一種提取2′，3′-環(huán)形核苷單磷酸的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種提取2'，3'_環(huán)形核苷單磷酸的方法，特別涉及一種利用重組蛋白 從大腸桿菌工程菌中同時(shí)提取腺苷-2 '，3 ' -環(huán)形單磷酸、鳥苷-2 '，3 ' -環(huán)形單磷酸、胞苷_ 2 '，3 ' -環(huán)形單磷酸和尿苷-2 '，3 ' -環(huán)形單磷酸四種2 '，3 ' -環(huán)形核苷單磷酸的方法，屬于生 物技術(shù)技術(shù)領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002] 環(huán)形核苷酸是細(xì)胞內(nèi)重要的第二信使，參與細(xì)胞內(nèi)多種信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的調(diào)控。第 二信使學(xué)說是E.W.薩瑟蘭1965年提出，他認(rèn)為人體內(nèi)各種含氮激素(蛋白質(zhì)、多肽和氨基酸 衍生物)都是通過細(xì)胞內(nèi)的環(huán)形腺苷酸(3'，5' -cAMP)而發(fā)揮作用的，并把3'，5' -cAMP稱為 第二信使，這是最早發(fā)現(xiàn)的環(huán)形核苷酸類第二信使。隨后，研究人員在多種生物細(xì)胞內(nèi)發(fā)現(xiàn) 了環(huán)形鳥苷酸(3?-cGMP)，環(huán)形胞苷(3?-cCMP)，環(huán)形尿苷酸(3?-cUMP)，環(huán)形二鳥 苷酸（c-di-GMP)，環(huán)形二腺苷酸(c-di-AMP)及環(huán)形鳥苷腺苷酸(cGAMP)等均可作為第二信 使參與胞內(nèi)信號(hào)通路的調(diào)控。除了3' ,δ'-環(huán)形核苷單磷酸之外，埃德溫(Edwin)等人還首次 在人的腎臟細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)了腺苷_2'，3'_環(huán)形單磷酸(2' J'-cAMP)，隨后人們又在哺乳動(dòng)物 的大腦等組織細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)了腺苷-2'，3'_環(huán)形單磷酸的存在?？蒲腥藛T還從植物細(xì)胞中檢 測(cè)到腺苷_2'，3'_環(huán)形單磷酸和鳥苷_2'，3'_環(huán)形單磷酸(2' J^cGMP)，從一株熒光假單胞 菌中檢測(cè)到胞苷_2'，3'_環(huán)形單磷酸（2' J'-cCMP)和尿苷_2'，3'_環(huán)形單磷酸（2' cUMP)的存在。有關(guān)2' 環(huán)形核苷單磷酸生理功能的研究較少，現(xiàn)有的研究結(jié)果認(rèn)為，2'， 環(huán)形核苷單磷酸與組織細(xì)胞的損傷有一定的關(guān)系，在受損的組織細(xì)胞內(nèi)，2' 環(huán)形核 苷單磷酸的含量會(huì)明顯升高;腺苷-2 '，3 環(huán)形單磷酸具有激活細(xì)胞線粒體膜上通透性孔 洞的作用，引起細(xì)胞凋亡;研究還發(fā)現(xiàn)與正常的腦部細(xì)胞相比，感染了HIV病毒的腦部細(xì)胞 內(nèi)2' 環(huán)形核苷單磷酸降解酶的磷酸化水平更高。2'，3'_環(huán)形核苷單磷酸（2' cNMPs)與細(xì)胞損傷的密切相關(guān)性激發(fā)了科研人員越來越大的興趣。
[0003] 隨著2' 環(huán)形核苷單磷酸吸引了越來越多的關(guān)注，其在科學(xué)研究和醫(yī)學(xué)應(yīng)用上 將有更多的需求。目前2'，3'_環(huán)形核苷單磷酸的制備均采用化學(xué)合成的方法，產(chǎn)量低，價(jià)格 高，從而極大限制了其開發(fā)應(yīng)用。

【發(fā)明內(nèi)容】
：
[0004] 本發(fā)明針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供了一種利用重組IF3蛋白與四種2' 環(huán)形單 磷酸的相互作用快速制備四種2'，3~環(huán)形核苷酸的方法。該方法無需特定的前體物質(zhì)，利 用微生物的生長(zhǎng)從頭合成四種2'，3~環(huán)形核苷單磷酸，并利用一種重組蛋白快速地將微生 物合成的四種2'，3~環(huán)形核苷單磷酸提純。
[0005] 本發(fā)明技術(shù)方案如下：
[0006] -種提取2'，3'_環(huán)形核苷單磷酸的方法，包括如下步驟：
[0007] (1)提取大腸埃希氏菌(Escherichia coli)K12菌株的基因組DNA，利用PCR擴(kuò)增編 碼IF3蛋白的基因 if3，制得基因 if3;
[0008] 所述PCR特異引物序列如下：
[0009] F:GGAATTCCATATGATTAAAGGCGGAAAACG，
[0010] R:CCGCTCGAGCTGTTTCTTCTTAGG；
