專利名稱：：Trpm8和鈣調(diào)蛋白的多肽復(fù)合物及其用途的制作方法TRPM8和4丐調(diào)蛋白的多肽復(fù)合物及其用途與相關(guān)申請的交叉參考本申請要求2005年10月31日提交的申請?zhí)?0/731,818的優(yōu)先權(quán)，其整個(gè)內(nèi)容在本文中引作參考。發(fā)明領(lǐng)域本發(fā)明涉及冷覺和疼痛的調(diào)節(jié)。更具體地，本發(fā)明涉及包含冷-薄荷醇受體(TRPM8)或TRPM8的活性片段或衍生物和鈣調(diào)蛋白或鈣調(diào)蛋白的活性片段或衍生物的多肽復(fù)合物，和該多肽復(fù)合物的用途。
背景技術(shù)：
：瞬時(shí)型感受器電勢(TRP)陽離子通道參與哺乳動物的熱感覺。這些通道位于背根神經(jīng)節(jié)(DRG)或三叉神經(jīng)節(jié)(TG)的感覺神經(jīng)元上。它們檢測并將熱刺激轉(zhuǎn)換成電信號，即動作電位。該電信號再從外周組織傳播到脊髓和腦，它們在這里整合并解釋，以觸發(fā)適宜的反射和認(rèn)知反應(yīng)(Jordt等人，Cwr(9^"iVewra&o/.2003，13(4):487-92)。已經(jīng)鑒別出由特定溫度激活并以特定模式表達(dá)的不同TRP通道。TRP通道的組合效應(yīng)，使哺乳動物能感知廣范圍的熱刺激，即令人不舒服的、有害的、熱或冷的那些。因此，這些熱受體代表著用于治療各種疼痛狀況或用于需要組織冷卻的其它狀況的非常有前途的革巴。TRPM8,即瞬時(shí)型感受器電勢通道，促黑素抑制素亞家族，8型，也稱作CMR1,即冷-薄荷醇受體，是可透過Ca"的非選擇性陽離子通道。TRPM8在由溫度的降低和冷卻化合物(例如薄荷醇、桉葉素、icilin)激活的感覺神經(jīng)元亞群中表達(dá)(McKemy等人，A^wre,2002,416:52-58)。TRPM8提供關(guān)于冷知覺的基本生物學(xué)的有趣洞察。TRPM8的調(diào)節(jié)可以與治療用途相關(guān)聯(lián)。例如，冷處理經(jīng)常用作疼痛減輕的方法。因?yàn)門RPM8受體響應(yīng)于冷以及才莫擬冷樣感覺的化合物如薄荷醇和icilin，所以預(yù)期調(diào)節(jié)TRPM8活性也適合于其中冷或薄荷醇治療用作疼痛減輕或其它減輕方法的治療應(yīng)用，例如充血性鼻炎、咳嗽或喘息性支氣管炎。調(diào)節(jié)TRPM8蛋白的功能或表達(dá)也可用于患真皮或粘膜狀況的患者，所述狀況例如皮膚炎癥和真皮灼傷(包括日光灼傷和剃刀灼傷(razorburn)),或咽喉痛。調(diào)節(jié)TRPM8活性還可適用于對冷超敏感而引起冷異常性疼痛的患者。另外，調(diào)節(jié)TRPM8活性還可適用于治療急性疼痛，例如牙痛(齒痛)和其它三叉神經(jīng)分布式疼痛，例如三叉神經(jīng)痛(ticdouleureux)和顳下頜關(guān)節(jié)痛。因?yàn)槿薚RPM8已被鑒別為與腫瘤生長相關(guān)的標(biāo)記(Tsavaler,L.,等人尺仏，2002,61:3760-3769),所以TRPM8的調(diào)節(jié)還可用于診斷各種細(xì)胞增生病癥。象許多離子通道一樣，TRPM8受鈣的調(diào)節(jié)。例如，體內(nèi)降低胞外Ca^濃度(通過輸注EDTA)或?qū)⒃撏ǖ澜敕蛛x的灌注制劑中，強(qiáng)烈增加受體的活性，而升高胞外Ca^濃度拮抗薄荷醇對峰頻率和簇狀發(fā)放模式(burstfiringpattern)的作用。另外，來自冷卻或人工i秀導(dǎo)的細(xì)胞內(nèi)Ca"濃度升高，通過移動冷-和薄荷醇-激活的電流的溫度敏感性，觸發(fā)冷適應(yīng)(Reid等人，丄尸/zjwo/.,2002,545:595-614)。細(xì)胞內(nèi)Ca"水平的瞬時(shí)升高和降低作為局部或總體Ca^火花來登記，并控制許多生理事件。但是，在胞質(zhì)中存在延長的高Ca"殺死細(xì)胞。發(fā)現(xiàn)鈣調(diào)蛋白(CaM)參與許多信號傳導(dǎo)途徑，以解碼細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度水平。在廣范圍的物種(從人屬(7/owo)到草履蟲(尸aramec/wm))中發(fā)現(xiàn)的許多離子通道使用鈣調(diào)蛋白(CaM)作為它們的組成型或可解離的Ca2+-感覺亞基(Saimi等人，Aev尸/2;^zo/.2002,64:289-311)。CaM是一種遍在表達(dá)的小的、酸性的且高度保守的可溶的鉀結(jié)合蛋白。作為具有2對EF手的單體，CaM結(jié)合Ca^，所述EF手是常見的4丐結(jié)合基序。結(jié)合Ca"后，CaM變得更展開，它的每對EF手打開，以展現(xiàn)可與靶結(jié)合并"激活它"的疏水片(Saimi等人，^7丄)。激活的粑包括參與蛋白磷酸化、環(huán)核苷酸代謝、4丐體內(nèi)穩(wěn)態(tài)等的那些粑。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)有些TRP蛋白以Ca"-依賴性的方式與鈣調(diào)蛋白相互作用(Tang等人，丄說o/.C/zew.2001,276:21303-21310)。例如，CaM-結(jié)合發(fā)生在TRP4蛋白的胞質(zhì)C-末端區(qū)域內(nèi)的2個(gè)結(jié)構(gòu)域處(Trost等人,2001,^oc/zew355(Pt3):663-70)。還已經(jīng)報(bào)道了CaM-結(jié)合位點(diǎn)在TRP3的C末端的存在(Zhang等人，7Va"y4cadS爿.2001,98(6):3168-73)。需要可以用于鑒別和測試潛在地增加或降低TRPM8的活性的化合物的系統(tǒng)。鑒別和測試這樣的化合物，使得能夠?qū)崿F(xiàn)與慢性疼痛有關(guān)的各種病癥的治療，并用于需要組織冷卻的其它狀況中。發(fā)明概述現(xiàn)在已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，哺乳動物TRPM8結(jié)合鈣調(diào)蛋白。在一個(gè)方面，本發(fā)明提供了分離的多肽復(fù)合物，其包含l)TRPM8或TRPM8的活性片段或衍生物，它與2)釣調(diào)蛋白或釣調(diào)蛋白的活性片段或衍生物相互作用。在另一個(gè)方面，本發(fā)明提供了生產(chǎn)多肽復(fù)合物的方法，其包含下述步驟a)在允許形成多肽復(fù)合物的條件下，使1)TRPM8或TRPM8的活性片段或衍生物接觸2)4丐調(diào)蛋白或4丐調(diào)蛋白的活性片段或衍生物，所述多肽復(fù)合物包含與2)的蛋白相互作用的l)的蛋白，其中1)和2)的蛋白中的至少一種是分離形式或被重組表達(dá)；和b)分離該多肽復(fù)合物。在另一個(gè)方面，本發(fā)明提供了鑒別TRPM8-鈣調(diào)蛋白多肽復(fù)合物的調(diào)節(jié)劑的方法，其包含下述步驟a)在允許形成多肽復(fù)合物的條件下，使1)TRPM8或TRPM8的活性片段或衍生物接觸2)鈣調(diào)蛋白或鈣調(diào)蛋白的活性片段或衍生物，所述多肽復(fù)合物包含與2)的蛋白相互作用的1)的蛋白；b)使實(shí)驗(yàn)化合物接觸1)和2)的蛋白中的至少一種；c)測定形成的多肽復(fù)合物的量；d)重復(fù)步驟a)和c);e)對比從步驟b)確定的形成的多肽復(fù)合物的量和從步驟d)確定的量。本發(fā)明也提供了鑒別用于治療疼痛的化合物的方法，其包含筌別TRPM8-釣調(diào)蛋白多肽復(fù)合物的調(diào)節(jié)劑的步驟。