鈣結(jié)合肽的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一類包含肽序列(X-Y-Z)n的化合物，其中X是選自天冬氨酸、谷氨酸、天冬酰胺、丙氨酸和谷氨酰胺的氨基酸，Y和Z是選自丙氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、磷酸絲氨酸、磷酸蘇氨酸和它們的衍生物的氨基酸。這些化合物具有特異性地緊密結(jié)合鈣化表面的特性，使它們適用于各種用途包括使牙齒和骨骼表面再礦化，診斷骨骼和牙齒缺損，治療骨骼和牙齒缺損和體外和體內(nèi)分析鈣化沉積的存在和部位，和用于需要確定、定位或處理鈣化的產(chǎn)業(yè)、合成、醫(yī)學(xué)、牙科學(xué)和研究用途。
【專利說明】韋丐結(jié)合狀
[0001 ] 本申請是國際申請PCT/US2006/037902，國際申請日2006年9月27日，中國國家階段申請?zhí)?00680035799.1的發(fā)明專利申請的分案申請。
_2] 相關(guān)申請的交叉參考
[0003]本申請要求2005年9月28日提交的美國臨時(shí)申請?zhí)?0/722，071的優(yōu)先權(quán)，以其全文納入本文作參考。
【背景技術(shù)】
[0004]特異性結(jié)合鈣化表面的化合物包括小熒光分子，如四環(huán)素、鈣黃綠素和茜素和大鈣結(jié)合蛋白，如牙質(zhì)磷蛋白(DPP，常指磷蛋白)和牙釉蛋白。DPP是在牙質(zhì)胞外基質(zhì)中發(fā)現(xiàn)的主要非膠原蛋白之一，長時(shí)間認(rèn)為它與牙質(zhì)礦化時(shí)羥磷灰石(HA)成核有關(guān)(Leel980 ；Lussi 1988 ；Veisl998 ;Hao2004)。人DPP衍生自牙質(zhì)唾液磷蛋白的蛋白水解性裂解(DSPP)。人DPP是主要由大量Asp-Ser-Ser (SEQ ID NO:1)氨基酸重復(fù)組成的高度易彎曲的(Cross2005)、高度磷酸化的(Leel980)蛋白質(zhì)(Gu2000)。已經(jīng)廣泛研究了 DPP的生化特性。這些研究揭示了固定化DPP能顯著增加羥磷灰石成核速率，而該作用在DPP溶液或去磷酸化DPP中未曾見到。此外，據(jù)顯示，高濃度DPP能抑制HA晶體生長(Lussi 1988 ；Veisl998 ；Saito2000)。
[0005]發(fā)明概沭
[0006]在某些實(shí)施方式中，提供了一種包含一種或多種鈣結(jié)合肽的組合物。這些鈣結(jié)合肽含有三氨基酸重復(fù)序列(X-Y-Z)n，其中X是天冬氨酸、谷氨酸、天冬酰胺、丙氨酸或谷氨酰胺，Y和Z是丙氨酸、絲氨酸、`蘇氨酸、磷酸絲氨酸或磷酸蘇氨酸，η是從I到40的數(shù)，其中所述鈣結(jié)合肽結(jié)合磷酸鈣。在某些實(shí)施方式中，所述該結(jié)合肽含有約1-40個(gè)三氨基酸重復(fù)(即，η=1-40)，長度約為3-120個(gè)氨基酸。在某些此類實(shí)施方式中，η是從2到8的數(shù)。在某些實(shí)施方式中，X是天冬氨酸，Y和Z是絲氨酸(分別是SEQ ID Ν0:12、34、13、35、14、36和15)。在某些實(shí)施方式中，所述鈣結(jié)合肽可以具有SEQ ID NO: 12-15中任一所示的氨基酸序列。
[0007]在某些實(shí)施方式中，本文提供的所述鈣結(jié)合肽可以連接一種或多種結(jié)合配體(conjugate)或基團(tuán)(moiety)。在某些實(shí)施方式中，所述結(jié)合配體或基團(tuán)是可檢測標(biāo)記,例如熒光團(tuán)、生色團(tuán)、親和標(biāo)簽、抗原標(biāo)簽、放射性標(biāo)記或自旋標(biāo)記。在另一些實(shí)施方式中，所述結(jié)合配體或基團(tuán)是肽、蛋白質(zhì)、糖、核酸、脂類、有機(jī)化合物、無機(jī)化合物或有機(jī)金屬化合物。在另一些實(shí)施方式中，所述結(jié)合配體或基團(tuán)是治療劑，例如抗癌或抗菌的藥劑或化合物。在所述結(jié)合配體或基團(tuán)是抗菌劑的某些實(shí)施方式中，所述抗菌劑可以是抗菌肽序列。在某些實(shí)施方式中，所述結(jié)合配體或基團(tuán)可以經(jīng)由氨基酸接頭與鈣結(jié)合肽相連。
[0008]在某些實(shí)施方式中，提供了通過施用含有本文公開的鈣結(jié)合肽的組合物來治療對象中以牙齒去礦化為特征的牙齒缺損的方法。如本文所述，施用這些鈣結(jié)合肽能夠誘導(dǎo)牙齒表面再礦化。
[0009]在某些實(shí)施方式中，提供了通過施用含有本文公開的鈣結(jié)合肽的組合物來治療對象中以骨去礦化或骨密度降低為特征的骨缺損的方法。如本文所述，施用這些鈣結(jié)合肽能夠誘導(dǎo)骨表面再礦化和提高骨密度。
[0010]在某些實(shí)施方式中，提供了確定以牙齒去礦化為特征的牙齒缺損的方法，包括施用含有本文公開的鈣結(jié)合肽的組合物，其中所述肽與可檢測標(biāo)記結(jié)合，然后用肉眼或檢測設(shè)備檢測所述標(biāo)記物。如本文所述，這些鈣結(jié)合肽能夠選擇性或優(yōu)先結(jié)合呈現(xiàn)去礦化的牙齒部位。
[0011]在某些實(shí)施方式中，提供了確定對象中以骨去礦化為特征的骨缺損的方法，包括施用含有本文公開的鈣結(jié)合肽的組合物，其中所述肽與可檢測標(biāo)記合，然后用肉眼或檢測設(shè)備檢測所述標(biāo)記物。如本文所述，這些鈣結(jié)合肽能夠選擇性或優(yōu)先結(jié)合呈現(xiàn)去礦化的骨部位。
[0012]在某些實(shí)施方式中，提供了確定對象中除骨或牙齒以外的其它組織中鈣化的方法，包括施用含有本文公開的鈣結(jié)合肽的組合物，其中所述肽與可檢測標(biāo)記結(jié)合，然后用肉眼或檢測設(shè)備檢測所述標(biāo)記物。如本文所述，這些鈣結(jié)合肽能夠結(jié)合鈣和草酸鈣?？梢圆捎盟龇椒ù_定的鈣化包括，例如，動脈斑塊、腎結(jié)石和籽骨。在某些實(shí)施方式中，所述肽可用來治療這些不當(dāng)鈣化，這可以通過例如將所述肽與治療部分結(jié)合并利用所述肽將治療部分靶向所述鈣化部位。
