專利名稱：Peg化的多肽的純化的制作方法
PEG化的多肽的純化本發(fā)明屬于用于純化多肽、尤其是PEG化的紅細胞生成素的色譜分離方法領域。
背景技術：
在當今的醫(yī)療產(chǎn)品中蛋白質(zhì)具有重要作用。對于人應用而言，每種治療性蛋白質(zhì) 均必須符合獨特的標準。為了確保生物藥物對人的安全性，尤其必須除去生產(chǎn)過程中累積 的副產(chǎn)物。為了滿足管理規(guī)范，在生產(chǎn)過程之后必須進行一個或多個純化步驟。其中，純度、 流通量和產(chǎn)率在確定適宜的純化方法中起重要作用。已確立了不同的方法并廣泛用于蛋白質(zhì)的純化，例如使用微生物蛋白的親和色譜 法(例如蛋白A或蛋白G親和色譜法)、離子交換色譜法(例如陽離子交換(磺丙基或羧甲 基樹脂)、陰離子交換(氨基乙基樹脂)和混合模式的離子交換)、親硫吸附色譜法(例如使 用β -巰基乙醇和其它SH配體)、疏水作用色譜法或芳烴吸附色譜法(例如使用苯基_瓊 脂糖、親氮雜_芳烴樹脂(aza-arenophilic resin)或間-氨基苯基硼酸)、金屬螯合親和 色譜法(例如使用Ni (II)-和Cu (II)-親和物質(zhì))、尺寸排阻色譜法和電泳方法(例如凝膠 電泳、毛細管電泳)(Vijayalakshmi, Μ. A.，Appl. Biochem. Biotech. 75(1998)93-102)。針對例如聚乙二醇(PEG)和白介素-6 (EP 0442724)、PEG和紅細胞生成素(TO 01/02017)、包含內(nèi)皮抑制素和免疫球蛋白的嵌合分子(US 2005/008649)、基于分泌的抗體 的融合蛋白(US 2002/147311)、包含白蛋白的融合多肽(US 2005/0100991 ；人血清白蛋白 US 5，876，969)、PEG化的多肽(US 2005/0114037)和干擾素融合物報道了綴合物。Necina, R.等人(Biotechnol. Bioeng. 60 (1998) 689-698)報道了 用表現(xiàn)出高電 荷密度的離子交換媒介物直接從細胞培養(yǎng)物上清液中捕獲人單克隆抗體。在WO 89/05157 中，報道了一種通過直接將細胞培養(yǎng)基進行陽離子交換處理純化免疫球蛋白產(chǎn)物的方法。 Danielsson, A.等人，J. Immun. Meth. 115 (1988)，79-88 描述了來自小鼠腹水的單克隆 IgG 抗體的一步純化。在WO 2004/024866中報道了一種通過離子交換色譜法純化多肽的方 法，其中使用梯度洗脫將感興趣的多肽與一種或多種污染物拆分開。在EP 0530447中，報 道了一種通過三個色譜步驟的組合純化IgG單克隆抗體的方法。Yu，G.等人在Process Biotechnol. 42(2007)971-977中報道了單PEG化的白介素-1受體拮抗劑的溫和純化。 Wang等人(Wang，H.等人，Peptides 26(2005) 1213-1218)報道了通過兩步陽離子交換 色譜法進行的對大腸桿菌(E.coli)中表達的hTFF3的純化。Yim等人(Yim，Q.等人， J. Biotechnol. 118(2005)67-74)報道了通過兩個連續(xù)的離子交換色譜步驟進行的對PEG 化的rhG-CSF的純化。WO 2007/039436和WO 01/087329報道了與聚(乙二醇)基團共價 連接的紅細胞生成素以及包含紅細胞生成素蛋白的液體藥物組合物。發(fā)明概述本發(fā)明包括純化單PEG化的紅細胞生成素的方法，其包括以下步驟提供包含 單_、多-和未-PEG化的紅細胞生成素的溶液，進行兩個連續(xù)的陽離子交換色譜步驟，和回 收在第二個陽離子交換色譜步驟中純化的單PEG化的紅細胞生成素，其中在所述兩個陽離 子交換色譜步驟中使用相同類型的陽離子交換材料。在所述方法的一個實施方案中，所述兩個連續(xù)的陽離子交換色譜步驟是使用不同的洗脫方法進行的。在另一個實施方案中，所述兩個連續(xù)的陽離子交換色譜步驟包括以下 步驟a)在適于所述單PEG化的紅細胞生成素與第一陽離子交換色譜柱中所含有的陽 離子交換材料結(jié)合的條件下，將包含單-、多-和未-PEG化的紅細胞生成素的混合物的緩沖 水溶液加樣在所述第一柱上，b)利用穿流緩沖液的離子強度步進增加的分步洗脫方法從第一陽離子交換色譜 柱上回收單PEG化的紅細胞生成素，其中與步驟a)中加樣的混合物相比，所述單PEG化的 紅細胞生成素的分數(shù)增加，c)在適于所述單PEG化的紅細胞生成素與第二陽離子交換色譜柱中所含有的陽 離子交換材料結(jié)合的條件下，將回收的單PEG化的紅細胞生成素加樣在所述第二柱上，其 中所述第二柱中所含有的陽離子交換材料與第一柱中的陽離子交換材料是相同類型的，d)利用穿流緩沖液的離子強度連續(xù)增加的連續(xù)洗脫方法從所述第二陽離子交換 色譜柱上回收基本同質(zhì)的形式的純化的單PEG化的紅細胞生成素。在所述方法的一個實施方案中，陽離子交換材料是強陽離子交換材料。在一個優(yōu) 選的實施方案中，陽離子交換材料是磺丙基陽離子交換材料。尤其優(yōu)選的是Toyopearl SP 650M。在另一個實施方案中，單PEG化的紅細胞生成素在步驟d)中以大于95面積 純度的基本同質(zhì)的形式被回收。在所述方法的另一個實施方案中，所述方法的步驟b)中的 離子強度的步進增加是兩步離子強度增加。優(yōu)選地，在所述分步洗脫方法的第二步、即在離 子強度第二次增加后回收單PEG化的紅細胞生成素。本發(fā)明的另一方面是制備單PEG化的紅細胞生成素的方法，其包括以下步驟a)使用PEG化試劑將紅細胞生成素PEG化，b)使用兩個連續(xù)的陽離子交換色譜步驟純化PEG化的紅細胞生成素，其中第一和 第二陽離子交換色譜采用相同類型的陽離子交換材料，c)從第二陽離子交換色譜柱上回收基本同質(zhì)的形式的單PEG化的紅細胞生成素。發(fā)明詳述本發(fā)明包括純化單PEG化的紅細胞生成素的方法，其包括兩個陽離子交換色譜步 驟，其中在所述兩個陽離子交換色譜步驟中使用相同類型的陽離子交換材料。