專利名稱：肝肽素的純化和部分氨基酸序列的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種刺激肝細胞DNA合成的生物藥品肝肽素的純化和部分氨基酸序列。
近年來，國內(nèi)外廣大學者對肝病的治療，愈來愈注重選用對肝細胞的再生藥物，其來源和制備方法各不相同。最早LaBrecque從大鼠再生肝中提取“肝刺激物質(zhì)”(Hepatic stimulator substamce，HSS)，Nakamura從血小板中提取“肝細胞生長因子”(Hepatocyte Growth Factor，HGF)。國內(nèi)陳光明等從乳豬肝中提取HGF，蘇先獅等用改良的Labrecque方法從乳豬肝中提取刺激生長因子即肝肽素粗品，并于1991年申請了中國專利。
本發(fā)明的目的是提供肝肽素粗品的進一步純化和部分氨基酸序列。
本發(fā)明是將肝肽素粗品的凍干品，采用反向C4-高效液相色譜進行純化，色譜柱為Delta PackC4300A(3.9mm×30cm)層柱溫度42℃，流速0.7m/min。第一次純化時檢測波長280nm和230nm，洗脫液A0.1%TFA水溶液;B100%乙腈(含0.1%TFA)洗脫梯度0～30分鐘，乙腈線梯度0～75%;30～35分鐘，保持75%乙腈，35～40分鐘，乙腈線性梯度為75～0%。第二次樣品純化時，檢測波長280nm流動相A0.1%TFA水溶液;B100%乙腈(含0.1%TFA)洗脫梯度0～25分鐘，乙腈線性梯度0～75%，25～30分鐘，75%乙腈保持5分鐘，30～35分鐘，乙腈75%～0%。
純化后的肝肽素，其分子量為2.1萬道爾頓，對42℃30分耐熱，對酸堿穩(wěn)定，經(jīng)Milligen 6600型固相蛋白質(zhì)順序分析儀測得N-末端氨基酸殘基的排列順序為N-Asp-Glu-Lys-Ser-Phe-Lye-Trp-Lys-Ala-Thr。
本發(fā)明能刺激肝細胞DNA的合成，對慢性活動性乙型肝炎，能明顯抑制谷丙轉(zhuǎn)氨酶的活性，降低血清總膽紅素，升高A/G比值，有效地促進肝功能的恢復。并能抑制血清腫瘤壞死因子(STNF)水平及外周血單個核細胞誘導的腫瘤壞死因子(PBMC-TNF)，具有一定的免疫調(diào)節(jié)作用。治療慢性肝炎的有效率94.3%，肝硬化的有效率82.8%，重癥肝炎的存活率81.9%。
附
圖1第一次純化反向C4-HPLC圖譜附圖2第二次純化反向C4-HPLC圖譜附圖3氨基酸序列圖譜實施例1120ug，肝肽素粗品的凍干品，溶于100微升0.1%TFA水溶液中，色譜柱為Delta Pack C4300A(3.9mm×30mm)，層柱溫度42℃，流速0.7ml/min，檢測波長280nm和230nm，洗脫液A0.1%TFA水溶液，B100%乙腈(含0.1%TFA)，洗脫梯度0～30分鐘乙腈線性梯度0～75%，30～35分鐘，保持75%乙腈，35～40分鐘乙腈線性梯度為75%～0%。
(圖譜見附圖1)實施例2將第一次反向C4-HPLC的肝肽素組份(附圖1中的B組份)4ml凍干，溶于100微升0.1%TFA水溶液，色譜柱Delta Pack C4300A(3.9mm×30cm)，層析溫度42℃，流速0.7ml/min，檢測波長280nm，流動相A0.1%TFA水溶液，B100%乙腈(含0.1%TFA)洗脫梯度0～25分鐘，乙腈線性梯度0～75%，25～30分鐘75%乙腈保持5分鐘，30～35分鐘乙腈75%～0%。
(圖譜見附圖2)
權(quán)利要求
1.肝肽素的純化，其特征在于將粗制的肝肽素凍干品采用反向C4-高效液相色譜進行純化，色譜柱為Delta Pack C4300A，層柱溫度42℃，流速0.7m/min。
2.純化后的肝肽素的部分氨基酸序列，其特征在于N-末端氨基酸殘基的排列順序為N-Asp-Glu-Lys-Ser-Phe-Lys-Trp-Lys-Ala-Thr。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述肝肽素的純化，其特征在于第一次純化的檢測波長為280nm和230nm，洗脫液A0.1%TFA水溶液，B100%乙腈，洗脫梯度0～30分鐘乙腈線性梯度0～75%，30～35分鐘保持75%乙腈，35～40分鐘乙腈線性梯度為75%～0%。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述肝肽素的純化，其特征在于第二次純化檢測波長280nm，流動相A0.1%TFA水溶液，B100%乙腈，洗脫梯度0～25分鐘乙腈線性梯度0～75%，25～30分鐘乙腈保持5分鐘，30～35分鐘乙腈75%～0%。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種刺激肝細胞DNA合成的生物藥品肝肽素的純化和部分氨基酸序列。本發(fā)明采用反向C
文檔編號C07K7/06GK1100427SQ9311169
公開日1995年3月22日 申請日期1993年9月13日 優(yōu)先權(quán)日1993年9月13日
發(fā)明者蘇先獅, 鄧純, 王谷豐 申請人:湖南醫(yī)科大學附二院醫(yī)藥技術開發(fā)公司