[0011] (2)將步驟(1)制得的基因 if 3酶切后與同樣經(jīng)酶切的表達(dá)質(zhì)粒PET-22b連接，然后 轉(zhuǎn)化到E.coli BL21(DE3)菌株中，進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，制得重組菌發(fā)酵液；
[0012] (3)分離步驟(2)制得的重組菌發(fā)酵液中的菌體，破碎細(xì)胞，鎳柱親和層析提純重 組蛋白IF3，然后0 °C靜置2.5~3.5d，固液分離，取上清液；
[0013] ⑷將步驟⑶制得的上清液經(jīng)超濾去除蛋白雜質(zhì)，濾液經(jīng)Cl8反向色譜柱進(jìn)行高效 液相分離，分別制得含四種2 '，3 環(huán)形核苷單磷酸溶液。
[0014] 根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選的，所述步驟(1)中的PCR擴(kuò)增體系(50μυ如下： 滅菌蒸餾水 _ 32.2 5x7'runsSturtFu乂tPfu 始'\'施 10 μL. dNTP混合物 5 μΕ
[0015] 引物F (50μΜ) 0.4 μL 引物R (50 μΜ) 0.4 μL 基因組DNA 1 pL Γα7/7、-5>6"Υ fVv."/3,? DNA.聚合酶 1 μL
[0016] PCR反應(yīng)條件如下：
[0017] 95°C 預(yù)變性 5min;95°C 變性 30sec，55°C 退火 30sec，72°C 延伸 30sec，30 個(gè)循環(huán)；72 °C終延伸5min。
[0018] 根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選的，所述步驟(2)中酶切采用限制性內(nèi)切酶Ndel和Xhol進(jìn)行雙酶 切，酶切反應(yīng)體系如下： 緩沖液 2 μΙ_ 表達(dá)質(zhì)粒PET-22b或基因 if3 8 yiL
[0019] 限制性內(nèi)切酶Ndel 1 gL 限制性內(nèi)切酶Xhol ΙμL 滅菌蒸餾水 8 μΕ
[0020] 反應(yīng)條件:37°C溫浴30min。
[0021 ]根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選的，所述步驟(2)中連接的反應(yīng)體系如下：
[0022] 酶切后的載體pET-22b lyL
[0023] 酶切后的基因if 3 4yL
[0024] Solution I 5yL
[0025] 反應(yīng)條件:16 °C連接過夜。
[0026] 根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選的，所述步驟(2)中，發(fā)酵培養(yǎng)步驟如下：
[0027] 先在35~38°C、150~200rpm條件下擴(kuò)大培養(yǎng)至菌液在波長(zhǎng)為600nm吸光度為0.8; 然后在18~22°C、100~140rpm繼續(xù)培養(yǎng)30min;再加入終濃度為O.lmM的IPTG，繼續(xù)誘導(dǎo)培 養(yǎng)22~25小時(shí)；
[0028]所述發(fā)酵培養(yǎng)基為淡水LB培養(yǎng)基，組分如下：
[0029] lOg NaCl，10g蛋白胨，5g酵母粉，pH 8.0,蒸餾水定容至1L。
[0030] 根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選的，所述步驟(3)中，破碎細(xì)胞步驟如下：
[0031]將分離得到的菌體重懸于裂解緩沖液中，在壓力為950~1050bar的條件下破碎細(xì) 胞，12000rpm離心50min，取上清液；
[0032]所述的裂解緩沖液組分為:50mM Tris-HCl、150mM NaCl，pH 8.0。
[0033] 根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選的，所述步驟(3)中，鎳柱親和層析提純重組蛋白IF3步驟如下：
[0034] 將破碎細(xì)胞后的上清液上樣鎳柱，每根鎳柱裝2mL鎳膠，待上清液流過鎳膠后，每 根鎳柱用20mL裂解緩沖液平衡，用20mL沖洗緩沖液沖洗，最后用10mL的洗脫緩沖液洗脫，制 得重組蛋白IF3溶液；
[0035] 所述裂解緩沖液組分為:50mM Tris-HCl、150mM NaCl，pH 8.0;
[0036] 所述沖洗緩沖液組分為:50mM Tris-HCl、150mM NaCl、20mM咪唑，pH 8.0;
[0037] 所述洗脫緩沖液組分為:50mM Tris-HCl、150mM NaCl、250mM咪唑，pH 8.0。
[0038] 根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選的，所述步驟(4)中，超濾為采用截留分子量為3K的超濾管超濾。