[0013]在某些實(shí)施方式中，提供了含有本文公開的所述鈣結(jié)合肽的組合物，用來治療以牙齒去礦化為特征的牙齒缺損或以骨去礦化為特征的骨缺損。在某些實(shí)施方式中，這些組合物可用于檢測或診斷以去礦化為特征的牙齒或骨缺損。
[0014]在某些實(shí)施方式中，提供了包括含有本文公開的所述鈣結(jié)合肽的組合物的試劑盒。在某些實(shí)施方式中 ，所述試劑盒包括使用或施用說明。在某些實(shí)施方式中，這些試劑盒可用來治療以牙齒去礦化為特征的牙齒缺損或以骨去礦化為特征的骨缺損。在某些實(shí)施方式中，這些組合物可用于檢測或診斷以去礦化為特征的牙齒或骨缺損。
[0015]附圖簡要說明
[0016]圖1:DSS 和 DSS 變體肽(A.4DSS=SEQ ID NO: 13，8DSS=SEQ ID NO: 15，2DSS=SEQID N0:12;B.4DSS=SEQ ID NO: 13，4NSS=SEQ ID NO:20,4ESS=SEQ ID NO: 16，4DTT=SEQ IDNO:17, 4ETT=SEQ ID NO:19, 4NTT=SEQ ID N0:18;C.8DSS=SEQ ID NO:15, 8DAA=SEQ IDNO:22, 8ASS=SEQ ID NO:21，8NAA=SEQ ID NO:23)與羥磷灰石和牙齒表面的結(jié)合親和力。A-C:濃度范圍為0-100 μ M的熒光素標(biāo)記肽與0.3mg羥磷灰石納晶(比表面積=100m2/g)共培育10分鐘，接著離心除去羥磷灰石。根據(jù)Abs48tl確定除去羥磷灰石前后混合物中肽的量。作等溫線圖，根據(jù)蘭格繆爾方程式(Langmuir equation)進(jìn)行擬合，得到反映肽對羥磷灰石表面親和力的常數(shù)，Ka值。D:人牙齒的矢狀切片與12.5μΜ5(6)羧基熒光素標(biāo)記6DSS肽(SEQ ID NO: 14)共培育10分鐘，接著漂清。通過采用藍(lán)激光(λ = 488nm)和FITC發(fā)射濾光鏡的共焦激光掃描顯微鏡(Confocal Laser Scanning Microscopy,CLSM)觀察牙齒表面結(jié)合的肽。左側(cè)，淺色區(qū):牙質(zhì)。右側(cè)，深色區(qū):釉質(zhì)。
[0017]圖2:6DSS (SEQ ID NO: 14)肽結(jié)合礦化小鼠骨髓結(jié)節(jié)(MBMN)。使小鼠骨髓培養(yǎng)物生長到鋪滿，然后用2.5μΜ錯義對照肽或2.5yM6DSS (SEQ ID NO: 14)處理3周。通過采用FITC濾鏡組的熒光顯微鏡進(jìn)行培養(yǎng)物造影。A:6DSS (SEQ ID NO: 14)處理培養(yǎng)物的礦化MBMN的亮視野圖像。B是(A)中所示視野的熒光圖像。中央結(jié)節(jié)塊的強(qiáng)染色(淺染)表明被熒光標(biāo)記6DSS(SEQ ID NO: 14)肽結(jié)合。C是錯義對照肽處理培養(yǎng)物的礦化MBMN的亮視野圖像。D是(C)中所示視野的熒光圖像，顯示對照肽未結(jié)合MBMN，樣品中也沒有自發(fā)熒光。
[0018]圖3:固定化8DSS (SEQ ID NO: 15)肽與CaHPO4的相互作用。將鏈霉親和素包被的聚苯乙烯珠子與結(jié)合有生物素的8DSS (SEQ ID NO: 14) (A和C)或未結(jié)合生物素(B)和(D)共培育。洗滌珠子，在PBS + ImM CaCl2 + ImM NaHPO4溶液中培育12天，然后成像。A是積累在包裹有DSS的珠子周圍的非晶磷酸鈣聚集體的亮視野顯微照片。大的磷酸鈣聚集全部與一個(gè)或多個(gè)珠子相關(guān)聯(lián)。B是有代表性的生物素封閉珠子(無DSS肽)的亮視野圖像。沒有明顯的沉淀與這些珠子相關(guān)聯(lián)。C是相差顯微照片，顯示DSS包被珠子的外圍更多有序排列的磷酸鈣累積(請注意觀察對象的球形中央)。如⑶中所示，在對照樣品(生物素封閉，無DSS肽)中看不到這些現(xiàn)象。定標(biāo)線條=4μπι。
[0019]圖4:用DSS肽使牙齒表面再礦化。對取出的人牙齒進(jìn)行矢狀切片，用1996EDTA凝膠去礦化I小時(shí)，接著浸入去離子水中，超聲處理除去多余碎屑。如以下所述處理樣品，然后通過掃描電子顯微鏡(Scanning Electron Microscopy)成像。定標(biāo)線條=50 μ m。A是去礦化的對照樣品。B:用8DSS (SEQ ID NO: 15)處理I小時(shí)，漂清，用夸爾脫敏劑(QuellDesensitizer)再礦化。C:僅用緩沖液處理,用夸爾脫敏劑再礦化。D:不做處理,用夸爾脫敏劑再礦化。
[0020]圖5:羥磷灰石在釉質(zhì)(上組圖)和牙質(zhì)(下組圖)面上的成核。如實(shí)施例6所述并如圖中所標(biāo)明的制備和處理各表面，接著采用掃描電子顯微鏡成像。上組(上兩行)表示釉質(zhì)樣品，而下組(下兩行)表示牙質(zhì)樣品。各組中上面那行表示處理前未去礦化的樣品，下面那行表示經(jīng)磷酸處理去礦化的樣品。顯示的是掃描電子顯微照片，定標(biāo)線條=IOum0左欄:成核和晶體生長前未經(jīng)任何處理的樣品。中欄:成核和晶體生長前只接觸緩沖液的樣品。右欄:成核和晶體生長前接觸12.5 μ M8DSS肽的樣品。晶體生長反映早期成核作用。`
[0021]圖6:8DSS (SEQ ID NO: 15)肽結(jié)合的組織特異性和它對礦化狀況的依賴性。如實(shí)施例9所述，將去礦化和非礦化人牙齒樣品與12.5μΜ5^)_羧基熒光素標(biāo)記8DSS(SEQ IDNO: 15)肽共培育，漂洗各切片，通過CLSM成像。左分圖顯示8DSS (SEQ ID NO: 15)肽與去礦化組織的結(jié)合模式。該肽主要結(jié)合去礦化釉質(zhì)(E)，鮮有結(jié)合牙質(zhì)(D)。在非去礦化樣品中觀察到的模式正相反，即該肽主要結(jié)合牙質(zhì)(D)而鮮有或完全不結(jié)合釉質(zhì)(E)。兩種情況下，標(biāo)記為DEJ的牙質(zhì)-釉質(zhì)交界線均很清晰。