本發(fā)明還提供了減少受試者的疼痛的方法，其包含給受試者施用有效量的化合物的步驟，所述化合物是TRPM8-釣調(diào)蛋白多肽復(fù)合物的調(diào)節(jié)劑。本發(fā)明的其它方面包括與結(jié)合鈣調(diào)蛋白的TRPM8活性片段有關(guān)的分離的蛋白、分離的核酸分子、表達(dá)載體和重組細(xì)胞。圖1解釋了檢測結(jié)合到GST-CaM融合蛋白上的TRPM8片段的下拉(pull-down)測定的結(jié)果。(A)TRPM8片段的線性圖示和它們與CaM的結(jié)合(+)檢測到結(jié)合；(-)沒有檢測到結(jié)合。(B)顯示"S-曱硫氨酸-標(biāo)記的TRPM8片段的放射自顯影圖。GST:沒有發(fā)現(xiàn)TRPM8片段與8GST相互作用；CaM:發(fā)現(xiàn)有些TRPM8片段與GST-CaM融合蛋白相互作用；和輸入在測定中測試的TRPM8片段。圖2解釋了檢測結(jié)合到CaM上的更小N-末端TRPM8片段的下拉測定的結(jié)果。(A)TRPM8片段的線性圖示和它們與CaM的結(jié)合(+)檢測到結(jié)合；(-)沒有檢測到結(jié)合。(B)顯示在包含GST-CaM的測定中測試的放射性標(biāo)記的TRPM8片段的放射自顯影圖。(C)顯示放射性標(biāo)記的TRPM8片段的放射自顯影圖。GST:沒有發(fā)現(xiàn)TRPM8片段與GST相互作用；CaM:發(fā)現(xiàn)有些TRPM8片段與GST-CaM融合蛋白相互作用；(D)顯示在包含GST-TRPM8片段融合體的交互結(jié)合測定中的放射性標(biāo)記的CaM的放射自顯影圖還發(fā)現(xiàn)GST-TRPM8-11和GST-TRPM8-12與35S-曱石危氨酸標(biāo)記的CaM相互作用。詳述本文所引的全部出版物都并入本文作為參考。除非另有定義，在本人員一般理解的相同的含義。本文使用的術(shù)語"包含"、"含有"、"具有"和"包括"都以其開放的，而非限制性的意義使用。下面是有時(shí)在本說明書中使用的縮寫bp=堿基對cDNA=互補(bǔ)DNACa2+=鈣CaM=釣調(diào)蛋白CMR1=冷-和薄荷醇-每丈感的受體1;DRG=背根神經(jīng)節(jié)FRET=熒光共振能量轉(zhuǎn)移FP=熒光偏振kb=千堿基；1000堿基對PAGE=聚丙烯酰胺凝膠電泳PCR=聚合酶鏈反應(yīng)SDS=十二烷基辟u酸鈉TG=三叉神經(jīng)節(jié)TRPM8=瞬時(shí)型感受器電勢通道，促黑素抑制素亞家族，8型"結(jié)合活性"指2個(gè)或更多個(gè)分子實(shí)體彼此結(jié)合或相互作用的能力。"鈣調(diào)蛋白"或"CaM"指一種遍在表達(dá)的小的、酸性的且高度保守的可溶的釣結(jié)合蛋白。結(jié)合Ca"后，CaM也可以結(jié)合靶多肽，并從而調(diào)節(jié)粑多肽的生物活性。通過它在胞質(zhì)溶膠中或在面對胞質(zhì)溶膠的膜上的出現(xiàn)和通過對鈣的高親和力，可以鑒別出CaM。鈣調(diào)蛋白的功能包括在生長和細(xì)胞周期中以及在信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和神經(jīng)遞質(zhì)的合成和釋放中的作用。一種示例性的CaM具有SEQIDNO:1所示的氨基酸序列，具有149個(gè)氨基酸和4個(gè)鈣-結(jié)合域。示例性的CaM也包括SEQIDNO:1所示的CaM蛋白的結(jié)構(gòu)和功能多態(tài)。"多態(tài)"指在群體的個(gè)體中的特定遺傳基因座處的遺傳變體的集合。本文使用的"釣調(diào)蛋白的活性片段或衍生物"是指鈣調(diào)蛋白或非-CaM多肽的部分，其包含鉤調(diào)蛋白的維持它以類似于全長鈣調(diào)蛋白的方式結(jié)合TRPM8的能力的部分，如可以根據(jù)測量蛋白-蛋白相互作用的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)體內(nèi)或體外測定的。示例性的鈣調(diào)蛋白的活性片段或衍生物是鈣調(diào)蛋白的TRPM8相互作用域。"細(xì)胞"指適合檢測方法的靈敏度的至少一個(gè)細(xì)胞或多個(gè)細(xì)胞。適用于本發(fā)明的細(xì)胞可以是細(xì)菌細(xì)胞，但是優(yōu)選真核細(xì)胞，且最優(yōu)選哺乳動物細(xì)月包。"冷_和薄荷醇_敏感的受體"、"CMR1"、"瞬時(shí)型感受器電勢通道，促黑素抑制素亞家族，8型"或"TRPM8"各自指能夠感覺和轉(zhuǎn)導(dǎo)冷刺激的蛋白，所述冷刺激例如冷溫度或激起冷感覺的化合物，包括但不限于薄荷醇和icilin。"TRPM8"可形成易刺激離子通道，TRPM8通道，其可由低溫或激起冷感覺的化合物活化?；罨腡RPM8通道門控經(jīng)該通道的0&++離子流入量，從而引起膜去極化。TRPM8可與SEQIDNO:2所示人TRPM8蛋白(NP—076985)具有大于約80%氨基酸序列同一性。以前已經(jīng)將人TRPM8鑒別為前列腺-特異性的轉(zhuǎn)錄物，且還已經(jīng)發(fā)現(xiàn)其在各種腫瘤組織中表達(dá)，包括前列腺、黑素瘤、結(jié)腸直腸和乳腺癌(Tsavaler,L.,等人Ca"c"7^s.2002,61:3760-3769)。在一些實(shí)施方案中，TRPM8與SEQIDNO:2具有大于約85%、90%或95%的氨基酸序列同一性。示例性的TRPM8包括SEQIDNO:2所示人TRPM8蛋白的結(jié)構(gòu)和功能多態(tài)。TRPM8也包括其它動物中人TRPM8的直向同源物，所述動物包括大鼠、小鼠、豬、狗和猴，例如，大鼠TRPM8(SEQIDNO:3,GenBank蛋白ID:NP—599198,McKemy,D.D.,等人2002,同上)或小鼠TRPM8(SEQIDNO:4,GenBank蛋白ID:NP—599013,Peier，A.M.等人,2002,Ce〃108:705-715)的結(jié)構(gòu)和功能多態(tài)。本文使用的"TRPM8的活性片段或衍生物"是指TRPM8或非-TRPM8多肽的部分，其包含TRPM8的維持它以類似于全長TRPM8的方式結(jié)合CaM的能力的部分，如可以根據(jù)測量蛋白-蛋白相互作用的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)體內(nèi)或體外測定的。TRPM8的活性片段或^f汙生物可以是TRPM8的鈣調(diào)蛋白相互作用域。示例性的TRPM8的活性片段或^f汙生物可以具有SEQIDNO:5、SEQIDNO:6、SEQIDNO:7、SEQIDNO:8、SEQIDNO:9的氨基酸序列，發(fā)現(xiàn)與釣調(diào)蛋白相互作用的大鼠TRPM8的片段。"核苷酸序列，，指單鏈或雙鏈形式的聚合物中脫氧核糖核苷酸或核糖核苦酸殘基的排列。核酸序列可以由下述堿基的天然核苷酸組成胸苷、腺噪呤、胞嘧啶、鳥嘌呤和尿嘧啶；分別縮寫為T、A、C、G和U，和/或所述天然核苷酸的合成類似物。"分離的"核酸分子是這樣的，它基本上與核酸的天然來源中存在的至少一種其它核酸分子分離，或當(dāng)化學(xué)合成所述核酸分子時(shí)，它基本上不含有至少一種化學(xué)前體或其它化學(xué)藥品。"分離的"核酸分子也可以是，例如，基本上不含有在該核酸的來源生物的基因組DNA中在5'和3'末端天然側(cè)接該核酸分子的至少一個(gè)核苷酸序列的核酸分子。當(dāng)存在小于約30%、20%、10%或5%(按干重計(jì))的其它核酸分子或其它化學(xué)藥品(在本文中也稱作"污染核酸分子，，或"污染化學(xué)藥品，，)時(shí)，在核酸分子的制劑中核酸分子"基本上分離于"或"基本上不含有"其它核酸分子或其它化學(xué)藥品。