本申請中所用的術語“離子交換材料”表示不動的高分子量基質(zhì)，其帶有共價結(jié)合 的荷電取代基，用作離子交換色譜的固定相。為了達到整體電荷中性，非共價結(jié)合的抗衡離 子與之結(jié)合?！半x子交換材料”具有將其非共價結(jié)合的抗衡離子交換成周圍溶液中的類似荷 電的離子的能力。根據(jù)其可交換的抗衡離子的電荷，“離子交換樹脂”被歸類為陽離子交換 樹脂或陰離子交換樹脂。根據(jù)荷電基團(取代基)的性質(zhì)，“離子交換樹脂”例如在陽離子 交換樹脂的情況下被歸類為磺酸樹脂(S)或磺丙基樹脂(SP)或羧甲基樹脂(CM)。根據(jù)荷 電基團/取代基的化學性質(zhì)，“離子交換樹脂”又可以分為強或弱離子交換樹脂，這取決于共 價結(jié)合的荷電取代基的強度。例如，強陽離子交換樹脂具有磺酸基、優(yōu)選具有磺丙基作為荷 電取代基，弱陽離子交換樹脂具有羧基、優(yōu)選具有羧甲基作為荷電取代基，弱陰離子交換樹 脂具有二乙氨基乙基作為荷電取代基。不同類型的離子交換材料(即固定相)可以以不同的名稱、從許多公司獲得，例 如，陽離子交換材料Bio-Rex (例如70型)、Chelex (例如100型)、Macro-Prep (例如 CM、High S、25S 型)、AG (例如通、MP 型)均可從 BioRad Laboratories 獲得， WCX 2 可從 Ciphergen 獲得，Dowex MAC-3 可從 Dow 化學公司獲得，Mustang C 和 Mustang S 可從 PallCorporation 獲得，Cellulose CM(例如 23、52 型)、hyper—D、partisphere 可 從 Whatman pic.獲得，Amberlite IRC(例如 76、747、748 型)、Amberlite GT 73、 Toyopearl (例如 SP、CM、650M 型)均可從 TosohBioscience GmbH 獲得，CM 1500 和 CM 3000 可從 BioChrom Labs 獲得，SP-S印harose 、CM-S印harose 可從 GE Healthcare 獲得， Poros 樹脂可從 PerS印tive Biosystems 獲得，Asahipak ES (例如 502C 型)、CXpak P、IEC CM (例如 825、2825、5025、LG 型)、IEC SP (例如 420N、825 型)、IEC QA (例如 LG、825 型) 可從 Shoko America Inc.獲得，50W 陽離子交換樹脂可從 Eichrom Technologies Inc.獲
得。優(yōu)選地，陽離子交換材料是強陽離子交換材料，例如Macro-Prep High S或25S、或 MacroCap SP、或Toyopearl SP 650M、或 Source S、或 SP S印harose、或POLYCAT A。舉例 性的陰離子交換材料有可從Dow化學公司獲得的Dowex 1、可從Bi0Rad Laboratories 獲得的AG (例如 U、4 型)、Bio-Rex 5、DEAEBio-Gel 1、Macro-Prep DEAE、可 從Eichrom Technologies Inc.獲得的1型陰離子交換樹脂、可從GE Healthcare獲得的 Source Q、ANX S印harose4、DEAE S印harose (例如 CL-6B、FF 型)、Q S印harose、Capto Q、CaptoS、可從 PerkinElmer 獲得的 AX-300、可從 Shoko America Inc.獲得的 Asahipak ES-502C、AXpak WA (例如 624、G 型)、IEC DEAE,可從 TosohBioscience GmbH 獲得的
Amberlite IRA"96> Toyopearl DEAE, TSKgelDEAE、可從 Pall Corporation 獲得的 Mustang Q0在一個實施方案中，陽離子交換材料是磺丙基陽離子交換材料。術語“相同類型的陽離子交換材料”表示采用完全一致的陽離子交換材料進行兩 個連續(xù)的離子交換色譜步驟。這意味著，所述連續(xù)的陽離子交換色譜步驟是通過對第一個 陽離子交換色譜步驟使用第一份陽離子交換材料并且對第二個陽離子交換色譜步驟使用 第二份相同的陽離子交換材料或者對兩個陽離子交換色譜步驟使用相同的陽離子交換材 料來進行的。在一個實施方案中，第二陽離子交換材料與第一陽離子交換材料是相同類型 的陽離子交換材料，但不是同一份陽離子交換材料。術語“分步洗脫”和“分步洗脫方法”在本申請中可互換使用，表示一種方法，其中 例如導致洗脫(即結(jié)合的化合物從材料上解離下來)的物質(zhì)的濃度立刻升高或降低，即從 一個值/水平直接升高或降低至下一個值/水平。在該“分步洗脫”中，一個或多個條件例 如PH、離子強度、鹽濃度和/或色譜流速均立刻從第一值、例如起始值變?yōu)榈诙?、例如?終值，即條件是遞增變化的，即不同于線性變化的步進變化。在“分步洗脫方法”中，離子強 度每次升高后均收集新的級分。該級分含有隨著離子強度的相應增加從離子交換材料上回 收的化合物。每次增加后，保持條件不變，直到洗脫方法的下一步驟。在“分步洗脫”中，一個 或多個條件均立刻從第一值、例如起始值變?yōu)榈诙怠⒗缱罱K值。在一個實施方案中，所 述變化是導致洗脫的物質(zhì)濃度的10%或10%以上。也就是說，在該實施方案中，導致洗脫 的物質(zhì)的濃度在第一步中是100%，在第二步中是110%或110%以上，在第三步中是120% 或120%以上。在另一個實施方案中，所述變化是導致洗脫的物質(zhì)的濃度的50%或50%以 上。在另一個實施方案中，所述變化是導致洗脫的物質(zhì)的濃度的120%或120%以上?！胺植较疵摗北硎緱l件是遞增變化的，即不同于線性變化的步進變化。術語“連續(xù)洗脫”和“連續(xù)洗脫方法”在本申請中可互換使用，表示一種方法，其中 例如導致洗脫(即結(jié)合/吸附的化合物從色譜材料上解離下來)的物質(zhì)的濃度連續(xù)升高或 降低，即濃度通過一個序列的多個小步驟進行變化，每個小步驟的變化不大于引起洗脫的 物質(zhì)的濃度的2%、優(yōu)選1%。