[0022]圖7:骨礦化。在共享組織實(shí)驗(yàn)方案(shared tissue protocol)下,觀察死后取得的大鼠股骨。將樣品去礦化、漂洗和超聲降解除去碎屑。用8DSS (SEQ ID NO: 15)肽處理試驗(yàn)樣品I小時(shí)，清洗，如實(shí)施例8所述用夸爾脫敏劑(Quell Desensitizer)再礦化,然后通過掃描電子顯微鏡(Scanning Electron Microscopy)成像。所示為SEM圖像。上:未處理樣品，顯示出骨表面完全被礦物質(zhì)覆蓋。中:去礦化樣品，顯示出失去礦物質(zhì)層后暴露出的哈弗斯骨管(Haversian canal)。下:經(jīng)8DSS (SEQ ID NO: 15)和夸爾脫敏劑(QuellDesensitizer, 一種CaCl2/K2HP04水溶液)處理的骨，顯示礦質(zhì)層重建。
[0023]圖8:顯示DSS肽和變體結(jié)合的組織特異性的熒光顯微照片。未去礦化，成人牙齒接觸12.5 μ M5^)_羧基熒光素-標(biāo)記肽，徹底漂洗，CLSM成像。對每一切片采集多次掃描，自動組合成反映一個(gè)13X13mm區(qū)域的組圖，大多數(shù)情況下這足以涵蓋整個(gè)切片。每個(gè)切片所用的肽標(biāo)示于分圖下方(8DSS=SEQ ID NO: 15，8ASS=SEQ ID NO:21，8DAA=SEQID NO:22, 8NAA=SEQ ID NO:23，6DSS=SEQ ID NO:14，4DSS=SEQ ID NO:13，4ESS=SEQ IDNO:16, 4NSS=SEQ ID NO:20, 4DTT=SEQ ID NO:17，4ETT=SEQ ID NO:19，4NTT=SEQ ID NO:18)，各分圖中，牙齒的方向是根部朝向圖像上方，冠部朝下。組織層標(biāo)示如下=RTD =根尖牙質(zhì)；CPD =髓周牙質(zhì)；MD =外層牙質(zhì)；P =髓腔壁；DEJ =牙質(zhì)-釉質(zhì)交界；E =釉質(zhì)；BE =基部釉質(zhì)；CE =外層釉質(zhì)；CL =頻損傷；PB =牙周骨。
[0024]圖 9:顯示 DSS 肽和變體(4ESS=SEQ ID NO: 16，4NSS=SEQ ID NO:20，8DAA=SEQID NO:22, 8NAA=SEQ ID NO:23, 4ETT=SEQ ID NO:19，4DSS=SEQ ID NO:13，8ASS=SEQ IDN0:21,8DSS=SEQ ID NO: 15, 6DSS=SEQ ID NO: 14)特異性結(jié)合牙齒中的齲損傷的熒光顯微照片。未去礦化，成人牙齒接觸12.5 μ M5^)_羧基熒光素標(biāo)記肽，徹底漂洗，CLSM成像。分別對每個(gè)切片優(yōu)化顯微鏡和照相機(jī)機(jī)的配置。每幅分圖顯示齒切片上包括齲損傷在內(nèi)的一個(gè)區(qū)域。每幅分圖右側(cè)的白線表示牙齒表面的位置，箭頭指示被染色的損傷位置。
[0025]圖10:結(jié)合各類無機(jī)磷酸鹽沉淀的8DSS(SEQ ID NO: 15)肽的相對水平。IOOmM磷酸鈉(ρΗ7.5)分別與 IOOmM 的 MgCl2' CaCl2' MnCl2' CoCl2' NiSO4' CuSO4 和 SrCl2 溶液組合。制成每種磷酸鹽的濃度約為0.5%(w/v)的含有12.5 μ M5^)_羧基熒光素標(biāo)記8DSS (SEQID NO: 15)肽的懸液。室溫下培育10分鐘后，洗滌樣品和通過熒光顯微鏡成像。如實(shí)施例11中所述，用GIMP(www.gimp, org)測量象素強(qiáng)度值來估計(jì)各樣品中無機(jī)磷酸鹽顆粒的突光染色強(qiáng)度。用歸一化的熒光值在此作圖。X軸上所示為各種無機(jī)磷酸鹽沉淀。Y軸上所示為相對熒光強(qiáng)度值。
[0026]圖11:8DSS (SEQ ID NO: 15)肽結(jié)合草酸鈣。如實(shí)施例12所述，使草酸鈣晶體接觸12.5yM8DSS (SEQ ID NO: 15)肽，洗滌和通過熒光顯微鏡成像。左側(cè)圖顯示未染色的草酸鈣晶體。亮視野圖(上)證實(shí)存在晶體，而同一區(qū)域的熒光圖(下)證實(shí)在這些條件下草酸鈣不發(fā)生可見熒光。右側(cè)圖顯示用5(6)-羧基熒光素標(biāo)記的8DSS (SEQ ID N0:15)肽染色的草酸鈣晶體。亮視野圖(上)證實(shí)存在晶體，同一區(qū)域的熒光圖(下)顯示標(biāo)記肽造成晶體的明亮染色。`
[0027]發(fā)明詳沭
[0028]本發(fā)明以下描述的目的僅是說明本發(fā)明的各類實(shí)施方式。同樣地，不能認(rèn)為所討論的具體變型是對本發(fā)明范圍的限制。本領(lǐng)域技術(shù)人員明顯可知，在不超出本發(fā)明范圍時(shí)，可以進(jìn)行各種等價(jià)替換、改變和變型，和應(yīng)該理解這類等價(jià)實(shí)施方式也包括在本文中。
[0029]縮寫
[0030]本文采用了以下縮寫:BE，基部釉質(zhì)；CE，外層釉質(zhì)；CL，齲損傷；CLSM，共焦激光掃描顯微鏡；CPD，髓周牙質(zhì)；D，牙質(zhì)；DEJ，牙質(zhì)-釉質(zhì)交界；DPP，牙質(zhì)磷蛋白；E，釉質(zhì)；DSPP，牙質(zhì)唾液磷蛋白；HA，羥磷灰石；MD，外層牙質(zhì)；MIC，最小抑制濃度；P，髓腔壁；PB，牙周骨；SEM，掃描電子顯微鏡；RTD，根尖牙質(zhì)；λ，激發(fā)波長。
[0031]采用下列標(biāo)準(zhǔn)系統(tǒng)對氨基酸進(jìn)行縮寫。
[0032]氨基酸單字母縮寫三字母縮寫
[0033]丙氨酸AAla
[0034]精氨酸RArg[0035]天冬酰胺 NAsn