分離的核酸分子包括，但不限于，獨(dú)立于其它序列的分離的核酸分子(例如，通過PCR或限制性內(nèi)切核酸酶處理產(chǎn)生的cDNA或基因組DNA片段)，以及整合入載體、自主復(fù)制質(zhì)粒、病毒(例如，反轉(zhuǎn)錄病毒、腺病毒或皰滲病毒)中，或整合入原核生物或真核生物的基因組DNA中的核酸分子。另外，分離的核酸分子可以包括作為雜交體或融合核酸分子的部分的核酸分子。分離的核酸分子可以是通過下述方式產(chǎn)生的核酸序列(i)體外擴(kuò)增，通過例如聚合酶鏈反應(yīng)(PCR);(ii)合成，通過例如化學(xué)合成；(iii)通過克隆重組生產(chǎn)；或(iv)純化，如通過切割和電泳或?qū)游龇蛛x。術(shù)語"多肽"、"蛋白"和"肽，，在本文中互換地用于指氨基酸鏈，其中氨基酸殘基通過肽鍵或修飾的肽鍵相連。氨基酸鏈可以是大于2個(gè)氨基酸的任意長度。除非另有說明，術(shù)語"多肽"、"蛋白"和"肽"也包括它們的各種修飾形式。這些修飾形式可以是天然存在的修飾形式或化學(xué)修飾形式。修飾形式的實(shí)例包括但不限于，糖基化形式、磷酸化形式、豆蔻?；问健⒆貦磅；问健⒑颂腔问?、乙酰化形式、遍在蛋白化形式等。修飾也包括分子內(nèi)交聯(lián)和與各種部分(例如脂質(zhì)、黃素、生物素、聚乙二醇或其衍生物等)的共價(jià)附著。另外，修飾也可以包括環(huán)化、分支和交聯(lián)。此外，在多肽中也可以包含由基因密碼子編碼的20個(gè)常規(guī)氨基酸以外的氨基酸。"分離的蛋白"是這樣的，它基本上與蛋白的天然來源中存在的至少一種其它蛋白分離，或當(dāng)化學(xué)合成所述蛋白時(shí)，它基本上不含有至少一種化學(xué)前體或其它化學(xué)藥品。當(dāng)存在小于約30%、20%、10%或5%(按干重計(jì))的其它蛋白或其它化學(xué)藥品(在本文中也稱作"污染蛋白"或"污染化學(xué)藥品，，)時(shí)，在蛋白的制劑中蛋白"基本上分離于"或"基本上不含有，，其它蛋白或其它化學(xué)藥品。分離的蛋白可以具有幾種不同的物理形式。分離的蛋白可以作為全長新生的或未加工的多肽，或者作為部分加工的多肽或作為加工的多肽的組合存在。全長新生多肽可通過導(dǎo)致形成全長新生多肽片段的特異性蛋白酶剪切事件進(jìn)行翻譯后修飾。片段或物理結(jié)合的片段可以具有與全長多肽相關(guān)的生物活性；但是，與個(gè)別片段相關(guān)的生物活性程度可以有變化。分離的多肽可以是非天然存在的多肽。例如，"分離的多肽，，可以是"雜種多肽"。"分離的多肽，，也可以是通過氨基酸的添加或缺失或置換從天然存在的多肽衍生的多肽。分離的多肽也可以是"純化的多肽，，，后者在本文中用于指基本上均質(zhì)的制劑中基本上不含有其它細(xì)胞組分、其它多肽、病毒材料或培養(yǎng)基的特定多肽，或當(dāng)化學(xué)合成所述多肽時(shí)，基本上不含有化學(xué)前體或與化學(xué)合成有關(guān)的副產(chǎn)物。"純化的多肽"可以通過標(biāo)準(zhǔn)的純化技術(shù)，或通過化學(xué)合成，從天然或重組宿主細(xì)胞得到，如技術(shù)人員顯而易見的。術(shù)語"雜種蛋白"、"雜種多肽"、"雜種肽"、"融合蛋白"、"融合多肽"和"融合肽"在本文中互換地指非天然存在的多肽或分離的多肽，其具有共價(jià)連接到一個(gè)或多個(gè)其它多肽分子上的特定多肽分子，所述其它多肽分子在自然界沒有連接到該特定多肽上。因而，"雜種蛋白"可以是通過共價(jià)鍵連接到一起的2個(gè)天然存在的蛋白或其片段。"雜種蛋白"也可以是通過將2個(gè)人工多肽共價(jià)連接到一起形成的蛋白。通常但是不一定，所述2個(gè)或更多個(gè)多肽分子通過肽鍵連接或"融合"到一起，從而形成單個(gè)非分支的多肽鏈。如本文所使用的，術(shù)語"相互作用"是指，2個(gè)蛋白域、片段或完整蛋白彼此表現(xiàn)出足夠的物理親和力，以便使所述2個(gè)"相互作用"蛋白域、片段或蛋白彼此物理上接近。相互作用可以來自一個(gè)或多個(gè)化學(xué)鍵的形成，其導(dǎo)致2個(gè)相互作用實(shí)體的連續(xù)且穩(wěn)定的接近。相互作用也可以僅僅基于物理親和力，這在共同定位(co-localizing)2個(gè)蛋白方面同樣有效。物理親和力和化學(xué)^:的實(shí)例包括，但不限于，由電荷差異造成的力、疏水性、氫鍵、范德瓦爾斯力、離子力、共價(jià)鍵、和它們的組合。相互作用域、片段、蛋白或?qū)嶓w之間的接近狀態(tài)可以是瞬時(shí)的或永久的，可逆的或不可逆的。在任何情況下，其與2個(gè)實(shí)體的天然隨機(jī)運(yùn)動造成的接觸形成對照且可以區(qū)分開。通常盡管不一定，通過相互作用域、片段、蛋白或?qū)嶓w之間的結(jié)合，表現(xiàn)出"相互作用"。相互作用的實(shí)例包括抗原和抗體、配體和受體、酶和底物等之間的特異性相互作用。如本文所使用的，術(shù)語"蛋白復(fù)合物"或"多肽復(fù)合物"是指一種復(fù)合單位，它是通過蛋白之間的相互作用形成的2個(gè)或更多個(gè)蛋白的組合。通常但是不一定，通過特異性非共價(jià)結(jié)合親和力將2個(gè)或更多個(gè)蛋白結(jié)合到一起，形成"蛋白復(fù)合物"。但是，共價(jià)鍵也可以存在于相互作用配偶體之間。例如，2個(gè)相互作用配偶體可以共價(jià)交聯(lián)，從而4吏得蛋白復(fù)合物變得更穩(wěn)定。術(shù)語"分離的蛋白復(fù)合物"是指在不同于在自然界其天然或原始細(xì)胞或生物環(huán)境中發(fā)現(xiàn)的那些的組合物或環(huán)境中存在的蛋白復(fù)合物。"分離的蛋白復(fù)合物"也可以是未在自然界發(fā)現(xiàn)的蛋白復(fù)合物。本文使用的術(shù)語"蛋白片段"是指代表蛋白的部分的多肽。當(dāng)?shù)鞍灼伪憩F(xiàn)出與另一個(gè)蛋白或蛋白片段的相互作用時(shí)，稱2個(gè)實(shí)體通過實(shí)體中包含的相互作用域來相互作用。相互作用域可以是由在蛋白的一級序列中彼此接近的氨基酸殘基形成的緊湊結(jié)構(gòu)?；蛘?，相互作用域可以包含來自在一級序列中彼此不接近、但是通過多肽鏈的三級折疊聚到一起的多肽鏈部分的氨基酸殘基。如本文所使用的，術(shù)語"域"是指蛋白或多肽的功能部分、區(qū)段或區(qū)域。"相互作用域"特指蛋白、多肽或蛋白片段的部分、區(qū)段或區(qū)域，其負(fù)責(zé)該蛋白、蛋白片段或分離的域?qū)α硪环N蛋白、蛋白片段或分離的域的物理親和力。"重組體"指已使用分子生物學(xué)技術(shù)修飾得與其天然狀態(tài)有些不同的核酸、由核酸編碼的蛋白、細(xì)胞或病毒顆粒。例如，重組細(xì)胞可以含有在天然(非重組)形式的細(xì)胞中未發(fā)現(xiàn)的核苷酸序列，或者可以表達(dá)在不同情況下異常表達(dá)、表達(dá)不足或根本不表達(dá)的天然基因。重組細(xì)胞還可以含有發(fā)現(xiàn)于天然形式細(xì)胞中的基因，其中所述基因通過人工方法修飾并再導(dǎo)入細(xì)胞中。該術(shù)語還包括含內(nèi)源核酸的細(xì)胞，所述內(nèi)源核酸已被修飾，但沒有從細(xì)胞中去除核酸；這種修飾包括例如通過基因置換和位點(diǎn)特異性突變獲得的修飾。"重組宿主細(xì)胞"是其中已導(dǎo)入重組DNA序列的細(xì)胞?？墒褂萌魏魏线m的方法將重組DNA序列導(dǎo)入到宿主細(xì)胞中，包括例如電穿孔、磷酸4丐沉淀、顯微注射、轉(zhuǎn)化、生物射彈和病毒感染。重組DNA可整合或不整合(共價(jià)連接)入構(gòu)成細(xì)胞基因組的染色體DNA中。例如，重組DNA可保持在游離型元件如質(zhì)粒上?；蛘?