在該“連續(xù)洗脫”中，一個或多個條件例如pH、離子強度、鹽濃 度和/或色譜流速可以線性或指數(shù)式或漸近地變化。優(yōu)選所述變化是線性的。本申請中所用的術語“加樣”及其語法上的等價表述表示純化方法的一個部分步 驟，其中使含有待純化的感興趣的物質(zhì)的溶液與固定相接觸。這表示a)將溶液加入固定 相位于其中的色譜裝置中，或b)將固定相加入溶液中。在a)的情況下，含有待純化的感 興趣的物質(zhì)的溶液通過固定相、從而使固定相與溶液中的物質(zhì)相互作用而被純化。根據(jù)條 件例如PH、電導率、鹽濃度、溫度和/或流速，溶液中的一些物質(zhì)與固定相結(jié)合，從而被從 溶液中除去。其它物質(zhì)留在溶液中。留在溶液中的物質(zhì)能在穿流液中找到?！按┝饕骸北?示通過色譜裝置后獲得的溶液，其可以是加樣的含有感興趣的物質(zhì)的溶液或者用于沖洗柱 或?qū)е乱环N或多種與固定相結(jié)合的物質(zhì)洗脫的緩沖液。在一個實施方案中，色譜裝置是 柱或板(cassette)。能通過本領域技術人員熟悉的方法例如沉淀法、鹽析法、超濾、滲濾 (diafiltration)、冷凍干燥、親和色譜法或減少溶劑體積從純化步驟后的溶液中回收感興 趣的物質(zhì)，從而以基本均質(zhì)的形式獲得感興趣的物質(zhì)。在b)的情況下，將固定相加入、例如 以固體形式加入含有待純化的感興趣的物質(zhì)的溶液中，從而使固定相與溶液中的物質(zhì)相互 作用。相互作用后，取出固定相，例如通過過濾取出固定相，感興趣的物質(zhì)與固定相結(jié)合，與 其一起從溶液中被取出，或者感興趣的物質(zhì)不與固定相結(jié)合，留在溶液中。本申請中所用的術語“在適于......結(jié)合的條件下”及其語法上的等價表述表示
感興趣的物質(zhì)例如PEG化的紅細胞生成素當與固定相例如離子交換材料接觸時與之結(jié)合。 這不必然表示100%感興趣的物質(zhì)與固定相結(jié)合，而表示基本100%感興趣的物質(zhì)與固定 相結(jié)合，即至少50%感興趣的物質(zhì)與固定相結(jié)合、至少75%感興趣的物質(zhì)與固定相結(jié)合、 至少85%感興趣的物質(zhì)與固定相結(jié)合或者95%以上感興趣的物質(zhì)與固定相結(jié)合。本申請中所用的術語“緩沖”表示其中由于酸性或堿性物質(zhì)的加入或釋放導致的 PH變化被緩沖物質(zhì)所消除。能使用任何產(chǎn)生該效果的緩沖物質(zhì)。優(yōu)選使用可藥用的緩沖物 質(zhì)，例如磷酸或其鹽、乙酸或其鹽、檸檬酸或其鹽、嗎啉、2-(N-嗎啉代)乙磺酸或其鹽、組氨 酸或其鹽、甘氨酸或其鹽或者三(羥甲基)氨基甲烷(TRIS)或其鹽。在一個實施方案中， 使用磷酸或其鹽或者乙酸或其鹽或者檸檬酸或其鹽或者組氨酸或其鹽作為緩沖物質(zhì)。緩沖 溶液可以任選包含另外的鹽，例如氯化鈉、硫酸鈉、氯化鉀、硫酸鉀、檸檬酸鈉或檸檬酸鉀。本領域技術人員了解一般的色譜方法及其使用。參見例如Chromatography， 第 5 版，A 部 分！Fundamentals and Techniques, Heftmann, Ε·(編 輯)，Elsevier Science Publishing Company, 紐 約，(1992) ；Advanced Chromatographic and Electromigration Methods in Biosciences, Deyl, Z.(編輯)，Elsevier Science BV,阿 姆斯特丹，荷蘭，(1998) ；Chromatography Today, Poole, C. F.，和 Poole，S. K.，Elsevier SciencePublishing Company，紐約，(1991) ；Scopes, Protein Purification :Principles and Practice (1982) ；Sambrook, J·等人(編■ )，MolecularCloning :A Laboratory Manual,第 2 版，Cold Spring Harbor LaboratoryPress, Cold Spring Harbor, N. Y.,1989 ；或 Current Protocols in MolecularBiology, Ausubel, F. Μ.等人(編輯)，John ffiley&Sons, Inc.，紐約。紅細胞生成素的PEG化通常產(chǎn)生不同化合物的混合物，所述不同化合物例如多 PEG化的紅細胞生成素、單PEG化的紅細胞生成素、未-PEG化的紅細胞生成素、活性PEG酯 的水解產(chǎn)物例如游離的PEG化的酸以及紅細胞生成素本身的水解產(chǎn)物。為了獲得基本同質(zhì) 的形式的單PEG化的紅細胞生成素，必須對這些物質(zhì)進行分離，必須純化感興趣的化合物。因此，本發(fā)明的一個方面提供了獲得基本同質(zhì)的形式的單PEG化的紅細胞生成素 的方法，其包括以下步驟a)使用分子量為20kDa至40kDa的活性PEG化試劑將紅細胞生成素PEG化，b)使用兩個連續(xù)的陽離子交換色譜步驟純化步驟a)中獲得的PEG化的紅細胞生 成素，其中第一個和第二個陽離子交換色譜步驟采用相同類型的陽離子交換材料，c)從第二陽離子交換色譜柱上回收基本同質(zhì)的形式的單PEG化的紅細胞生成素。該方法尤其用于純化PEG化的重組多肽，所述多肽是糖基化的，即其已被哺乳動 物細胞、優(yōu)選CHO細胞、HEK293細胞、BHK細胞、Per.C6 細胞或HeLa細胞產(chǎn)生并且之后被 化學PEG化。在所述方法的第一步中，紅細胞生成素被PEG化。