[0036]天冬氨酸 DAsp
[0037]半胱氨酸 CCys
[0038]谷氨酸EGlu
[0039]谷氨酰胺 QGln
[0040]甘氨酸GGly
[0041]組氨酸HHis
[0042]異亮氨酸 IIle
[0043]亮氨酸LLeu
[0044]賴氨酸KLys
[0045]甲硫氨酸 MMet
[0046]苯丙氛酸 FPhe
[0047]磷酸絲氨酸SpSep
[0048]脯氨酸PPro
[0049]絲氨酸S Ser
[0050]蘇氨酸TThr
[0051]色氨酸WTrp
[0052]酪氨酸YTyr
[0053]纈氨酸VVal
[0054]除非另外標(biāo)示有前綴“D”，如，D-Ala，本文中所述肽內(nèi)氨基酸和氨酰殘基的α碳原子的立體化學(xué)是天然或“L”構(gòu)型。
[0055]鈣結(jié)合肽
[0056]目前所提供的使脫鈣組織直接再礦化的化合物主要由各種游離的或與蛋白質(zhì)結(jié)合的磷酸鈣和/或氟化鈉制劑所構(gòu)成。生物組織中鈣化的增強(qiáng)通常是通過操控骨和牙齒前體細(xì)胞的細(xì)胞信號傳導(dǎo)，或采用鈣強(qiáng)化食品、膳食補(bǔ)充劑或其它富含游離的或結(jié)合蛋白質(zhì)的鈣的處理來提高整體鈣濃度。之前的研究描述一種通過使得在牙齒表面重聚磷酸鈣來加強(qiáng)再礦化的制劑(參見美國專利號6，780, 844)。然而，尚未證明過通過直接或特異性地將鈣靶向到表面來增強(qiáng)鈣化。
[0057]本發(fā)明揭示了一系列由DPP中的Asp-Ser-Ser (SEQ ID NO:1)基序演變而成的小分子結(jié)合肽。據(jù)顯示，這些肽能緊密和特異性結(jié)合到磷酸鈣表面。此外，據(jù)顯示，這些肽能使磷酸鈣向這些表面聚集，還可充當(dāng)結(jié)合配體使得熒光標(biāo)記物與鈣化表面結(jié)合而不計(jì)較這些表面的磷酸化狀態(tài)。
[0058]本發(fā)明公開的肽，通稱為DSS肽，由不同數(shù)目和/或不同組合的DPP的三氨基酸Asp-Ser-Ser (SEQ ID NO:1)基序或其變體構(gòu)成?？梢圆捎玫娜被嶂貜?fù)的例子包括但不限于:Asp-Ser-Ser(DSS，SEQ ID NO:1)、Glu-Ser-Ser (ESS, SEQ ID NO: 2),Asp-Thr-Thr (DTT, SEQ ID NO:3)、Glu-Thr-Thr (ETT，SEQ ID NO:4), Asn-Ser-Ser (NSS,SEQ ID NO: 5)、Asn-Thr-Thr (NTT，SEQ ID NO: 6)、Gln-Ser-Ser (QSS，SEQ ID NO: 7),Gln-Thr-Thr (QTT，SEQ ID NO:8)，和它們的變體。與上述重復(fù)序列不同，或在其之外，本發(fā)明公開的肽可以或還可以包含這些重復(fù)的一些小改變，包括但不限于:Asp-Ser-Thr (DST,SEQ ID NO:9) ,Asp-Ala-Ala (DAA, SEQ ID NO: 10) ^Ala-Ser-Thr (AST, SEQ ID NO: 11)?？梢曰瘜W(xué)修飾三氨基酸重復(fù)中的一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基。例如，所述肽可以含有一個(gè)或多個(gè)羥基被通過引入磷酸基團(tuán)而修飾的Ser或Thr殘基。所述肽的長度可以從3到50個(gè)氨基酸以上不等。
[0059]可以通過改變所述重復(fù)的組成和數(shù)目來控制本發(fā)明所述肽的鈣化表面結(jié)合親和力。例如，因?yàn)锳sp-Ser-Ser (SEQ ID NO:1)是所有受試重復(fù)中親和力最高的，加入一個(gè)或多個(gè)該序列的重復(fù)能提高肽的結(jié)合親和力。還可以通過增加三氨基酸重復(fù)的數(shù)目來提高肽的結(jié)合親和力。含有超過6次重復(fù)的肽通常比那些重復(fù)較少的肽表現(xiàn)出更高的親和力。在某些實(shí)施方式中，本發(fā)明所述的肽對羥磷灰石的結(jié)合親和力(Ka)可以大于15,000m—1。在某些實(shí)施方式中，該結(jié)合親和力可以大于50，OOOM—1，在其它實(shí)施方式中，大于ΙΟΟ,ΟΟΟΜ—1，在其它實(shí)施方式中，大于200，OOOM^1和在其它實(shí)施方式中，大于300，OOOM^1。
[0060]在某些實(shí)施方式中，所述肽可以含有一個(gè)或多個(gè)并非三氨基酸重復(fù)序列組份的其他氨基酸。例如，在某些實(shí)施方式中，肽的重復(fù)部分可以結(jié)合具有其它功能的氨基酸序列，例如抗菌肽序列，如2c-4、PL135或b-34肽序列。在某些實(shí)施方式中，肽的重復(fù)部分可以經(jīng)接頭序列(例如三甘氨酸序列)結(jié)合其它氨基酸序列。
[0061]在某些實(shí)施方式中，本發(fā)明所述肽含有序列(X-Y-Z)n，其中X是選自天冬氨酸、谷氨酸、天冬酰胺、丙氨酸和谷氨酰胺的氨基酸，Y和Z是選自丙氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、磷酸絲氨酸、磷酸蘇氨酸和它們的衍生物的氨基酸，η是1-20之間的數(shù)。在某些實(shí)施方式中，η是
1-15之間的數(shù)，在其它實(shí)施方式中，η是1-10之間的數(shù)和在某些實(shí)施方式中η是3-8之間的數(shù)。
[0062]據(jù)顯示，取決于不同處理?xiàng)l件，本發(fā)明所述鈣結(jié)合肽能在去礦化釉質(zhì)上以及去礦化和非去礦化牙質(zhì)上誘導(dǎo)磷酸鈣晶體的生長。同樣，據(jù)顯示，所述肽能引起骨再礦化。因此，在某些實(shí)施方式中，含有本`發(fā)明所述鈣結(jié)合肽的組合物可用于通過使浮游磷酸鈣顆粒向鈣化表面聚集來增強(qiáng)礦化。這些肽可結(jié)合鈣化表面和/或浮游磷酸鈣團(tuán)粒。同時(shí)結(jié)合鈣化表面和浮游團(tuán)粒提高了鈣化表面附近的磷酸鈣濃度，由此增強(qiáng)了所述表面的再礦化。通過調(diào)節(jié)所述肽的大小和結(jié)合親和力，可以改變結(jié)合到所述表面的鈣的數(shù)量。在某些實(shí)施方式中，牙齒的再礦化引起牙質(zhì)小管完全或部分閉塞。