，就穩(wěn)定轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染的細(xì)胞而言，重組DNA已整合入染色體中，以便其通過染色體復(fù)制由子細(xì)胞遺傳。這種穩(wěn)定性由穩(wěn)定轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染的細(xì)胞確立包括含外源DNA的子細(xì)胞群體的細(xì)胞系或克隆的能力來證實(shí)。重組宿主細(xì)胞可為原核細(xì)胞或真核細(xì)胞，包括細(xì)菌如大腸桿菌(五.co/O，真菌細(xì)胞如酵母，哺乳動物細(xì)胞如人、牛、豬、猴或嚙齒類動物起源的細(xì)胞系，以及昆蟲細(xì)胞，如果蠅(Z>ayo//n7")和蠶來源的細(xì)胞系。還要理解的是，術(shù)語"重組宿主細(xì)胞"不僅指具體的所指細(xì)胞，而且指此細(xì)胞的子代或潛在子代。因?yàn)槟承┬揎椏捎捎谕蛔兓颦h(huán)境影響而在隨后世代中發(fā)生，所以這種子代實(shí)際上可能與親代細(xì)胞不相同，但仍包括在本文使用的術(shù)語范圍內(nèi)。"報(bào)道基因"指編碼報(bào)道基因產(chǎn)物的核酸序列。如本領(lǐng)域已知的，報(bào)道基因產(chǎn)物通常通過標(biāo)準(zhǔn)方法可以容易地檢測到。示例性的合適的報(bào)道基因包括、但不限于，編碼下述的基因螢光素酶(lux)、p-半乳糖苷酶(lacZ)、綠色熒光蛋白(GFP)、氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶(CAT)、p-葡糖醛酸糖苦酶、新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶和鳥噪呤黃噤呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶蛋白。"載體"指其中可以或已經(jīng)插入異源核酸的核酸分子。有些載體可以導(dǎo)入宿主細(xì)胞中，從而允許復(fù)制載體或表達(dá)由該載體或構(gòu)建體編碼的蛋白。載體通常具有選擇標(biāo)記，例如，編碼允許抗藥性的蛋白的基因，復(fù)制起點(diǎn)序列，和允許插入異源序列的多克隆位點(diǎn)。載體通常是基于質(zhì)粒的，并用小寫字母"p"和后面的字母和/或數(shù)字組合來命名。本文y^開的起始質(zhì)粒在商業(yè)上得到，在無限制的基礎(chǔ)上公開得到，或可以使用本領(lǐng)域已知的程序從可得到的質(zhì)粒來構(gòu)建?？梢愿鶕?jù)本發(fā)明使用的許多質(zhì)粒和其它克隆和表達(dá)載體是眾所周知的，且本領(lǐng)域技術(shù)人員可容易地得到。此外，技術(shù)人員可以容易地構(gòu)建任意數(shù)目的適用于本發(fā)明的其它質(zhì)粒。技術(shù)人員從本公開內(nèi)容中，將容易地明白本發(fā)明中這些質(zhì)粒以及其它載體的性質(zhì)、構(gòu)建和使用。"序列"是指聚合物中單體出現(xiàn)的線性次序，例如，多肽中氨基酸的次序或多核苦酸中核苷酸的次序。在實(shí)踐本發(fā)明時(shí)，使用分子生物學(xué)、微生物學(xué)和重組DNA中的許多常規(guī)技術(shù)。這些技術(shù)是眾所周知的，且解釋于例如，CurrentProtocolsinMolecularBiology,Vols.I,II,和III,F.M.Ausubel,編(1997);和Sambrook等人，MolecularCloning:ALaboratoryManual,ColdSpringHarborLaboratoryPress,ColdSpringHarbor,NY(2001)。在一個(gè)方面，本發(fā)明提供了分離的多肽復(fù)合物，其包含l)TRPM8或TRPM8的活性片段或衍生物，它與2)鉤調(diào)蛋白或釣調(diào)蛋白的活性片段或衍生物相互作用。因此，在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了在全長TRPM8和鈣調(diào)蛋白蛋白之間形成的分離的蛋白復(fù)合物，它代表在體內(nèi)發(fā)現(xiàn)的天然存在的復(fù)合物。在蛋白-蛋白相互作用領(lǐng)域普遍接受的是，全長蛋白片段之間的相互作用通常指示著在含有這種片段的對應(yīng)全長蛋白之間形成的相互作用。因而，考慮到本文提供的公開內(nèi)容，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員會預(yù)見到以類似于全長蛋白的方式相互作用的TRPM8和CaM蛋白的活性片段或衍生物。因而，在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了許多其它蛋白復(fù)合物，其包含以類似于全長蛋白的方式相互作用的TRPM8和CaM蛋白的活性片段或衍生物。本發(fā)明的蛋白復(fù)合物包含多肽，所述多肽包括形成蛋白復(fù)合物所需的必要相互作用域。實(shí)驗(yàn)，任選地由多序列比對分析指導(dǎo)以鑒別保守氨基酸殘基和鄰接氨基酸殘基段的實(shí)驗(yàn)，可以用于定義CaM或TRPM8蛋白的最小相互作用片段?？梢詼y試TRPM8的越來越短的片段的與CaM相互作用的能力。這樣的實(shí)驗(yàn)經(jīng)常包含CaM和TRPM8蛋白中的一種或兩種的系統(tǒng)地且漸進(jìn)地更短的部分。測定這樣的截短的片段是否仍然相互作用的隨后測試，將預(yù)測地導(dǎo)致闡述仍然能與相互作用配偶體相互作用的最小相互作用片段。例如，檢測CaM和人TRPM8的大N-末端片段(SEQIDNO:5)之間的結(jié)合后，測試更小的人TRPM8片段的結(jié)合CaM的能力。發(fā)現(xiàn)在大N-末端片段內(nèi)，由53個(gè)氨基酸殘基組成的小人TRPM8片段(SEQIDNO:9)仍然能結(jié)合CaM。序列對比表明，該片段在動物中是高度保守的。來自人、狗、大鼠和小鼠的TRPM8序列在包含和圍繞該53氨基酸段的區(qū)域中是100%相同的。因而，本發(fā)明的一個(gè)示例性的蛋白復(fù)合物包含含有SEQIDNO:9定義的氨基酸殘基的TRPM8蛋白片l殳。本發(fā)明的其它示例性的蛋白復(fù)合物包含具有在SEQIDNO:9的任一個(gè)或2個(gè)末端的其它氨基酸殘基的TRPM8活性片段或衍生物。分子生物學(xué)和蛋白-蛋白相互作用領(lǐng)域的技術(shù)人員使用常規(guī)實(shí)驗(yàn)，可以在CaM、TRPM8或其活性片段或衍生物中導(dǎo)入氨基酸序列變異。任選地在多序列比對分析以鑒別可變的氨基酸殘基指導(dǎo)下，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以使用定點(diǎn)誘變來將特定變化導(dǎo)入相互作用配偶體多肽的氨基酸序列中，且從而生成CaM或TRPM8或其任何相互作用片^史的"合成同白中變化的特定氨基酸殘基的密碼子中。類似地，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以將變化導(dǎo)入編碼導(dǎo)致那些氨基酸殘基的保守置換的特定氨基酸殘基的密碼子中。例如，使用這樣的方法，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以導(dǎo)入位點(diǎn)特異性的突變，其將"CTT"密碼子變成"ATT"密碼子，^v而造成天然多肽中的亮氨酸殘基被替換為合成同源物中的異亮氨酸殘基。在一次近似，沒有預(yù)見到表達(dá)的多肽中的這種保守置換廢除合成同源物與它的配偶體蛋白相互作用的能力，且它可以實(shí)際上增加相互作用的親和力(參見Graversen等人，丄Ao/.C/2em.275:37390-37396(2000))。