PEG化反應中所用的聚(乙二 醇)(PEG)聚合物分子具有約20kDa至40kDa的分子量(此處所用的“分子量”應當被理解 為PEG的平均分子量，因為PEG作為聚合物不是以一種確定的分子量被獲得的，事實上是具 有一種分子量分布；術語“約”表示在所述的PEG制品中，一些分子的重量大于標示分子量， 一些分子的重量小于標示分子量，即術語“約”是指這樣一種分子量分布其中95%的PEG 分子具有+/-10%標示分子量以內(nèi)的分子量。例如，30kDa的分子量表示27kDa至33kDa的 范圍。術語“紅細胞生成素”是指具有序列SEQ ID NO 1或SEQ ID NO 2的蛋白質(zhì)，或 者基本上與之同源的蛋白質(zhì)或多肽，其生物學性質(zhì)與刺激紅細胞產(chǎn)生和刺激骨髓中定向紅 系祖細胞的分裂和分化有關?？梢岳弥亟MDNA技術或利用內(nèi)源性基因活化通過在真核細 胞中例如在CHO細胞或BHK細胞或Hela細胞中表達來制備重組紅細胞生成素。例如，如 US 5，733，761、US 5，641，670、US 5，733，746、WO 93/09222、WO 94/12650、WO 95/31560、 WO 90/11354、WO 91/06667和WO 91/09955中所報道的那樣，通過內(nèi)源性基因活化表達紅 細胞生成素糖蛋白。在一個實施方案中，本發(fā)明的紅細胞生成素基于人EPO的序列。在另 一個實施方案中，人紅細胞生成素具有SEQ ID NO :1或SEQ ID NO 2中所列出的氨基酸序 列，優(yōu)選地，人紅細胞生成素具有SEQ ID NO :1中所列出的氨基酸序列。術語“紅細胞生成 素”還表示SEQ ID NO :1或SEQ ID NO :2的蛋白質(zhì)的變體，其中一個或多個氨基酸殘基被 改變、缺失或插入，并且其具有與未修飾的蛋白質(zhì)相同的生物學活性，例如EP 1064951或 US 6，583，272中所報道的那些。變體可以具有含有1_6個另外的糖基化位點的人紅細胞生 成素的氨基酸序列。PEG化的紅細胞生成素的比活性能通過本領域已知的多種測定法來測 定。本發(fā)明的純化的PEG化的紅細胞生成素的生物活性使得通過給人類患者注射施用所述 蛋白質(zhì)導致其骨髓細胞與未注射或?qū)φ战M的患者相比網(wǎng)織紅細胞和紅細胞的產(chǎn)生增加。能 通過 Pharm. Europa Spec. Issue Erythropoietin BRP Bio 1997(2)的方法測試根據(jù)本發(fā) 明獲得和純化的PEG化的紅細胞生成素的生物活性。
本發(fā)明的“PEG”或“PEG基團”意指含有聚(乙二醇)作為基本部分的殘基。所述 PEG能含有對于結(jié)合、即綴合、反應而言必要的其它化學基團，其由分子的化學合成產(chǎn)生，或 者就分子各部分的最佳距離而言其是間隔基。這些其它化學基團不用于計算PEG聚合物分 子的分子量。此外，所述PEG能由一個或多個連接在一起的PEG側(cè)鏈組成。具有一個以上 PEG鏈的PEG被稱為多臂或分支PEG。分支PEG能例如通過將聚環(huán)氧乙烷加入各種多元醇 (包括甘油、季戊四醇和山梨醇)中來制備。分支PEG在例如EP 0473084,US 5，932，462中 有描述。在一個實施方案中，使用線性PEG分子作為分子量為20-35kDa的PEG，使用分支 PEG作為分子量大于35kDa、尤其是分子量為40kDa的PEG聚合物。在一個實施方案中，使 用雙臂PEG作為PEG 40kDa。術語“PEG化”意指聚(乙二醇)殘基在內(nèi)在賴氨酸殘基和/或多肽的N-末端 處的共價連接。蛋白質(zhì)的PEG化在現(xiàn)有技術中是公知的，綜述于例如Veronese，F(xiàn). Μ.， Biomaterials 22 (2001) 405-417中。能使用不同的官能團和具有不同分子量的聚乙二 醇、線性和分支PEG以及不同的連接基團連接PEG(還參見Francis，G. Ε.等人，Int. J. Hematol. 68(1998) 1-18 ；Delgado, C.等 人，Crit. Rev. Ther. Drug Carrier Systems 9(1992)249-304)。能如例如WO 00/44785中所述用PEG化試劑在水溶液中進行紅細胞 生成素的PEG化，在一個實施方案中，使用NHS-活性線性或分支PEG分子(分子量為 5kDa至40kDa)進行紅細胞生成素的PEG化。也能根據(jù)Lu，Y.等人，ReactivePolymers 22(1994)221-229在固相上進行PEG化。非任意地，N-末端PEG化的多肽也能根據(jù)WO 94/01451 制備。所述方法產(chǎn)生了在賴氨酸殘基的一個或多個ε -氨基處和/或在N-末端氨基處 被PEG化的紅細胞生成素。在N-末端氨基酸處的選擇性PEG化能根據(jù)Felix，A.M.等人， ACS Symp. Ser. 680 (Poly (ethylene glycol)) (1997)218-238 進行。選擇性 N-末端 PEG 化 能在固相合成過程中通過將N α -PEG化的氨基酸衍生物偶聯(lián)到肽鏈的N-I末端氨基酸上來 實現(xiàn)。側(cè)鏈PEG化能在固相合成過程中通過將Ne-PEG化的賴氨酸衍生物偶聯(lián)到生長鏈上 來進行。如上所述在固相合成內(nèi)或通過將活性PEG試劑加至氨基脫保護的肽上經(jīng)由液相合 成進行N-末端和側(cè)鏈的組合PEG化是可行的。合適的PEG衍生物是平均分子量為約5至約40kDa的活性PEG分子，在一個實施 方案中是平均分子量為約20至約40kDa、優(yōu)選約30kDa至約35kDa的活性PEG分子。在一 個實施方案中，PEG衍生物是線性或分支PEG。適合用于制備PEG-蛋白質(zhì)和PEG-肽綴合物 的各種 PEG 衍生物能從 Shearwater Polymers (Huntsville, AL, U. S. Α. ；www. nektar. com)獲得?；钚訮EG衍生物在本領域中是已知的，其在例如Morpurgo，M.等人，J. Bioconjug. Chem. 7 (1996) 363-368中有描述(針對PEG-乙烯基砜)。線性鏈和分支鏈PEG種類適合用 于制備PEG化的片段?