶液，測定標準濃度的吸光度。橫坐標為濃度(mg/L)，縱坐標為吸光度，繪制I號原油的濃度(mg/L)-吸光度(A)的標準曲線如圖4所示。(4)原油降解率的測定取擴大培養(yǎng)的蘇云金芽孢桿菌3-1菌液3mL，接種于100mL含油無機鹽液體培養(yǎng)基中，含油無機鹽培養(yǎng)基的成分是：NaNO31.5g，(NH4)2SO41.5g，K2HPO41g，MgSO4·7H2O0.5g，KCl0.5g，F(xiàn)eSO4·7H2O0.01g，CaCl20.002g，蒸餾水1000mL，原油1.5mL，pH7.0；在30℃，120rpm恒溫水浴振蕩器中培養(yǎng)7d。培養(yǎng)液用5:1(V/V)的硫酸溶液調節(jié)pH值為2-3，加入甲醇2-4mL，用3×15mL的石油醚(60-90℃)萃取三次，萃取液經無水硫酸鈉干燥后轉入50mL容量瓶并定容。將石油醚萃取液經系列稀釋后，以石油醚為參比，通過紫外分光光度法測定其相應的吸光度，根據濃度(mg/L)-吸光度的標準曲線，確定石油醚提取液相應樣品的濃度，依據濃度計算降解效率。原油降解率的計算方法參考以下公式：η(％)＝(1-Ct/Co)×100％其中：η-原油降解率；Ct-菌株存在下原油濃度；Co-對照原油濃度。按照上述計算公式計算得蘇云金芽孢桿菌(Bacillusthuringiensis)對原油污染水體的降解率為70.46％。雖然，本說明書中已經用一般性說明及具體實施方案對本發(fā)明作了詳盡的描述，但在本發(fā)明基礎上，可以對之作一些修改或改進，這對本領域技術人員而言是顯而易見的。因此，在不偏離本發(fā)明精神的基礎上所做的這些修改或改進，均屬于本發(fā)明要求保護的范圍。SEQUENCELISTING<110>長安大學<120>一種蘇云金芽孢桿菌及其應用<130>2016<160>1<170>PatentInversion3.5<210>1<211>1404<212>DNA<213>蘇云金芽孢桿菌（Bacillusthuringiensis）3-1<400>1TAAGAGCTTGCTCTTATGAAGTTAGCGGCGGACGGGTGAGTAACACGTGGGTAACCTGCC60CATAAGACTGGGATAACTCCGGGAAACCGGGGCTAATACCGGATAACATTTTGAACTGCA120TGGTTCGAAATTGAAAGGCGGCTTCGGCTGTCACTTATGGATGGACCCGCGTCGCATTAG180CTAGTTGGTGAGGTAA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