在本發(fā)明的蛋白復(fù)合物的具體的實(shí)施方案中，CaM和TRPM8蛋白或其活性片段或衍生物可以直接融合到一起，或通過肽接頭共價(jià)連接到一起，從而形成具有單個(gè)不分支多肽鏈的雜種蛋白。因而，蛋白復(fù)合物可以通過雜種蛋白的2個(gè)部分之間的"分子內(nèi)"相互作用來形成。另外，在該蛋白復(fù)合物中的融合的或連接的相互作用配偶體中的一個(gè)或2個(gè)可以是天然蛋白或天然蛋白的同源物、衍生物或片段。本發(fā)明的蛋白復(fù)合物也可以是修飾形式。例如，與蛋白復(fù)合物選擇性地免疫反應(yīng)的抗體可以結(jié)合到蛋白復(fù)合物上。在另一個(gè)實(shí)例中，可以包括能增強(qiáng)蛋白復(fù)合物中的相互作用配偶體之間的相互作用的非-抗體調(diào)節(jié)劑?；蛘?，為了穩(wěn)定化的目的，可以交聯(lián)蛋白復(fù)合物中的蛋白成員。可以使用各種交聯(lián)方法。例如，可以使用R-S--S-R'形式的雙功能試劑，其中R和R'基團(tuán)可以與蛋白復(fù)合物中的某些氨基酸側(cè)鏈反應(yīng)，從而形成共價(jià)鍵。參見例如，Traut等人，inCreightoned，尸ro/^/"Fw"Co".'J/Vac"ca/J/Tproac/z,IRLPress,Oxford,1989;Baird等人，Bz'o/.CTzew.，251:6953-6962(1976)。其它有用的交聯(lián)劑包括，例如，Denny-Jaffee試劑，可以通過偶氮鍵切割的異雙功能光活化部分(參見Denny等人，尸mc.胸/.Jed園,81:5286-5290(1984)),和1251-{3-[1^畫(3-碘陽4-疊氮水楊基)半胱胺基]-2-硫代吡啶}，半胱氨酸-特異性的光交聯(lián)試劑(參見Chen等人，&,e"ce,265:90-92(1994》。在有些實(shí)施方案中，本發(fā)明的分離的蛋白復(fù)合物包含與分離的膜制劑結(jié)合的TRPM8。所述膜制劑可以分離自天然宿主細(xì)胞，例如，DRG或TG細(xì)胞，它在它的細(xì)胞表面上表達(dá)TRPM8。所述膜制劑還可以分離自重組宿主細(xì)胞，例如，CHO或COS細(xì)胞，它在它的細(xì)胞表面上重組表達(dá)TRPM8。膜制劑還可以從生物膜制備，例如包含TRPM8通道的組織膜、質(zhì)膜、細(xì)胞膜、或內(nèi)部細(xì)胞器膜。分離和制備生物膜制劑的方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的。例如，這樣的方法可以包括下述步驟機(jī)械或酶法破壞組織或細(xì)胞，離心以分離膜和其它組分，且將膜片段或小泡重新懸浮于合適的緩沖溶液中?；蛘?，含有膜的制劑也可以源自人工膜。純化的TRPM8蛋白可以重構(gòu)進(jìn)脂雙層中，以形成人工膜小泡(參見Chen等人，1996,尸/z，zo/.108:237-250)。這類膜小泡可以是對目標(biāo)通道非常特異性的，從而避免了污染其它通道的問題。本領(lǐng)域技術(shù)人員已知制備人工膜小泡的方法。在另一個(gè)一般方面，本發(fā)明提供了制備本發(fā)明的蛋白復(fù)合物的方法。本發(fā)明的蛋白復(fù)合物可以通過多種方法來制備。具體而言，蛋白復(fù)合物可以直接分離自含有該蛋白復(fù)合物的動物組織樣品，例如人組織樣品。蛋白復(fù)合物也可以分離自重組表達(dá)蛋白復(fù)合物成員的宿主細(xì)胞?；蛘?，通過組合蛋白復(fù)合物的個(gè)別成員，可以體外構(gòu)建蛋白復(fù)合物。在一個(gè)實(shí)施方案中，通過共免疫沉淀，使用與相互作用蛋白配偶體免疫反應(yīng)的抗體，或優(yōu)選將在下面詳細(xì)討論的與蛋白復(fù)合物選擇性免疫反應(yīng)的抗體，可以從組織樣品或重組宿主細(xì)胞制備本發(fā)明的蛋白復(fù)合物。所述抗體可以是單克隆的或多克隆的。共免疫沉淀是本領(lǐng)域常用的分離或檢測結(jié)合的蛋白的方法。在該程序中，通常將血清樣品或組織或細(xì)胞裂解物與合適的抗體相混合。沉淀并洗滌結(jié)合抗體的蛋白復(fù)合物。然后洗脫結(jié)合的蛋白復(fù)合物。或者，也可以使用免疫親和層析和免疫印跡技術(shù)，使用與相互作用蛋白配偶體免疫反應(yīng)的抗體，或優(yōu)選與蛋白復(fù)合物選擇性免疫反應(yīng)的抗體，從天然組織樣品或重組宿主細(xì)胞分離蛋白復(fù)合物。例如，在蛋白免疫親和層析中，所述抗體共價(jià)或非共價(jià)地偶聯(lián)到基質(zhì)(例如，瓊脂糖)上，后者然后包裝進(jìn)柱中。使來自組織樣品的提取物、或來自重組細(xì)胞的裂解物穿過柱，在這里它接觸附著到基質(zhì)上的抗體。然后用低鹽溶液洗脫柱，以洗掉未結(jié)合的或松散(非特異性地)結(jié)合的組分。然后使用高鹽溶液、抗體的竟?fàn)幙乖?、離液溶劑、或十二烷基疏酸鈉(SDS)等，從柱洗脫保持在柱中的蛋白復(fù)合物。在免疫印跡中，通過聚丙烯酰胺凝膠電泳(PAGE),分級分離來自組織樣品提取物或重組宿主細(xì)胞裂解物的4且蛋白樣品，然后轉(zhuǎn)移至膜，例如，硝酸纖維素。然后將蛋白復(fù)合物的組分置于膜上，并通過多種技術(shù)進(jìn)行鑒別，例如用特異性抗體來探測。在另一個(gè)實(shí)施方案中，通過蛋白親和層析或親和印跡，可以/人組織樣品或重組宿主細(xì)胞或其它合適來源制備本發(fā)明的蛋白復(fù)合物。也就是說，通過結(jié)合親和力，將相互作用蛋白配偶體之一用于分離另一種相互作用蛋白配偶體從而形成蛋白復(fù)合物。因而，通過從組織樣品純化或通過重組表達(dá)或化學(xué)合成制備的相互作用蛋白配偶體可以共價(jià)或非共價(jià)地結(jié)合到基質(zhì)例如瓊脂糖上，后者然后包裝進(jìn)層析柱中。然后使組織樣品提取物、或來自重組細(xì)胞的細(xì)胞裂解物接觸基質(zhì)上結(jié)合的蛋白。然后用低鹽溶液洗掉未結(jié)合的或松散結(jié)合的組分，且然后使用高鹽溶液洗脫柱中結(jié)合的蛋白復(fù)合物。在親和印跡中，通過聚丙烯酰胺凝膠電泳(PAGE),分級分離來自組織樣品或重組宿主細(xì)胞裂解物的粗蛋白樣品，然后轉(zhuǎn)移至膜，例如，硝酸纖維素。然后使純化的相互作用蛋白成員結(jié)合它在膜上的相互作用蛋白配偶體，從而形成蛋白復(fù)合物，然后從膜分離。在另一個(gè)實(shí)施方案中，使用與上述類似的方法，可以獨(dú)立地^J且織樣品或重組宿主細(xì)胞分離或純化個(gè)別相互作用蛋白配偶體。也可以使用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的體外多肽合成方法，合成個(gè)別相互作用蛋白配偶體。然后在有助于它們的相互作用的條件下，組合個(gè)別相互作用蛋白配偶體，從而形成本發(fā)明的蛋白復(fù)合物。應(yīng)當(dāng)指出，不同的蛋白-蛋白相互作用可能需要不同的條件。幾種不同的參數(shù)可以變化，包括溫度、pH、鹽濃度、還原劑等?？赡苄枰恍┐我潭鹊膶?shí)驗(yàn)來確定最佳溫育條件，這在獲知本發(fā)明公開內(nèi)容的本領(lǐng)域技術(shù)人員能力范圍內(nèi)。技術(shù)人員將明白，為了表達(dá)蛋白復(fù)合物或個(gè)別相互作用蛋白的目的，在本發(fā)明中可以使用任何重組表達(dá)方法。通常，可以將編碼CaM和TRPM8中的一種或兩種的核酸導(dǎo)入合適的宿主細(xì)胞中。在本發(fā)明中可以使用的示例性核酸分子包括編碼全長CaM的cDNA,例如SEQIDNO:10,和編碼來自人(SEQID:11)、小鼠(SEQIDNO:12)或大鼠(SEQIDNO:13)的全長TRPM8的cDNA。