[0063]含有本發(fā)明所述鈣結(jié)合肽的組合物可用來再礦化牙齒，預(yù)防或減緩牙齒去礦化，治療牙齒損傷、缺陷、疾病或異常，在牙齒表面或表面以下形成礦物質(zhì)層，改變牙齒的礦物質(zhì)密度，例如提高或降低礦物質(zhì)密度，或封閉牙齒的某個(gè)位點(diǎn)。同樣，可以用這些組合物來治療骨缺陷、損傷、腫瘤、異常生長、疾病或骨損失，促成骨表面或表面以下形成礦物質(zhì)層，或改變(例如提高或降低)骨密度。在這些實(shí)施方式中，將含有一種或多種前述鈣結(jié)合肽的組合物用于一個(gè)或多個(gè)侵襲骨位點(diǎn)或其附近。在某些實(shí)施方式中，可以采用本文所述含有鈣結(jié)合肽的組合物來治療骨以外組織和器官中的鈣化、石灰損傷，或礦化缺陷，包括動脈斑塊。
[0064]本文采用的疾病的“治療”或“處理”可以指預(yù)防或修復(fù)某種狀況、延遲或延緩所述狀況的的發(fā)生或發(fā)展速率、降低發(fā)展成為所述狀況的風(fēng)險(xiǎn)、預(yù)防或延緩發(fā)展產(chǎn)生所述狀況的相關(guān)癥狀、減少或消除所述中止的相關(guān)癥狀、使所述狀況完全或部分消退，或以上所述的組合。[0065]在某些實(shí)施方式中，含有本文所述鈣結(jié)合肽的組合物可用來將所需化學(xué)基團(tuán)或顆粒特異性附著到鈣化表面如骨或牙齒的那些表面。與目前再礦化牙齒表面的方式令口腔充滿了含有游離或與蛋白質(zhì)結(jié)合的鈣的制劑不同，這些化合物使磷酸鈣團(tuán)粒特異性粘附到牙齒表面，因此提高了局部鈣和磷酸鹽濃度，提高了磷酸鈣結(jié)合到牙齒去礦化區(qū)域的概率。目前對鈣化組織損傷或疾病的藥物治療依賴于將感興趣的治療化合物的游離溶液直接(局部)或通過全身給藥施用到目標(biāo)表面區(qū)域周圍，希望其中部分可以與鈣化表面相互作用。
[0066]在某些實(shí)施方式中，含有本文所述鈣結(jié)合肽的組合物可用于針對不當(dāng)鈣化的原位或體內(nèi)試驗(yàn)。例如，這些組合物可用來診斷、鑒別、定位或治療非骨組織和器官中的鈣化、石灰損傷或礦化缺陷，包括例如動脈斑塊、腎結(jié)石或籽骨中的。目前用來檢測鈣化的試驗(yàn)包括染料結(jié)合方法、放射性同位素?fù)饺?、X-射線透射分析和定量化學(xué)分析。這些方法都有某些缺點(diǎn)。染料結(jié)合方法中，樣品要接觸鈣螯合熒光染料，如四環(huán)素、鈣黃綠素或茜素，然后觀察染料向感興趣的組織內(nèi)摻入。盡管染料可體內(nèi)引入，但對信號進(jìn)行觀察仍然需要切取感興趣的組織。用銀離子(來自Kossa染色法)處理固定的組織可用來確定鈣化位點(diǎn)，但是這個(gè)方法不能體內(nèi)應(yīng)用，還受到顯著背景染色的干擾。放射性同位素如45Ca摻入為測定體內(nèi)鈣化位點(diǎn)和速率提供了精確和定量的信息，但缺點(diǎn)在于使實(shí)驗(yàn)對象受到高水平電離輻射的作用。X-射線透射分析能提供高空間分辨率，可以用于活動物，但不能在X-射線圖像中可見的各種其它要素中特異性地鑒別出鈣沉淀。體外定量化學(xué)分析鈣沉淀能有效確定存在的礦物質(zhì)的類型和數(shù)量，但這些方法非常費(fèi)力，并會丟失有關(guān)組織的位置和結(jié)構(gòu)的信息。
[0067]在某些實(shí)施方式中，含有本發(fā)明所述鈣結(jié)合肽的組合物可以用熒光或者其它方法標(biāo)記，用作觀察感興趣組織中鈣化區(qū)域的改良手段。這些肽合成方便且產(chǎn)量高，相比目前所用的方法，它們更安全、毒性更低和更易于使用?？梢愿淖冸牡男蛄谢蚪M成來改變肽對具體組織或類型表面的相對親和力。這能使所述肽區(qū)分牙質(zhì)、釉質(zhì)、骨和其它鈣化組織或表面，并區(qū)分健康和患病組織。這使這些化合物可以用作檢測鈣化組織中的損害或病理損傷的探針。這些可以單獨(dú)使用，也可與其它檢測鈣化的已知方法聯(lián)用。目前的鈣結(jié)合熒光團(tuán)僅限于能在螯合鈣離子的同時(shí)保留其熒光的那些，相比之下，本文所述肽可與任何熒光團(tuán)相連。這大大擴(kuò)展了可用來標(biāo)記鈣化表面的顏色，由此能夠針對每個(gè)實(shí)驗(yàn)精確制定發(fā)射波長和檢測技術(shù)。通過將所述肽與熒光、比色、放射性、NMR活性或其它染料或指示劑結(jié)合，再用這些結(jié)合物處理生物樣品，無需固定或?qū)悠吩斐蓢?yán)重干擾就可以定量觀察原位和體內(nèi)的鈣化程度。由于它們的高度特異性和快速結(jié)合，這類結(jié)合物的背景染色低于Kossa/銀離子染色方法?？膳c鈣結(jié)合肽相連的標(biāo)記種類繁多，這提供了極其靈活的結(jié)合條件和檢測方法，從而簡化了生物、生物醫(yī)藥、生物技術(shù)、環(huán)境和其它研究，并提高了質(zhì)量。
[0068]本文所述肽極有前景用作診斷劑，因?yàn)椋c目前主要依賴于目測或放射性觀察的確定鈣化組織損傷、感染、腫瘤或其它損害的方法不同，本文所述肽可不依賴于人眼地檢測這類事件。據(jù)顯示，本文所述DSS肽能特異性靶向去礦化釉質(zhì)和非去礦化牙質(zhì)。具體說，這些肽表現(xiàn)出優(yōu)先結(jié)合齲齒損傷的能力。此外，各種DSS肽變體表現(xiàn)出精確靶向牙齒結(jié)構(gòu)分部例如根尖牙質(zhì)、基部釉質(zhì)、外層牙質(zhì)、外層釉質(zhì)和釉表面的能力?？梢越o予對象含有與各種可檢測部分例如熒光、比色、放射性、NMR活性或其它染料或指示劑結(jié)合的鈣結(jié)合肽的組合物，從而靶向牙齒的特定部位，并確定那些表現(xiàn)出去礦化或其它損傷的牙齒部位?？梢赃x擇肽的氨基酸組成從而靶向特定的組織或組織損傷類型。利用這些肽能夠特異性確定損傷部位，包括那些曾因太小而看不見或者因?yàn)槠渌蚨：磺宓牟课?，大大增加了診斷這些部位的便利性和精確性。同樣，在某些實(shí)施方式中，含有本文所述鈣結(jié)合肽的組合物可以用作X-射線、計(jì)算機(jī)斷層攝影術(shù)或磁共振成像的造影劑。