；钚訮EG試劑的實例有碘-乙酰基-甲氧基-PEG或甲氧基-PEG-乙 烯基砜(m優(yōu)選是約450至約900的整數(shù)，R是具有1至6個碳原子的直鏈或支鏈C1-至 C6-烷基，例如甲基、乙基、異丙基等，其中在一個實施方案中R =甲基) 這些碘代活性物質(zhì)的使用是本領域已知的，例如Hermanson，G. T在Bioconjugate Techniques, Academic Press, San Diego (1996) p. 147-148 中對其進行了描述。在一個實施方案中，所述PEG種類是活性PEG酯，例如丙酸N-羥基琥珀酰亞胺酯 或丁酸N-羥基琥珀酰亞胺酯或N-羥基琥珀酰亞胺類例如PEG-NHS (Monfardini, C.等人， Bioconjugate Chem. 6 (1995) 62-69)。在一個實施方案中，所述活性N-羥基琥珀酰亞胺酯 是 使用烷氧基-PEG-N-羥基琥珀酰亞胺，例如甲氧基-PEG-N-羥基琥珀酰亞胺(MW 30000 ；Shearwater Polymers，Inc.)，其中R和m如上文所定義。在一個實施方案中，所述 PEG種類是甲氧基聚(乙二醇)_ 丁酸的N-羥基琥珀酰亞胺基酯。術語“烷氧基”是指烷 基醚基團，其中術語“烷基”意指含有至多4個碳原子的直鏈或支鏈烷基，例如甲氧基、乙氧 基、正-丙氧基等，優(yōu)選甲氧基。本申請中所用的術語“基本同質(zhì)的形式”表示所獲得的、所含有的或所使用的PEG 化的紅細胞生成素是具有確定數(shù)量的附加PEG基團的那些。在一個實施方案中，PEG化的紅 細胞生成素是單PEG化的紅細胞生成素。該制品可以含有未反應的(即缺少PEG基團的) 紅細胞生成素、多PEG化的紅細胞生成素以及在PEG化反應過程中產(chǎn)生的多肽片段。在一個 實施方案中，術語“基本同質(zhì)的形式”表示單PEG化的紅細胞生成素制品含有至少50% (w/ w)單PEG化的紅細胞生成素、至少75%單PEG化的紅細胞生成素、至少90%單PEG化的紅 細胞生成素或95%以上單PEG化的紅細胞生成素。所述百分比數(shù)值是以對應于由其獲得單 PEG化的紅細胞生成素的陽離子交換色譜純化的色譜圖的面積％為基礎的。本申請報道了一種純化單PEG化的紅細胞生成素以獲得基本同質(zhì)的形式的單PEG 化的紅細胞生成素的方法。已經(jīng)令人驚訝地發(fā)現(xiàn)，采用相同類型的陽離子交換材料的兩 個連續(xù)的陽離子交換色譜步驟的組合提供了基本同質(zhì)的形式的單PEG化的紅細胞生成素。 因此本發(fā)明提供了一種純化單PEG化的紅細胞生成素的方法，其包括以下步驟提供包含 單_、多-和未-PEG化的紅細胞生成素的溶液，進行兩個連續(xù)的陽離子交換色譜步驟，和回 收在第二個陽離子交換色譜步驟中純化的單PEG化的紅細胞生成素，其中在所述兩個陽離 子交換色譜步驟中使用相同類型的陽離子交換材料。在一個實施方案中，第一個陽離子交 換色譜步驟中的回收與第二個陽離子交換色譜步驟中的回收是通過不同的洗脫方法進行的。在另一個實施方案中，陽離子交換色譜柱在第一個陽離子交換色譜步驟后和在第二個 陽離子交換色譜步驟后被再生。在第二個陽離子交換色譜步驟中，回收純化的單PEG化的紅細胞生成素是通過從 第二陽離子交換色譜材料上洗脫單PEG化的紅細胞生成素進行的。在本發(fā)明的方法的一個 實施方案中，兩個陽離子交換色譜步驟采用的洗脫方法不同。在該實施方案中，第一個陽離 子交換色譜步驟以分步洗脫方法進行，即所用緩沖液的離子強度步進增加，即從一個離子 強度值立刻變?yōu)橄乱粋€離子強度值，優(yōu)選以10%或10%以上的變化步進增加。在一個實施 方案中，該分步洗脫方法以三步洗脫方法進行。在第一步中，主要將多PEG化的紅細胞生成 素從陽離子交換色譜柱上洗脫下來。離子強度的第二次增加基本上將單PEG化的紅細胞生 成素洗脫下來，基于對應的尺寸排阻色譜圖面積，其純度大于60% (面積_%)。離子強度 的第三次增加主要將剩余的未PEG化的紅細胞生成素從柱上洗脫下來。在一個實施方案中，第二個陽離子交換色譜步驟以連續(xù)洗脫方法進行，即緩沖液 的離子強度連續(xù)增加、優(yōu)選以小于5%的變化連續(xù)增加。合并洗脫的含有單PEG化的紅細胞 生成素的級分以獲得基本同質(zhì)的形式的單PEG化的紅細胞生成素。在一個實施方案中，基 于對應的色譜圖的面積其含有小于0.5%的低分子量形式。緩沖液的濃度優(yōu)選是IOmM至 250mM,在一個實施方案中是50mM至150mM，在另一個實施方案中是約100mM。因此，在本發(fā) 明的方法中，所述兩個連續(xù)的陽離子交換色譜步驟是以下步驟a)在適于所述單PEG化的紅細胞生成素與第一陽離子交換色譜柱中所含有的陽 離子交換材料結(jié)合的條件下，將包含單-、多-和未-PEG化的紅細胞生成素以及低分子量形 式的混合物的緩沖水溶液加樣在所述第一柱上，b)利用穿流緩沖液的離子強度步進增加的分步洗脫方法從第一陽離子交換色譜 柱上回收單PEG化的紅細胞生成素，其中與步驟a)中加樣的混合物相比，所述單PEG化的 紅細胞生成素在回收溶液中的相對含量增加，c)在適于所述紅細胞生成素與第二陽離子交換色譜柱中所含有的陽離子交換材 料結(jié)合的條件下，將步驟b)中回收的單PEG化的紅細胞生成素加樣在所述第二柱上，其中 所述第二柱中所含有的陽離子交換材料與第一柱中的陽離子交換材料是相同類型的，d)利用穿流緩沖液的離子強度連續(xù)增加的連續(xù)洗脫方法從所述第二陽離子交換 色譜柱上回收基本同質(zhì)的形式的純化的單PEG化的紅細胞生成素。多肽的PEG化通常不提供同質(zhì)的形式的PEG化產(chǎn)物。其以單PEG化、多PEG化和 未PEG化產(chǎn)物的混合物的形式被獲得。因此，所述方法的步驟a)中加樣的PEG化的紅細胞 生成素的溶液是單_、多-和未-PEG化的紅細胞生成素以及低分子量形式或片段在緩沖水 溶液中的混合物。這些不同物質(zhì)的相對含量是用尺寸排阻色譜法(SE-HPLC)測定的。圖1 給出了一幅舉例性的色譜圖。圖1中相關峰面積、即峰下面積的總和是尺寸排阻色譜圖的 總面積。單個峰的分數(shù)以面積_%、即色譜圖總面積的相對面積分數(shù)的形式給出。—般色譜方法、其使用和有關術語是本領域技術人員已知的，參見例如 Chromatography,第 5 版，Part A !Fundamentals and Techniques, Heftmann, Ε.(編輯), Elsevier Science Publishing Company，紐約，(1992)和其它相關教科書。在色譜處理過 程中，緩沖液穿過陽離子交換色譜柱流動。根據(jù)色譜方法步驟的要求對該“穿流緩沖液”進 行調(diào)節(jié)。其將感興趣的物質(zhì)運送至(加樣)并運送出(洗脫)色譜材料。