在本發(fā)明中可以使用的其它核酸分子包括編碼CaM或TRPM8的活性片段或衍生物的cDNA,例如編碼具有SEQIDNO:5、SEQIDNO:6、SEQIDNO:7、SEQIDNO:8或SEQIDNO:9的序列的有活性的大鼠TRPM8片段的cDNA。通常，將核酸、優(yōu)選地以DNA形式整合入載體中，以形成能在導(dǎo)入宿主細(xì)胞后指導(dǎo)相互作用蛋白成員的生產(chǎn)的表達(dá)載體。許多類型的載體可以用于本發(fā)明。獲知本公開內(nèi)容的技術(shù)人員應(yīng)明白構(gòu)建用于本發(fā)明目的的表達(dá)載體的方法。(通常參見,Cw酒f尸rafoco/sz力油/ecw/arS/o/ogy，Ko/.2,Ed.Ausubel,等人，GreenePublish.Assoc.&WileyInterscience,Ch.13,1988;Glover,C7歸"g,Vol.II,IRLPress,Wash.,D.C.,Ch.3,1986;Bitter,等人，&153:516-544(1987);7TzeM)/ecw/arSz'o/ogy*7ms^Sacc/zoTw^c^,Eds.Strathern等人，ColdSpringHarborPress,Vols.I和II,1982;和Sambrook等人，M/ecw/orC7om力g.'JLa6ora組yMawwa/,ColdSpringHarborPress,1989.)通常，表達(dá)載體包括具有啟動子的表達(dá)盒，所述啟動子可操作地連接到編碼相互作用蛋白成員的DNA上。所述啟動子可以是天然啟動子，即在天然存在的細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)的負(fù)責(zé)在該細(xì)胞中表達(dá)相互作用蛋白成員的啟動子?；蛘?，所述表達(dá)盒可以是嵌合表達(dá)盒，即，具有不是在天然存在的細(xì)胞中負(fù)責(zé)表達(dá)相互作用蛋白成員的天然啟動子的異源啟動子。表達(dá)載體還可以包括用于在宿主細(xì)胞中復(fù)制載體的DNA復(fù)制起點(diǎn)。優(yōu)選地，表達(dá)載體也包括用于在例如大腸桿菌中擴(kuò)增載體的復(fù)制起點(diǎn)，和用于僅選擇和維持?jǐn)y帶表達(dá)載體的那些宿主細(xì)胞的選擇標(biāo)記。另外，表達(dá)盒優(yōu)選地也含有誘導(dǎo)型元件，其功能是控制從編碼相互作用蛋白成員的DNA的轉(zhuǎn)錄。其它調(diào)節(jié)序列例如轉(zhuǎn)錄增強(qiáng)子序列和翻譯調(diào)節(jié)序列(例如，SD序列)也可以可操作地包含在表達(dá)盒中。終止序列例如來自牛生長激素、SV40、lacZ和AcMNPV多角體蛋白基因的多腺苷酸化信號也可以可操作地連接到表達(dá)盒中編碼相互作用蛋白成員的DNA上。用于檢測和/或純化表達(dá)的蛋白的附加表位編碼序列也可以可操作地連接到編碼相互作用蛋白成員的DNA上，從而表達(dá)融合蛋白。有用附加表位的實(shí)例包括，但不限于，流感病毒血凝素(HA)、猿猴病毒5(V5)、多組氨酸(6xHis)、c-myc、lacZ、GST等。用Ni親和柱，可以容易地沖全測和/或純化具有多組氨酸標(biāo)記的蛋白，而可與許多附加表位免疫反應(yīng)的特異性抗體通常是可商業(yè)得到的。表達(dá)載體也可以含有將表達(dá)的蛋白引向細(xì)胞外或特定細(xì)胞內(nèi)區(qū)室的組分。信號肽、核定位序列、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)停留信號、線粒體定位序列、豆蔻酰化信號、棕櫚?；盘柡涂缒ば蛄?，是可以確定表達(dá)的蛋白的目的地的任選載體組分的實(shí)例。當(dāng)需要在單個(gè)宿主細(xì)胞中表達(dá)2個(gè)或更多個(gè)相互作用蛋白成員時(shí)，編碼相互作用蛋白成員的DNA片段可以整合入單個(gè)載體或不同載體中。通過本領(lǐng)域已知的任意技術(shù)，例如，通過直接DNA轉(zhuǎn)化、顯微注射、電穿孔、病毒感染、脂轉(zhuǎn)染、基因槍等，可以將這樣構(gòu)建的表達(dá)載體導(dǎo)入宿主細(xì)胞中。相互作用蛋白成員的表達(dá)可以是瞬時(shí)的或穩(wěn)定的。表達(dá)載體可以以染色體外狀態(tài)維持在宿主細(xì)胞中，即，作為自我復(fù)制的質(zhì)?；虿《尽；蛘?，通過常規(guī)技術(shù)例如穩(wěn)定細(xì)胞系的選擇或位點(diǎn)特異性的重組，可以將表達(dá)載體整合入宿主細(xì)胞的染色體中。在穩(wěn)定的細(xì)胞系中，至少表達(dá)載體的表達(dá)盒部分被整合入宿主細(xì)胞的染色體中?？梢詫⑤d體構(gòu)建體設(shè)計(jì)成適合在各種宿主細(xì)胞中表達(dá)，包括但不限于細(xì)菌、酵母細(xì)胞、植物細(xì)胞、昆蟲細(xì)胞和哺乳動物和人細(xì)胞。制備用于在不同宿主細(xì)胞中表達(dá)的表達(dá)載體的方法應(yīng)是技術(shù)人員顯而易見的。使用上述的重組方法，也可以容易地表達(dá)天然相互作用蛋白成員的同源物和片段。例如，為了表達(dá)蛋白片段，可以選擇整合入表達(dá)載體中的DNA片段，從而使它僅僅編碼該蛋白片段。同樣，使用編碼雜種蛋白的重組DNA,可以表達(dá)特定的雜種蛋白。類似地，同源物蛋白可以乂人編碼該同源物蛋白的DNA序列表達(dá)。通過使用重組DNA技術(shù)操作編碼天然蛋白的序列，可以得到編碼同源物的DNA序列。為此，可以4吏用本領(lǐng)域普遍已知的技術(shù)，進(jìn)行隨機(jī)的或定點(diǎn)誘變。為了制備蛋白衍生物，例如，可以通過定點(diǎn)DNAi秀變，以預(yù)定的方式改變天然相互作用蛋白成員的氨基酸序列，以生成或去除共有序列，用于例如，蛋白激酶的磷酸化、糖基化、核糖基化、豆蔻酰化、棕櫚酰化、遍在蛋白化等?；蛘?，在重組宿主細(xì)胞中合成蛋白的過程中，可以將非天然氨基酸摻入相互作用蛋白成員中。例如，在使用修飾的賴氨酰-tRNA的翻譯過程中，可以將光反應(yīng)性賴氨酸衍生物摻入相互作用蛋白成員(參見，例如，Wiedmann等人，脂臟，328:830-833(1989);Musch等人，Ce〃，69:343-352(1992)。也可以以類似方式摻入其它光反應(yīng)性的氨基酸衍生物。參見，例如，High等人，>/說o/.C/2em.,368:28745-28751(1993))。實(shí)際上，這樣摻入相互作用蛋白成員中的光反應(yīng)性氨基酸衍生物的功能可以是，使該蛋白在預(yù)定條件下與蛋白復(fù)合物中它的相互作用蛋白配偶體交聯(lián)。另外，通過使某些部分化學(xué)連接到天然蛋白的氨基酸側(cè)鏈上，也可以制備本發(fā)明的天然相互作用蛋白成員的衍生物。如果需要，可以測試這樣產(chǎn)生的同源物和衍生物，以確定它們是否能與它們預(yù)期的配偶體相互作用，以形成蛋白復(fù)合物。測試可以通過例如酵母雙-雜交系統(tǒng)或本領(lǐng)域已知的沖全測蛋白-蛋白相互作用的其它方法來進(jìn)行。從嵌合核酸例如編碼融合蛋白的DNA或mRNA片#殳，可以重組表達(dá)具有通過肽鍵或肽接頭共價(jià)連接到一起的本發(fā)明的蛋白復(fù)合物的任意相互作用對、或其同源物、衍生物或片段的上述雜種蛋白。因此，本發(fā)明也提供了編碼本發(fā)明的雜種蛋白的核酸。另外，也提供了其中已經(jīng)整合入編碼本發(fā)明的雜種蛋白的核酸的表達(dá)載體。制備這樣的嵌合核酸和含有它們的表達(dá)載體的方法，將是獲知本發(fā)明公開內(nèi)容的技術(shù)人員顯而易見的。通過本領(lǐng)域技術(shù)人員眾所周知的常規(guī)生化和免疫化學(xué)方法，可以純化表達(dá)的蛋白。