[0039] 根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選的，所述步驟(4)中，所述C18反向色譜柱進(jìn)行高效液相分離的分離 程序?yàn)椋憨杕in，B液0% ;2.5min，B液0%;5min，B液30%;10min，B液60% ;14min，B液 100% ; 21min，B液 100% ;22min，B液50% ;23min，B液0% ;30min，B液0% ;流速為 10ml/min，檢測(cè)波 長(zhǎng)為254nm;
[0040] 流動(dòng)相為:A液，10mM醋酸銨溶液，pH 5.0;B液，將A液與甲醇按體積比3:1的比例混 合。
[0041 ] 有益效果
[0042] 1、本發(fā)明提供的方法首次實(shí)現(xiàn)了從大腸桿菌中同時(shí)直接提取四種2'，3'_環(huán)形核 苷單磷酸。通過微生物生物發(fā)酵，從頭合成四種2' 環(huán)形核苷單磷酸，不需要特定的前體 物，無化學(xué)合成法的污染，簡(jiǎn)單方便，每升培養(yǎng)液可提取5mg的四種純品2'，3'_環(huán)形核苷單 磷酸；
[0043] 2、本發(fā)明采用大腸桿菌進(jìn)行生物發(fā)酵，由于其遺傳背景清楚、生長(zhǎng)速度快，有利于 進(jìn)一步采用生物工程方法進(jìn)行改進(jìn)，提高產(chǎn)量。
【附圖說明】
[0044] 圖1、鎳柱親和層析純化的重組蛋白IF3的電泳圖。
[0045]圖中:M、蛋白質(zhì)分子量標(biāo)記(marker) ;IF3、鎳柱親和層析純化后的重組IF3蛋白；
[0046] 圖2、提取含4種2'，3'-環(huán)形核苷單磷酸溶液的HPLC分析；
[0047] 圖3、純化得到的2'，3' -cCMP液相色譜和質(zhì)譜分析；
[0048] (a)，液相色譜分析純化得到的2\3~cCMP;
[0049] (b)，一級(jí)質(zhì)譜分析純化得到的Y，3~cCMP，圖譜顯示提純的Y，3~cCMP的質(zhì)荷比 為306.0491 (z = 1 )，與理論值306.0491完全相符；
[0050] (c)，二級(jí)質(zhì)譜分析一級(jí)質(zhì)譜中得到的質(zhì)荷比為306.0491(z = l)的離子，片段化方 式如(d)所示；
[0051] ((1),27 J'-cCMP結(jié)構(gòu)示意圖；
[0052]圖4、液相色譜，質(zhì)譜分析純化得到的2' J^cUMP;
[0053] (a)，液相色譜分析純化得到的2'彳-cUMP;
[0054] (b)，一級(jí)質(zhì)譜分析純化得到的2' J'-cUMP，圖譜顯示提純的2' J'-cCMP的質(zhì)荷比 為307.0331 (z = 1 )，與理論值307.0331完全相符；
[0055] (c)，二級(jí)質(zhì)譜分析一級(jí)質(zhì)譜中得到的質(zhì)荷比為307.0331(z = l)的離子，片段化方 式如(d)所示；
[0056] ((1),27 J'-cUMP結(jié)構(gòu)示意圖；
[0057]圖5、液相色譜，質(zhì)譜分析純化得到的2' J^cGMP;
[0058] (a)，液相色譜分析純化得到的2\3~cGMP;
[0059] (b)，一級(jí)質(zhì)譜分析純化得到的Y，3~cGMP，圖譜顯示提純的Y，3~cCMP的質(zhì)荷比 為346.0552 (z = 1 )，與理論值346.0552完全相符；
[0060] (C)，二級(jí)質(zhì)譜分析一級(jí)質(zhì)譜中得到的質(zhì)荷比為346.0552(z = l)的離子，片段化方 式如(d)所示；
[0061] ((1),27 J'-cGMP結(jié)構(gòu)示意圖；
[0062]圖6、液相色譜，質(zhì)譜分析純化得到的2' J^cAMP;
[0063] (a)，液相色譜分析純化得到的2' ,3' -cAMP;
[0064] (b)，一級(jí)質(zhì)譜分析純化得到的2' J-cAMP，圖譜顯示提純的2' y-cCMP的質(zhì)荷比 為330.06 (z = 1 )，與理論值330.0603極為相符；
[0065] (c)，二級(jí)質(zhì)譜分析一級(jí)質(zhì)譜中得到的質(zhì)荷比為330.06(z = l)的離子，片段化方式 如(d)所示；
[0066] ((1),27 J'-cAMP結(jié)構(gòu)示意圖。
【具體實(shí)施方式】
[0067] 下面結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明的技術(shù)方案作進(jìn)一步說明，但本發(fā)明所保護(hù)范圍不限于 此。
[0068]實(shí)施例中所述大腸桿菌K12菌株購自中國工業(yè)微生物菌種保藏管理中心，地址:北 京市朝陽區(qū)酒仙橋中路24號(hào)院6號(hào)樓，菌種保藏號(hào)CICC 10424;
[0069]大腸桿菌BL21(DE3)感受態(tài)購自北京全式金生物技術(shù)有限公司，地址:北京市海淀 區(qū)西小口路66號(hào)中關(guān)村東升科技園B-3號(hào)樓四層。
[0070] 實(shí)施例1
[0071] -種重組蛋白表達(dá)菌株構(gòu)建方法，步驟如下：
[0072] 1.大腸桿菌轉(zhuǎn)錄起始因