[0069]在某些實(shí)施方式中，含有本文所述鈣結(jié)合肽的組合物可用將治療化合物靶向骨、牙齒或其它鈣化組織的表面。例如，肽可以與抗菌化合物、骨和牙齒發(fā)育調(diào)節(jié)劑或任何其它可以與肽結(jié)合的化合物結(jié)合。治療化合物與這些肽之一的結(jié)合物可用來使治療化合物集中到鈣化表面，從而提高化合物的局部濃度和增強(qiáng)效力。通過使所述化合物集中到感興趣的組織，這些肽能夠降低達(dá)到目標(biāo)效果所需的化合物濃度。增強(qiáng)效力之外，將治療化合物特異性靶向感興趣的組織能使非靶點(diǎn)組織免遭化合物可能造成的損害?？梢哉{(diào)節(jié)所述肽的組成或長度使它能特異性靶向組織的受損或患病部位。
[0070]在某些實(shí)施方式中，含有本文所述鈣結(jié)合肽的組合物可用來治療微生物感染，例如細(xì)菌感染。在這些實(shí)施方式中，所述肽可以與抗菌肽，例如2c-4、b-34或PL-135肽(SEQID NO分別是:26,30和32)相連。
[0071]基于本文公開的鈣結(jié)合肽選擇性結(jié)合鈣或磷酸鈣的能力，含有這些肽的組合物可以組合成探測器來檢測飲用水、廢水、工業(yè)溶液、食品、飲料、研究用品或任何需要確定鈣存在的溶液中的鈣。同樣，這些組合物可在例如工業(yè)、制造業(yè)、醫(yī)藥業(yè)、研究、家庭生活或個(gè)人應(yīng)用中用來控制礦物質(zhì)鈣沉淀。此外，可以采用這些組合物在例如細(xì)胞培養(yǎng)物、組織、實(shí)驗(yàn)動物、實(shí)驗(yàn)人對象或其它研究性應(yīng)用中用來確定各種鈣類礦物質(zhì)的存在或其數(shù)量。
[0072]本文公開的鈣結(jié)合肽可以直接或間接地與一種或多種結(jié)合配體或基團(tuán)共價(jià)或非共價(jià)地相連。這類結(jié)合配體包括但不限于:其它肽、多肽、蛋白質(zhì)、糖、核酸、脂質(zhì)、有機(jī)物、無機(jī)物、有機(jī)金屬化合物、治療部分，例如抗癌或抗菌劑?？梢耘c本文公開的鈣結(jié)合肽相連的結(jié)合配體或基團(tuán)的其它例子包括可檢測標(biāo)記，例如熒光團(tuán)、生色團(tuán)、親和標(biāo)簽、放射性標(biāo)記或自旋標(biāo)記。此外，可以用放射性或NMR活性同位素代替鈣結(jié)合肽內(nèi)或與之相連的結(jié)合配體或基團(tuán)內(nèi)的一個(gè)或多個(gè)原子。鈣結(jié)合肽和結(jié)合配體或基團(tuán)之間的連接可以發(fā)生在所述肽的氨基末端，所述肽的羧基末端或肽的內(nèi)部位點(diǎn)。在某些實(shí)施方式中，所述肽可以經(jīng)由氨基酸接頭例如三甘氨酸接頭序列與結(jié)合配體或基團(tuán)相連。
`[0073]可以經(jīng)由本領(lǐng)域任何已知方法施用含有本文所述鈣結(jié)合肽的組合物。這類方法包括但不限于:口服、胃腸道外、透皮、氣霧給藥或經(jīng)腸。可以采用牙膏、凝膠、漱口水(mouthwash)、漱口水(mouth rinse)、藥丸、藥片、膠囊、凝膠或粉末來實(shí)現(xiàn)“ 口服”給藥?；蛘撸梢詫⑺鼋M合物摻入食物、口香糖、糖果或飲料中?！拔改c道外”通常與注射相關(guān)聯(lián)，包括眶下、輸注、動脈內(nèi)、囊內(nèi)、心內(nèi)、皮內(nèi)、肌肉內(nèi)、腹膜內(nèi)、肺內(nèi)、脊柱內(nèi)、胸骨內(nèi)、膜內(nèi)、子宮內(nèi)、靜脈內(nèi)、蛛網(wǎng)膜下、囊下、皮下、透粘膜或透氣管注射?？梢圆捎镁植咳楦唷④浉嗷蛩幐?，或利用透皮貼實(shí)現(xiàn)“透皮”施用。在那些采用所述組合物治療牙病或改變牙齒特性如礦物質(zhì)密度的實(shí)施方式中，可以將它施用到受侵襲或靶點(diǎn)牙齒位點(diǎn)或其附近。同樣，在采用所述組合物來治療骨的某種狀況或用來改變骨特性的那些實(shí)施方式中，可以將它施用到受侵襲或靶點(diǎn)骨位點(diǎn)或其附近。
[0074]提供以下實(shí)施例更好地說明所提出的發(fā)明，不應(yīng)該解釋成限制本發(fā)明的范圍。就具體材料的提及而言，僅是出于說明的目的，而不是限制本發(fā)明。不運(yùn)用本發(fā)明能力和不背離本發(fā)明范圍時(shí)，本領(lǐng)域技術(shù)人員還可以開發(fā)等效手段或試劑。應(yīng)該理解在本文所述的過程中可以造出許多仍然術(shù)語本發(fā)明范圍內(nèi)的變體。本發(fā)明人的意圖是這類變體也包括在本發(fā)明范圍內(nèi)。
實(shí)施例
[0075]實(shí)施例1:DSS肽與羥磷灰石鈣的結(jié)合:
[0076]產(chǎn)生含有二重(2DSS,SEQ ID NO: 12)、四重(4DSS, SEQ ID NO: 13)、六重(6DSS,SEQ ID NO: 14)或八重(8DSS，SEQ ID NO: 15)Asp-Ser-Ser (DSS)重復(fù)的四種 DSS 肽。用熒光素標(biāo)記，將各種濃度的標(biāo)記肽(0-100μΜ)與定量(0.3mg)的比表面積為100m2/g羥磷灰石納晶(伯克利先進(jìn)生物材料公司(Berkeley Advanced Biomaterials, Inc.))混合。培育樣品10分鐘，接著離心除去羥磷灰石。根據(jù)480nm(熒光素標(biāo)記的吸收峰)處的光譜吸收來測定除去羥磷灰石前后混合物中的肽量。通過將終吸收(Af)和初(Ap吸收與初濃度(Po)的比值進(jìn)行比較[P#= (VAj)P0]來計(jì)算肽結(jié)合量。生成圖表說明平衡時(shí)，每m2羥磷灰石表面積的肽結(jié)合量和未結(jié)合肽的濃度。得到的等溫線根據(jù)蘭格繆爾等溫線(Langmuirisotherm,x/m = (KaN最高Ceq)/(I + KACeq)) (Calisl995)進(jìn)行擬合,用結(jié)合親和力(Ka)和親合力(Nis)共同描述分子的結(jié)合活性。Ka表示肽對羥磷灰石表面的親和力常數(shù)。該方程式中，x/m表示每單位羥磷灰石表面積結(jié)合的肽的摩爾量，Nis表示最高表面濃度(摩爾/m2)，Crai表示平衡時(shí)未結(jié)合肽的摩爾濃度。蘭格繆爾等溫線描述符合以下條件時(shí)分子與表面的結(jié)合情況:1)所有結(jié)合位點(diǎn)對肽具有相同的親和力；和2)肽將在表面上形成單層但不能積累更多層數(shù)。蘭格繆爾等溫線與實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)擬合良好說明上述條件成立，可以用這些親和力常數(shù)比較各肽。如圖1A所示，各種肽對羥磷灰石的結(jié)合親和力隨著DSS重復(fù)次數(shù)的增加而增加(2DSS (SEQ ID NO: 12)，Ka = 57，000M-1 ；4DSS (SEQ ID NO: 13)，Ka = 94，OOOM-1 ；8DSS (SEQ ID NO: 15)，Ka = 300，000M-1)。
[0077]對多種變體DSS肽進(jìn)行試驗(yàn)來確定各種氨基酸改變對結(jié)合親和力的影響。這些變體肽包括I位含有較長側(cè)鏈的四重復(fù)肽(4ESS，SEQ ID NO: 16)、2位和3位含有更多空間位阻羥基的 3 種四重復(fù)肽(4DTT，SEQ ID NO: 17 ；4NTT, SEQ ID N0:18和4ETT，SEQ IDNO: 19)、1位缺少帶電基團(tuán)的四 重復(fù)肽(4NSS，SEQ ID N0:20)、1位缺少帶電基團(tuán)的八重復(fù)肽(8ASS，SEQ ID NO: 21)和兩種2位和3位缺少羥基的八重復(fù)肽(8DAA，SEQ ID NO: 22 ；8NAA,SEQ ID N0:23)。通過將這些變體中每一種的結(jié)合等溫線與同樣大小的含DSS肽的等溫線比較，確定:除去負(fù)電荷殘基(4NSS (SEQ ID NO:20),KA=41, 000M-1 ；4NTT (SEQ ID NO: 18),KA=18，OOOiT1 ；8ASS (SEQ ID NO:21), KA=170, OOOM-1)(圖 1B、1C)或用蘇氨酸或丙氨酸代替絲氨酸殘基(4DTT (SEQ ID NO: 17)，KA=161, 000M-1 ；4ETT (SEQ ID NO: 19)，KA=61, 000M-1 ；8DAACSEQ ID NO:22),KA=300, OOOM^1)(圖1B、1C)顯著降低結(jié)合活性。同時(shí)換掉I位酸性殘基和絲氨酸導(dǎo)致結(jié)合親和力幾乎完全喪失(4NTT (SEQ ID N0:18)；8NAA (SEQ ID NO:23)，1=20,000?^)(圖1B、1C)。用谷氨酸殘基代替天冬氨酸殘基僅略微降低結(jié)合親和力(4ESS(SEQ ID NO: 16)，Ka=S1000M-1)(圖1B)。這些數(shù)據(jù)表明，酸性殘基和絲氨酸重復(fù)對這些肽對羥磷灰石表面的親合力至關(guān)重要。DSS被認(rèn)為是產(chǎn)生羥磷灰石結(jié)合活性的優(yōu)選重復(fù)序列，而所有變體肽在體外均顯示出顯著降低的羥磷灰石結(jié)合活性。
[0078]還試驗(yàn)了一種部分磷酸化的四重復(fù)DSS肽(4DSPS，SEQ ID N0:25)，結(jié)果顯示其具有與4DSS (SEQ ID NO: 13)相似的羥磷灰石結(jié)合親和力(KA=83，OOOiT1，比4DSS (SEQ IDNO: 13)的1=94,00(^%然而，所述4DSPS (SEQ ID NO:25)肽在HA表面上的結(jié)合位點(diǎn)明顯更多(4DSPS的N最高=1.2x10」摩爾/m2，4DSS (SEQ ID NO: 13)的則為5.8x10」摩爾/m2) ο
[0079]實(shí)施例2:DSS肽與牙齒的結(jié)合:
[0080]為了證明DSS肽能結(jié)合生物組織，將人牙齒矢狀切片在pH7.0的含有IOmMNaCl和50mM HEPES的12.5 μ M5 (6)羧基熒光素標(biāo)記6DSS (SEQ ID NO: 14)肽溶液中培育10分鐘。對照樣品的制備不用肽。洗滌經(jīng)處理的樣品，采用藍(lán)色激光(激發(fā)波長(λ) = 488nm)和FITC發(fā)射濾光鏡的共焦激光掃描顯微鏡(CLSM)成像。強(qiáng)熒光染色表明6DSS (SEQ IDNO: 14)結(jié)合到牙齒表面(圖1D)。假處理的對照切片未呈現(xiàn)熒光。肽結(jié)合僅限于牙質(zhì)(圖1D，左側(cè)淺色區(qū))，在釉質(zhì)區(qū)未見到結(jié)合(圖1D，右側(cè)深色區(qū))。
[0081]實(shí)施例3 =DSS肽與礦化的小鼠骨髓結(jié)節(jié)的結(jié)合:
[0082]將小鼠骨髓培養(yǎng)物在DMEM + 10%FBS中培養(yǎng)至鋪滿，然后用含有50 μ g/mL抗壞血酸和4πιΜβ-磷酸甘油的2.5μΜ5^)_羧基熒光素標(biāo)記6DSS (SEQ ID N0:14)或
2.5 μ M5 (6)-羧基熒光素標(biāo)記肽#3-1(錯義對照肽，SEQ ID NO: 24)的aMEM + 10%FBS溶液連續(xù)處理3周。通過采用FITC激發(fā)/發(fā)射濾光鏡組的熒光顯微鏡進(jìn)行培養(yǎng)物成像，獲得亮視野圖像和熒光圖像。在DSS處理樣品中觀察到強(qiáng)染色，如圖2B中中央結(jié)節(jié)塊中淺色所表示。對照樣品中未觀察到染色(圖2C、2D)，表明，在小鼠骨髓培養(yǎng)物中，6DSS (SEQ IDNO: 14)肽特異性結(jié)合礦化結(jié)節(jié)。