轉(zhuǎn)染的真核細(xì)胞或生物組織樣品可以勻漿，并在將分離不同細(xì)胞組分的適宜條件下分級分離。通常，將細(xì)胞裂解物在蔗糖梯度上運(yùn)行，或?qū)⒒诖笮『兔芏确蛛x細(xì)胞組分的其它材料。使用本領(lǐng)域技術(shù)人員眾所周知的方法，例如免疫印跡或免疫沉淀方法，用適宜的抗體分析亞細(xì)胞級分中目標(biāo)蛋白的存在。然后將純化的蛋白用于親和層析研究將它固定化到基質(zhì)上，并裝載在柱上。然后將來自培養(yǎng)的細(xì)胞或勻漿的組織樣品的提取物在適宜的緩沖液中裝載到柱上，并洗脫非結(jié)合蛋白。廣泛洗滌后，使用各種方法，例如pH梯度或鹽濃度梯度，洗脫結(jié)合蛋白或蛋白復(fù)合物。然后可以通過二維凝膠電泳，分離洗脫的蛋白，從凝膠洗脫，通過微量測序進(jìn)行鑒別。所有這些方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員眾所周知的。純化的單獨(dú)目標(biāo)蛋白或復(fù)合物，也可以用于在兔子、小鼠、大鼠、雞、山羊、綿羊、豬、豚鼠、牛和馬中制備抗體。用于抗體生成和表征的方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員眾所周知的。單克隆抗體也可以通過常規(guī)技術(shù)來制備。通過常規(guī)技術(shù)進(jìn)一步生產(chǎn)單鏈抗體1G。本發(fā)明的另一個(gè)方面涉及在患者樣品中或在下文所述的化合物篩選測定中測量或檢測本發(fā)明的蛋白復(fù)合物的方法。在一個(gè)實(shí)施方案中，在患者的細(xì)胞、組織或器官中，測定本發(fā)明的蛋白復(fù)合物的濃度。例如，可以從由患者的細(xì)胞、組織或器官得到的患者樣品，分離或純化蛋白復(fù)合物，并測定其量。如上所述，通過共免疫沉淀，使用與相互作用蛋白成員免疫反應(yīng)的抗體、與蛋白復(fù)合物的2種或更多種相互作用蛋白成員免疫反應(yīng)的雙功能抗體、或優(yōu)選與蛋白復(fù)合物選擇性免疫反應(yīng)的抗體，可以從細(xì)胞、組織或器官樣品制備蛋白復(fù)合物。當(dāng)使用僅與游離相互作用蛋白成員免疫反應(yīng)的雙功能抗體或抗體時(shí)，未與其它蛋白復(fù)合的個(gè)別相互作用蛋白成員也可以與含有這樣的個(gè)別蛋白的蛋白復(fù)合物一起分離。但是，它們可以使用本領(lǐng)域已知的方法，例如基于大小的分離方法如凝膠過濾，或通過使用對另一種個(gè)別相互作用蛋白成員特異性的抗體從混合物扣除蛋白復(fù)合物，從蛋白復(fù)合物容易地分離。另外，可以在凝膠如聚丙烯酰胺凝膠中分離樣品中的蛋白，且隨后使用與蛋白復(fù)合物免疫反應(yīng)的抗體進(jìn)行免疫印跡?；蛘?，可以不經(jīng)分開、分離或純化，在樣品中測定蛋白復(fù)合物的濃度。為此，優(yōu)選地在免疫測定中使用與特定蛋白復(fù)合物選擇性免疫反應(yīng)的抗體。例如，可以使用免疫細(xì)胞化學(xué)方法。也可以^使用其它眾所周知的基于抗體的技術(shù)，包括，例如，酶聯(lián)免疫吸附測定(ELISA)、放射免疫測定(RIA)、免疫放射測定(IRMA)、熒光免疫測定、A蛋白免疫測定和免疫酶測定(EMA)。參見例如，美國專利號4,376,110和4,486,530,二者都在本文中引作參考。另外，可以在患者樣品中測定特定蛋白復(fù)合物的個(gè)別相互作用蛋白成員的濃度，然后可以將其用作樣品中蛋白復(fù)合物濃度的合理精確的指示物。為此，可以在上述方法中的任一種中，使用抗特定復(fù)合物的個(gè)別相互作用蛋白成員的抗體。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，在患者樣品中測定蛋白復(fù)合物的每個(gè)相互作用蛋白成員的濃度，然后推導(dǎo)出蛋白復(fù)合物的相對濃度。另外，通過測定編碼蛋白復(fù)合物的相互作用蛋白成員的mRNA的濃度，也可以測定患者中相對蛋白復(fù)合物濃度。優(yōu)選地，測定患者樣品中每個(gè)相互作用蛋白成員的mRNA濃度。為此，可以使用本領(lǐng)域普遍已知的測定mRNA濃度的所有方法。這些方法的實(shí)例包4舌，例如，RNA印跡測定、斑點(diǎn)印跡測定、PCR測定(優(yōu)選定量PCR測定)、原位雜交測定等。本發(fā)明的CaM和TRPM8蛋白復(fù)合物的發(fā)現(xiàn)，暗示著CaM-TRPM8蛋白復(fù)合物可以參與生物學(xué)過程和疾病途徑。因而，蛋白復(fù)合物或復(fù)合物的個(gè)別蛋白的畸變和畸變程度可以是疾病或病癥的指示物。這些畸變可以用作分類和/或分期一種疾病或病癥的參數(shù)。另外，這些畸變也可以是患者對藥物治療的響應(yīng)的指示物。通過對比分析正常群體和異常的或受影響的群體中的蛋白復(fù)合物和/或其相互作用成員，可以容易地確定生理狀態(tài)(例如，生理病癥、病癥的誘因、疾病狀態(tài)、對藥物治療的響應(yīng)或其它生理學(xué)現(xiàn)象或表型)和本而，例如，人們可以研究CaM-CRMl蛋白復(fù)合物的濃度、定位和分布，蛋白復(fù)合物的相互作用蛋白成員中的突變，和/或正常群體和受特定生理病癥影響的群體中相互作用蛋白成員之間的結(jié)合親和力。通過統(tǒng)計(jì)學(xué)方法，可以對比和分析研究結(jié)果。2個(gè)群體中任意可檢測的統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性差異將指示關(guān)聯(lián)。例如，如果受影響群體中的蛋白復(fù)合物的濃度統(tǒng)計(jì)學(xué)上顯著高于正常群體，則可以合理地得出結(jié)論，即更高的蛋白復(fù)合物濃度與該生理學(xué)病癥相關(guān)。一旦確立本發(fā)明的蛋白復(fù)合物或其相互作用蛋白成員中的特定類以通過測定患者是否具有特定畸變，診斷或^r測特定生理病癥或疾病或生理病癥或疾病的"i秀因。因此，本發(fā)明也提供了診斷患者中疾病或生理病癥或疾病或病癥的誘因的方法，其通過測定患者中是否存在關(guān)于根據(jù)本發(fā)明的CaM-TRPM8蛋白復(fù)合物的任何畸變。在正常個(gè)體中分析相同的蛋白復(fù)合物，并與在患者中得到的結(jié)果相對比。以此方式，可以檢測患者中的任何蛋白復(fù)合物畸變。如本文所使用的，當(dāng)用于本發(fā)明的蛋白復(fù)合物的上下文中時(shí)，術(shù)語"畸變，，是指蛋白復(fù)合物的任何變化，包括特定細(xì)胞或組織或器官或總身體中蛋白復(fù)合物濃度的增加或降低，蛋白復(fù)合物在細(xì)胞區(qū)室或在組織或器官中定位的改變，蛋白復(fù)合物的相互作用蛋白成員的結(jié)合親和力的變化，相互作用蛋白成員或編碼所述蛋白的基因的突變，等。如技術(shù)人員將明白的，術(shù)語"畸變，，以相對含義使用。也就是說，畸變是相對于正常情形的。如本文所使用的，術(shù)語"診斷"是指纟全測疾病或病癥或測定疾病或病癥的狀態(tài)或程度。術(shù)語"診斷"也包括4企測疾病或病癥的誘因，測定藥物治療的治療效果，或預(yù)測對藥物治療或異生素的響應(yīng)^t式。本發(fā)明的診斷方法可以獨(dú)立地〗吏用，或與醫(yī)學(xué)領(lǐng)域已知的對特定疾病或病癥的其它診斷和/或分期方法組合使用。因而，在一個(gè)實(shí)施方案中，通過使用任一種上述方法檢測患者中CaM-TRPM8蛋白復(fù)合物的濃度，和測定患者是否具有畸變濃度的蛋白復(fù)合物，進(jìn)行所述診斷方法。診斷也可以基于本發(fā)明蛋白復(fù)合物的一種或多種相互作用蛋白成員濃度的測定(在蛋白、cDNA或mRNA水平)。相互作用蛋白成員的畸變濃度可以指示生理病癥或生理病癥的誘因。