在第一個陽離子交換色譜步驟中，將單PEG化、多PEG化和未PEG化的紅細胞生成 的混合物以0. 7至1. 5mg/ml、優(yōu)選約lmg/ml的蛋白質(zhì)濃度在緩沖水溶液中加樣到第一陽 離子交換色譜柱上。在一個實施方案中，所述緩沖水溶液含有約IOOmM磷酸鉀，pH約3.0。 本申請中所用的術語“約”表示給定值10%左右、即士 10%的范圍。在一個實施方案中，在 加樣前和加樣后，將所述第一柱用相同的緩沖液洗滌。在洗脫方法的第一步中，將緩沖液 變?yōu)楹屑sIOOmM磷酸鉀、約90mM氯化鈉的pH約3. 0的緩沖液。用該緩沖液將水解的活 性PEG試劑、即相應的PEG化的碳酸、未反應的偶聯(lián)試劑和多PEG化的紅細胞生成素從陽離 子交換色譜柱上洗脫下來。在三步洗脫方法的第二步中，將緩沖液變?yōu)楹屑sIOOmM磷酸 鉀、約250mM氯化鈉的pH約3. 0的緩沖液。在該步中單PEG化的紅細胞生成素被從第一陽 離子交換色譜柱上回收。將收集的該洗脫步驟的穿流緩沖液用純水稀釋約1 5(v/v)至 1 8(v/v)、優(yōu)選1 5(v/v)。圖2給出了一幅舉例性的第一陽離子交換色譜圖。在三步 洗脫方法的第三步中，將緩沖液變?yōu)楹屑sIOOmM磷酸鉀、約750mM氯化鈉的pH約3. 0的 緩沖液。在該步中未-PEG化的紅細胞生成素被從第一陽離子交換色譜柱上回收。收集的第一陽離子交換色譜的第二步的穿流緩沖液含有相對含量增加的單PEG 化的紅細胞生成素，即與第一個陽離子交換色譜步驟之前相比，單PEG化的紅細胞生成素 的重量或面積(在收集的第二步的穿流緩沖液的尺寸排阻色譜法的色譜圖中)分數(shù)增 加。在一個實施方案中，單PEG化的紅細胞生成素的相對含量是至少60面積-%。在另一 個實施方案中，單PEG化的紅細胞生成素的相對含量是至少80面積。為了進一步純化單PEG化的紅細胞生成素，進行第二個陽離子交換色譜步驟。在 該第二陽離子交換色譜中，將被調(diào)節(jié)至磷酸鉀濃度為約IOOmM且pH為約3. 0的收集的和稀 釋的第二個洗脫步驟的穿流緩沖液加樣到含有與第一陽離子交換色譜柱相同類型的陽離 子交換材料的第二陽離子交換色譜柱上。在一個實施方案中，第二陽離子交換柱和其中所 含有的陽離子交換材料與第一個陽離子交換色譜步驟中的相同。通過應用線性梯度從第二 陽離子交換色譜柱上回收單PEG化的紅細胞生成素，所述線性梯度以pH約3. 0的含有約 50mM氯化鈉的濃度約IOOmM的磷酸鉀緩沖液開始，以pH約3. 0的含有約500mM氯化鈉的濃 度約IOOmM的磷酸鉀緩沖液結(jié)束。氯化鈉濃度歷經(jīng)十倍柱體積的變化是線性的。分級收集 穿流緩沖液，將每個級分用IM磷酸氫二鉀稀釋以將pH值升高至約pH 6-8。圖3給出了一 幅舉例性的色譜圖。在第二個陽離子交換色譜步驟后，獲得了基本同質(zhì)的形式的單PEG化的紅細胞生 成素，在一個實施方案中其純度為以面積計至少95%。本領域技術人員熟知離子交換色譜技術。在回收與陽離子交換材料結(jié)合的多肽的 步驟中，增加穿過離子交換柱的緩沖液/溶液的離子強度，即電導率。這能通過增加緩沖鹽 濃度或通過向緩沖液中加入其它鹽(所謂的洗脫鹽)來實現(xiàn)。根據(jù)洗脫方法的不同，通過 分級加入緩沖鹽或洗脫鹽濃溶液立刻(分步洗脫方法)或連續(xù)(連續(xù)洗脫方法)增加緩沖 液/鹽濃度。優(yōu)選的洗脫鹽有檸檬酸鈉、氯化鈉、硫酸鉀、磷酸鈉、氯化鉀、硫酸鉀、磷酸鉀或 其它檸檬酸或磷酸鹽，或這些組分的任意混合物。在一個實施方案中，洗脫鹽是檸檬酸鈉、 氯化鈉、氯化鉀或其混合物。在本方法的一個實施方案中，陽離子交換材料是強陽離子交換材料，例如優(yōu)選 Toyopearf SP 650M。在一個實施方案中，導致洗脫的鹽濃度在5mM至500mM范圍內(nèi)，優(yōu)選在5mM至400mM范圍內(nèi)，更優(yōu)選在5mM至250mM范圍內(nèi)。在本發(fā)明的另一個實施方案中， 導致洗脫的鹽同時被用作緩沖物質(zhì)，例如檸檬酸或其鹽或者磷酸或其鹽。單PEG化的紅細胞生成素可以通過本領域已知的方法與可藥用的載體或介質(zhì)一 起用在適于注射的藥物組合物中。例如，適宜的組合物已經(jīng)在WO 97/09996、W0 97/40850、 WO 98/58660和WO 99/07401中有描述。其中用于配制本發(fā)明的產(chǎn)品的優(yōu)選的可藥用的載 體有人血清白蛋白、人血漿蛋白質(zhì)等。本發(fā)明的化合物可以配制在含有張度劑例如132mM 氯化鈉的PH 7的IOmM磷酸鈉/鉀緩沖液中。藥物組合物可以任選含有防腐劑。藥物組合物 可以含有不同量的單PEG化的紅細胞生成素，例如10-1000 μ g/ml，例如50μ g或400μ g。施用本發(fā)明的紅細胞生成素糖蛋白產(chǎn)品導致人體內(nèi)紅細胞的形成。因此，施用單 PEG化的紅細胞生成素糖蛋白產(chǎn)品是對這種在紅細胞產(chǎn)生中起重要作用的紅細胞生成素蛋 白質(zhì)的增補?？梢詫⒑袉蜳EG化的紅細胞生成素糖蛋白產(chǎn)品的藥物組合物配制成對通過 各種方法施用于人類患者而言有效的強度，所述人類患者患有以低紅細胞產(chǎn)生或缺陷性紅 細胞產(chǎn)生為特征的血液障礙，其是獨立的障礙或者是病癥或疾病的一部分。藥物組合物可 以通過注射例如皮下或靜脈內(nèi)注射進行施用。單PEG化的紅細胞生成素糖蛋白產(chǎn)品的平均 量可以變化。綴合物的精確量取決于諸如所治療的病癥的確切類型、所治療患者的情況以 及組合物中的其它成分等因素。例如，可以施用0.01至10 μ g/kg體重，優(yōu)選0. 1至Iyg/ kg體重，例如每周施用一次。提供下文的實施例、序列表和附圖目的在于幫助理解本發(fā)明，本發(fā)明的實際范圍 在所附的權利要求中給出。應當理解的是，在不背離本發(fā)明的主旨的情況下能對所給出的 操作進行修改。