[0083]實(shí)施例4:固 定化DSS肽引起的磷酸鈣(CaHPOJ聚積:
[0084]將鏈霉親和素包被的平均直徑為4 μ m的聚苯乙烯珠子(球技術(shù)公司(SpherotechP.L.C.))與結(jié)合有生物素的8DSS (SEQ ID NO: 15)肽或無結(jié)合生物素共培育。用PBS洗滌珠子除去未結(jié)合肽(對照珠上未結(jié)合的生物素)，在PBS + ImM CaCl2 + ImM NaHPO4溶液中培育12天，然后成像。如圖3A所示，幾乎所有DSS肽包被的珠子均結(jié)合成非晶磷酸鈣沉淀的大聚集體。所有磷酸鈣大聚集體均與一個(gè)或多個(gè)珠子相關(guān)聯(lián)。比較可見，生物素封閉的對照樣品中，幾乎所有珠子均未聚集也未與沉淀相關(guān)聯(lián)(圖3B)。實(shí)驗(yàn)期間，多個(gè)肽包被珠子被更多有序排列的礦物質(zhì)層所覆蓋(代表性地如圖3C所示)，而無包裹/生物素封閉的對照珠子均沒有積累礦物質(zhì)(圖3D)。
[0085]實(shí)施例5:用DSS肽使降解的牙質(zhì)表面再礦化:
[0086]用摘取的人牙齒制作矢狀切片(Accutom-50，CA-231鉆石刀刃)，用19%乙二胺四乙酸(EDTA)凝膠去礦化I小時(shí)，接著浸入去離子水中超聲破碎除去多余碎屑。用含有12.5 μ M8DSS肽的50mM HEPES緩沖液(pH7.0)溶液、僅緩沖液(不含肽)處理樣品，或不處理。I小時(shí)以后，用夸爾脫敏劑(Quell Desensitizer,潘醇技術(shù)公司(Pentrontechnologies, LLC)), 一種氯化鈣和磷酸鉀的水溶液構(gòu)成的再礦化溶液，再礦化樣品15分鐘。徹底漂洗樣品，然后用掃描電子顯微鏡(SEM)成像。經(jīng)DSS處理的牙質(zhì)樣品積累了一層連續(xù)的磷酸鈣沉淀，完全閉塞了牙質(zhì)小管(圖4B)。假處理和未處理的樣品呈現(xiàn)出的礦物質(zhì)沉淀積累水平要低得多，牙質(zhì)小管仍然完全暴露(圖4A、4C、4D)。
[0087]實(shí)施例6 =DSS肽引起的羥磷灰石在牙齒釉質(zhì)和牙質(zhì)上的成核:
[0088]為了確定將DSS用于各種組織的制備物是否能促進(jìn)最終引起組織再礦化的HA成核，將矢狀切片的成人牙齒(取自普通臨床)用Streurs砂輪拋光，為成核實(shí)驗(yàn)作準(zhǔn)備。半數(shù)切片用35%磷酸去礦化15分鐘，然后用去離子水徹底漂洗。另一半不做處理。然后對所有樣品進(jìn)行5分鐘聲處理除去切割和打磨和/或去礦化產(chǎn)生的多余碎屑。用12.5 μ M8DSS(SEQ ID勵:15)的50禮HEPES緩沖液(pH7.0)溶液、純緩沖液處理樣品，或者不做處理。然后將樣品在模擬體液(SBFn)中浸4小時(shí)，以促進(jìn)羥磷灰石(HA)晶體成核。成核步驟后，將樣品浸入不含鎂和碳酸氫鹽的溶液(SBFg)中以允許成核后的HA晶體生長。表1顯示了SBFn和SBFg溶液與血漿的組成比較。將兩種溶液的pH調(diào)節(jié)到6.8。培養(yǎng)晶體，放大成核晶體以便通過SEM進(jìn)行觀察。
[0089]表1:SBFn和SBFg溶液組成:
【權(quán)利要求】
1.一種鈣結(jié)合肽，含有氨基酸序列(X-Y-Z)n，其中X-Y-Z選自:DSS、DAA、NAA、ESS、NSS、DTT, ETT和NTT，DSS中的絲氨酸被磷酸化，η是1_40的數(shù)，所述鈣結(jié)合肽結(jié)合磷酸鈣。
2.如權(quán)利要求1所述的肽，X-Y-Z是DSS，其中的絲氨酸被磷酸化。
3.如權(quán)利要求1所述的肽，X-Y-Z選自:ESS、NSS、DTT、ETT和NTT。
4.如權(quán)利要求3所述的肽，所述肽被磷酸化。
5.如權(quán)利要求3所述的肽，所述肽未磷酸化。
6.如權(quán)利要求1所述的肽，X-Y-Z選自:DAA和NAA。
7.如權(quán)利要求1-6中任一項(xiàng)所述的肽，所述鈣結(jié)合肽的長度約為3-100個(gè)氨基酸。
8.如權(quán)利要求1-7中任一項(xiàng)所述的肽，η是2-8的數(shù)。
9.如權(quán)利要求1-8中任一項(xiàng)所述的肽，所述鈣結(jié)合肽與熒光團(tuán)、生色團(tuán)、親和標(biāo)簽、抗原標(biāo)簽、放射性標(biāo)記和自旋標(biāo)記相連。
10.如權(quán)利要求1-8中任一項(xiàng)所述的肽，所述鈣結(jié)合肽與抗癌化合物或抗菌化合物相連。
11.如權(quán)利要求10 所述的肽，所述鈣結(jié)合肽與抗菌化合物相連。
12.如權(quán)利要求11所述的肽，所述鈣結(jié)合肽與抗菌肽相連。
13.如權(quán)利要求12所述的肽，所述抗菌肽經(jīng)由氨基酸接頭序列與所述鈣結(jié)合肽相連。
14.權(quán)利要求1-8中任一項(xiàng)所述肽用于制造減少以牙齒去礦化為特征的牙齒缺損的藥物的用途。
15.權(quán)利要求1-8中任一項(xiàng)所述肽用于制造治療以對象骨密度降低為特征的骨缺損的藥物的用途。
16.權(quán)利要求1-8中任一項(xiàng)所述肽用于制造藥物的用途，所述肽與可檢測標(biāo)記相連，所述藥物是用于確定以牙齒去礦化為特征的牙齒缺損的藥物。
17.權(quán)利要求1-8中任一項(xiàng)所述肽用于制造藥物的用途，所述肽與可檢測標(biāo)記相連，所述藥物是用于確定以骨去礦化為特征的骨缺損的藥物。
【文檔編號】C07K5/072GK103819538SQ201310728249
【公開日】2014年5月28日 申請日期:2006年9月27日 優(yōu)先權(quán)日:2005年9月28日
【發(fā)明者】D·亞布拉夫, 施文元, E·哈格曼, S·特塔迪斯, 齊鳳霞, 何堅(jiān), B·拉瑟福德, R·?？颂? B·吳 申請人:加利福尼亞大學(xué)董事會