圖1不同PEG化的紅細胞生成素的混合物的SE-HPLC，包括峰和物質(zhì)的相關性。圖2分步洗脫方法的舉例性色譜圖。圖3連續(xù)洗脫方法的舉例性色譜圖。材料和方法SE-HPLCSE-HPLC根據(jù)蛋白質(zhì)的表觀分子量對其進行分離。因此，該方法能檢測單PEG化 的紅細胞生成素、低分子量形式和片段、多PEG化的形式和紅細胞生成素的高級聚集物 的存在。HPLC 裝配有 220-nm 檢測器和 Superose 6HR 柱(尺寸 10X 300mm，Pharmacia Biotech, Cat-Nr 17-0537-01)或 Superose 6 10/300GL 柱(Pharmacia Biotech,Cat-Nr 17-5172-01)。色譜柱于室溫在等濃度條件下操作，流速約0. 4ml/min。流動相緩沖液是pH 6. 8的含有300mM氯化鈉的50mM磷酸鈉緩沖液。根據(jù)所用的HPLC系統(tǒng)，該方法能以100 μ L 或500 μ L的進樣體積進行。將樣品用流動相緩沖液稀釋至蛋白質(zhì)濃度為約0. 5mg/mL(進 樣100 μ L)或0. lmg/mL (進樣500 μ L)。蛋白質(zhì)濃度低于0. lmg/mL的樣品能不經(jīng)稀釋使 用。將洗脫的蛋白質(zhì)在220nm檢測波長下進行檢測。實施例1紅細胞生成素的發(fā)酵和純化紅細胞生成素能例如根據(jù)WO 01/87329制備，如WO 96/135718中所報道的那樣純化。實施例2施用雙功能試劑進行紅細胞生成素的PEG化a)紅細胞生成素的活化向芐基保護的紅細胞生成素溶液(此處是向Iml 5mg/ml蛋白質(zhì)在IOmM磷酸鉀緩 沖液中的溶液，其中添加有50mM氯化鈉，pH7. 3)中加入規(guī)定量的含有被保護的硫羥基的試 劑SATA(乙?；虼宜徵牾啺孵?或SATP(乙?；虼徵牾啺孵?(溶于 DMSO, 10mg/ml)。攪拌反應混合物約30分鐘(在25°C下)，通過加入IM賴氨酸溶液至終濃 度為IOmM停止反應。通過用pH 6. 2的包含50mM氯化鈉和2mM EDTA的IOmM磷酸鉀緩沖 液進行透析除去過量的SATA和SATP。用羥胺除去保護的乙?；?。b)活化的紅細胞生成素的PEG化將380mg 甲氧基-PEG-馬來酰亞胺(MW 30. OOO ；Shearwater Polymers, Inc.， Huntsville (Alabama, USA))溶于含有95mg活化的紅細胞生成素的溶液(4. 5mg/ml，在pH 6. 2的含有50mM氯化鈉和2mM EDTA的IOmM磷酸鉀緩沖液中)。所得的溶液中的活化的紅 細胞生成素與甲氧基-PEG-馬來酰亞胺的摩爾比為1 2至1 4。通過向上述溶液中加 入IM羥胺水溶液至終濃度為30mM(pH 6. 2)，將活化的紅細胞生成素的共價連接的被保護 的硫羥基去保護。所得的在溶液反應混合物中的活化的紅細胞生成素含有游離的硫羥基 (-SH)。將硫羥基去保護后，立即將現(xiàn)在含有游離硫羥基(-SH)的活化的紅細胞生成素與甲 氧基-PEG-馬來酰亞胺進行偶聯(lián)反應90分鐘(攪拌，在25°C下)。通過向反應混合物中加 入0. 2M半胱氨酸水溶液至終濃度為2mM停止偶聯(lián)反應。30分鐘后，通過加入0. 5M N-甲基 馬來酰亞胺在DMSO中的溶液至終濃度為5mM對未與甲氧基-PEG-馬來酰亞胺反應的活化 的紅細胞生成素的過量游離硫羥基進行保護。30分鐘后，所得的現(xiàn)在含有PEG化的紅細胞 生成素的反應混合物能被純化。實施例3單PEG化的紅細胞生成素的純化a)在SP Toyopearl 650M上進行的第一個色譜步驟產(chǎn)品的第一個色譜步驟在填充有SP Toyopearl 650M的磺丙基(SP)柱上進行。該 柱在室溫下操作。第一柱的最大荷載能力被定義為1.5g蛋白質(zhì)/升柱體積(CV)。將柱用 PH 2. 9-3. 1的IOOmM磷酸鉀緩沖液(SP-A緩沖液)平衡。在上樣步驟后，洗柱，用一系列含 有增加量的NaCl的磷酸鉀緩沖液洗脫。水解的PEG試劑和多PEG化的形式在穿流液中以 及在隨后的分別用SP-A緩沖液和含有90mM氯化鈉的pH 2. 9-3. 1的IOOmM磷酸鉀緩沖液 (SP-B緩沖液)進行的洗滌步驟中被除去。使用含有250mM氯化鈉的pH 2. 9-3. 1的IOOmM磷酸鉀緩沖液(SP-C緩沖液)洗 脫單PEG化的紅細胞生成素，收集至容器中，直接用純水1 5稀釋。該收集的洗脫液稱為 "SP洗脫液集合I”。隨后用含有750mM氯化鈉的pH 2. 9-3. 1的IOOmM磷酸鉀緩沖液(SP-D緩沖液) 洗柱，以除去未反應的紅細胞生成素和將柱再生。b)在SP Toyopearl 650M上進行的第二個色譜純步驟第二柱在室溫下操作。用SP-A緩沖液平衡后，將SP洗脫液集合I加樣到柱上，隨后用SP-A緩沖液洗柱。使用被pH 2.9-3. 1的IOOmM的磷酸鉀緩沖液緩沖的斜率為 50-500mM氯化鈉的線性梯度(歷經(jīng)10倍柱體積)洗脫單PEG化的紅細胞生成素。將產(chǎn)物 峰分級收集在至多8個單獨的級分中，將每個級分直接用IM磷酸氫二鉀稀釋以使pH增加 至 6-8。單PEG化的紅細胞生成素洗脫完全后，可增加梯度的斜率，從而立即用含有500mM 氯化鈉的PH 2. 9-3. 1的IOOmM磷酸鉀洗柱。c) SP Toyopearl 650M 柱的再生將兩根柱的樹脂通過一個7步順序再生。將柱用純水沖洗，隨后用0. 5M氫氧化鈉 溶液沖洗。用純水置換堿溶液，隨后用酸(0. 5M磷酸二氫鈉，IM磷酸)洗滌。在進行另一個 純水步驟后，將柱用0. 5M氫氧化鈉除熱原> 4小時。腐蝕性再生后，將柱再次用純水洗滌。 關于柱參數(shù)的總結(jié)，參見表1和表2。表1 第一色譜柱參數(shù) n. a.不適用表2 第二色譜柱參數(shù) n. a.不適用
權利要求
純化單PEG化的紅細胞生成素的方法，其包括以下步驟提供包含單-、多-和未-PEG化的紅細胞生成素的溶液，進行兩個連續(xù)的陽離子交換色譜步驟，和回收在第二個陽離子交換色譜步驟中純化的單PEG化的紅細胞生成素，其特征在于，在兩個陽離子交換色譜步驟中使用相同類型的陽離子交換材料。
2.根據(jù)權利要求1所述的方法，其特征在于，在所述方法中，兩個連續(xù)的陽離子交換色 譜步驟是用不同的洗脫方法進行的。
3.根據(jù)權利要求2所述的方法，其特征在于，兩個連續(xù)的陽離子交換色譜步驟包括以 下步驟a)在適于所述單PEG化的紅細胞生成素與第一陽離子交換色譜柱中所含有的陽離子 交換材料結(jié)合的條件下，將包含單_、多_、未-PEG化的紅細胞生成素以及低分子量形式的 混合物的緩沖水溶液加樣在所述第一柱上，b)利用穿流緩沖液的離子強度步進增加的分步洗脫方法從第一陽離子交換色譜柱上 回收單PEG化的紅細胞生成素，其中與加樣的混合物相比，所述單PEG化的紅細胞生成素在 回收溶液中的分數(shù)增加，c)在適于所述單PEG化的紅細胞生成素與第二陽離子交換色譜柱中所含有的陽離子 交換材料結(jié)合的條件下，將步驟b)中回收的單PEG化的紅細胞生成素加樣在所述第二柱 上，其中所述第二柱中所含有的陽離子交換材料與第一柱中的陽離子交換材料是相同類型 的，d)利用穿流緩沖液的離子強度連續(xù)增加的連續(xù)洗脫方法從所述第二陽離子交換色譜 柱上回收基本同質(zhì)的形式的純化的單PEG化的紅細胞生成素。
4.根據(jù)前面任意一項權利要求所述的方法，其特征在于，所述陽離子交換材料是磺丙 基陽離子交換材料。
5.根據(jù)權利要求3所述的方法，其特征在于，所述的該方法的步驟b)中的離子強度的 步進增加是三步離子強度增加。
6.根據(jù)權利要求5所述的方法，其特征在于，步驟b)中回收的單PEG化的紅細胞生成 素在所述分步洗脫方法的第二步中被回收。
7.根據(jù)權利要求6所述的方法，其特征在于，在所述的步驟b)中，多PEG化的紅細胞生 成素在穿流緩沖液的第一次離子強度增加后被回收，單PEG化的紅細胞生成素在穿流緩沖 液的第二次離子強度增加后被回收，未PEG化的紅細胞生成素在穿流緩沖液的第三次離子 強度增加后被回收。
8.根據(jù)權利要求3至7中任意一項所述的方法，其特征在于，在步驟b)的分步洗脫方 法中，導致洗脫的鹽濃度的差異在所述分步洗脫方法的各步的每一步中為120%或120% 以上。
9.根據(jù)權利要求3至8中任意一項所述的方法，其特征在于，所述緩沖水溶液含有磷酸 或其鹽或者檸檬酸或其鹽或者組氨酸或其鹽作為緩沖物質(zhì)。
10.根據(jù)權利要求3至9中任意一項所述的方法，其特征在于，在所述的步驟d)中，通 過應用線性梯度從第二陽離子交換色譜柱上回收單PEG化的紅細胞生成素，所述線性梯度 以PH約3. 0的含有約50mM氯化鈉的濃度約IOOmM的磷酸鉀緩沖液開始，以pH約3. 0的含 有約500mM氯化鈉的濃度約IOOmM的磷酸鉀緩沖液結(jié)束，其中氯化鈉濃度歷經(jīng)十倍柱體積的變化是線性的。
11.制備單PEG化的紅細胞生成素的方法，其包括以下步驟a)將紅細胞生成素PEG化，b)使用兩個連續(xù)的陽離子交換色譜步驟純化單PEG化的紅細胞生成素，其中第一個和 第二個陽離子交換色譜步驟采用相同類型的陽離子交換材料，c)從第二陽離子交換色譜柱上回收基本同質(zhì)的形式的單PEG化的紅細胞生成素。
12.根據(jù)權利要求11所述的方法，其特征在于，在所述方法中，兩個連續(xù)的陽離子交換 色譜步驟是用不同的洗脫方法進行的。
13.根據(jù)前面任意一項權利要求所述的方法，其特征在于，第二陽離子交換材料與第一 陽離子交換材料是相同類型的陽離子交換材料，但不是同一份陽離子交換材料。
14.根據(jù)前面任意一項權利要求所述的方法，其特征在于，所述PEG殘基在線性PEG的 情況下具有20-35kDa的分子量，在分支PEG的情況下具有40kDa的分子量。
15.根據(jù)前面任意一項權利要求所述的方法，其特征在于，所述單PEG化的紅細胞生 成素以基本同質(zhì)的形式被獲得，經(jīng)尺寸排阻HPLC測定，所述基本同質(zhì)的形式含有以面積計 95%以上的單PEG化的紅細胞生成素。
16.根據(jù)前面任意一項權利要求所述的方法，其特征在于，所述單PEG化的紅細胞生成 素在第一個陽離子交換色譜步驟中被回收，經(jīng)尺寸排阻HPLC測定，純度為以面積計60%以 上。
17.根據(jù)權利要求3至16中任意一項所述的方法，其特征在于，所述緩沖水溶液含有約 IOOmM磷酸鉀緩沖物，并且pH為約3. 0。
18.根據(jù)前面任意一項權利要求所述的方法，其特征在于，在所述色譜步驟中，溶液的 PH值為約3.0。
19.根據(jù)前面任意一項權利要求所述的方法，其特征在于，導致PEG化的紅細胞生成素 從陽離子交換柱上洗脫的鹽是檸檬酸鈉或氯化鈉或氯化鉀。
20.根據(jù)前面任意一項權利要求所述的方法，其特征在于，所述紅細胞生成素具有SEQ ID NO :1或2的氨基酸序列。
全文摘要
本發(fā)明包括用于純化單PEG化的紅細胞生成素的方法，其包括兩個陽離子交換色譜步驟，其中在兩步陽離子交換色譜步驟中使用相同類型的陽離子交換材料，本發(fā)明還包括制備基本同質(zhì)的形式的單PEG化的紅細胞生成素的方法。
文檔編號C07K14/505GK101889023SQ200880024804
公開日2010年11月17日 申請日期2008年7月15日 優(yōu)先權日2007年7月17日
發(fā)明者A·施羅特, A·維斯納, H·舒里格, J·伯格, K·雷徹特 申請人:弗·哈夫曼-拉羅切有限公司