在另一個(gè)實(shí)施方案中，診斷方法包含，測定患者中本發(fā)明蛋白復(fù)合物的細(xì)胞定位、或組織或器官分布，和測定患者是否具有蛋白復(fù)合物的畸變定位或分布。例如，免疫細(xì)胞化學(xué)或免疫組織化學(xué)測定可以使用與本發(fā)明的蛋白復(fù)合物選擇性地免疫反應(yīng)的抗體，在患者的細(xì)胞、組織或器官樣品上進(jìn)行。也可以使用與個(gè)別相互作用蛋白成員和含有蛋白成員的蛋白復(fù)合物都免疫反應(yīng)的抗體，在該情況下，優(yōu)選地也在測定中使用與其它相互作用蛋白成員免疫反應(yīng)的抗體。另外，核酸探針也可以用于原位雜交測定，以檢測編碼蛋白復(fù)合物的相互作用蛋白成員的mRNA的定位或分布。優(yōu)選地，同時(shí)檢測編碼蛋白復(fù)合物的每個(gè)相互作用蛋白成員的mRNA。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的診斷方法包含，檢測本發(fā)明的蛋白復(fù)合物的一個(gè)或多個(gè)相互作用蛋白成員中的任何突變。更具體地，需要測定相互作用蛋白成員是否具有會導(dǎo)致下述變化或與該變化有關(guān)的任何突變蛋白功能活性變化，或它們與其它相互作用蛋白成員形成本發(fā)明的蛋白復(fù)合物的結(jié)合親和力的變化。這樣的突變的實(shí)例包括，但不限于，例如，編碼蛋白成員的基因中的缺失、插入和重排，和核苷酸或氨基酸置換等。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，篩選負(fù)責(zé)蛋白-蛋白相互作用、并導(dǎo)致蛋白復(fù)合物形成的相互作用蛋白成員的域，以檢測其中的任何突變。例如，可以從患者樣品制備編碼相互作用蛋白成員的基因組DNA或cDNA,并測序?？梢詫⑦@樣得到的序列與已知的野生型序列相對比，以鑒別任何突變?；蛘撸梢詮幕颊邩悠芳兓嗷プ饔玫鞍壮蓡T，并通過蛋白測序或質(zhì)譜分析法進(jìn)行分析，以檢測任意氨基酸序列變化。可以使用本領(lǐng)域已知的檢測突變的任何方法，如獲知本發(fā)明公開內(nèi)容的技術(shù)人員將顯而易見的。在另一個(gè)實(shí)施方案中，診斷方法包括，測定一種或多種蛋白復(fù)合物的相互作用蛋白成員的結(jié)合常數(shù)。例如，通過直接純化或通過從由編碼相互作用蛋白成員的患者樣品制備的基因組DNA或cDNA重組表達(dá)，可以從患者得到相互作用蛋白成員。結(jié)合常數(shù)代表著蛋白復(fù)合物中相互作用蛋白成員之間的蛋白-蛋白相互作用的強(qiáng)度。因而，通過測量結(jié)合常數(shù)，可以檢測結(jié)合親和力的細(xì)孩i畸變。在本文中引作參考的(Phizicky和Fields,等人，A^cra&o/.59:94-123(1995))中，綜述了本領(lǐng)域已知的估計(jì)和測定蛋白-蛋白相互作用的結(jié)合常數(shù)的許多方法。例如，可以使用蛋白親和層析。首先，用不同濃度的相互作用蛋白成員制備柱，所述相互作用蛋白成員共價(jià)結(jié)合在柱上。然后，將相互作用蛋白配偶體制劑穿過柱，并用緩沖液洗滌。然后洗脫結(jié)合到與柱相連的相互作用蛋白成員上的相互作用蛋白配偶體。然后基于結(jié)合的蛋白和洗脫的蛋白的濃度，估計(jì)結(jié)合常數(shù)?；蛘撸┻^梯度的沉降方法監(jiān)控穿過甘油或蔗糖梯度的蛋白混合物的沉降速率。在大于結(jié)合常數(shù)的濃度，蛋白可以作為蛋白復(fù)合物沉降。因而，可以基于濃度來計(jì)算結(jié)合常數(shù)。本領(lǐng)域已知的估計(jì)結(jié)合常數(shù)的其它合適的方法包括，但不限于凝膠過濾柱例如非平衡"小區(qū)帶"凝膠過濾柱(參見例如，Gill等人，丄A/o/.S,o/"220:307-324(1991))，平衡凝膠過濾的Hummel-Dreyer方'法(參見夸寸^口,Hummel和Dreyer,5z'oc/z'w.5z.o//2j^.爿cto，63:530_532(1962))和大區(qū)帶平衡凝膠過濾(參見例如，Gilbert和Kellett,丄Szo/.C/iem.,246:6079-6086(1971))，沉P爭平衡(參見例如,Rivas和Minton,7>e"AS/oc/zem,,18:284-287(1993)),熒光方法例如熒光光譜(參見例如，Otto-Bruc等人，歷oc/ze脂Wo;，32:8632-8645(1993))和使用標(biāo)記的分子的熒光偏振或各向異性(參見例如，Weiel和Hershey,Aoc/^w^o/,20:5859-5865(1981)),用固定化的結(jié)合蛋白測量的溶液平《衧(參見例如，Nelson和Long,Aoc/zew/Wry,30:2384-2390(1991)),和表面等離子體共振(參見例如，Panayotou等人，Mo/.Ce〃.Ao/.,13:3567-3576(1993))。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的診斷方法包含，在功能測定系統(tǒng)例如酵母雙-雜交系統(tǒng)中檢測蛋白-蛋白相互作用。因此，為了測定在正常個(gè)體中通常形成蛋白復(fù)合物的2個(gè)相互作用蛋白成員之間的蛋白-蛋白相互作用，可以從待診斷的患者分離編碼相互作用蛋白成員的cDNA?？梢詫⑦@樣克隆的cDNA或其片段亞克隆進(jìn)用于酵母雙-雜交系統(tǒng)的載體中。優(yōu)選地，使用反向酵母雙-雜交系統(tǒng)，從而可以陽性地檢測蛋白之間相互作用的失敗。酵母雙-雜交系統(tǒng)或用于檢測蛋白-蛋白相互作用的其它系統(tǒng)的使用，是本領(lǐng)域已知的，且在下文描述。可以使用試劑盒來進(jìn)行本發(fā)明的診斷方法。通常，試劑盒應(yīng)當(dāng)在載體或區(qū)室化的容器中含有用于診斷方法的任何上述實(shí)施方案的試劑。所述載體可以是容器或支持體，以例如袋子、盒子、管、架子的形式，且任選地區(qū)室化。為了運(yùn)輸和保藏期間的安全目的，所述載體可以定義包圍的限制。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述試劑盒包括可與本發(fā)明的蛋白復(fù)合物選擇性地免疫反應(yīng)的抗體。另外，也可以包含抗蛋白復(fù)合物的個(gè)別相互作用蛋白成員的抗體。所述抗體可以用可片全測標(biāo)記，例如放射性同位素，或酶或熒光標(biāo)記進(jìn)行標(biāo)記?；蛘?，為了才企測目的可以包含第二抗體例如標(biāo)記的抗-IgG等。任選地，所述試劑盒可以包含一種或多種本發(fā)明的蛋白復(fù)合物，其從正常個(gè)體或患有與蛋白復(fù)合物或其相互作用蛋白成員中的畸變有關(guān)的生理病癥的個(gè)體制備或純化。另外，所述試劑盒還可以包含本發(fā)明蛋白復(fù)合物的一種或多種相互作用蛋白成員，其從正常個(gè)體或患有與蛋白復(fù)合物或其相互作用蛋白成員中的畸變有關(guān)的生理病癥的個(gè)體制備或純化。用于擴(kuò)增相互作用蛋白成員的基因或cDNA的合適寡核苷酸引物，也可以提供在試劑盒中。具體地，在優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述試劑盒包括，可與編碼蛋白相互作用對的一個(gè)成員的mRNA或cDNA選擇性雜交的第一種寡核苷酸，和可與編碼相互作用對的其它成員的mRNA或cDNA選擇性雜交的第二種寡核苷酸。也可以包括與編碼蛋白相互作用對的基因區(qū)域雜交的其它寡核苷酸。這樣的寡核苷酸可以用作用于例如編碼相互作用蛋白的mRNA的定量PCR擴(kuò)增的PCR引物，或用作用于檢測mRNA的雜交探針。寡核香酸的長度可以是約8個(gè)核苷酸至約100個(gè)核苷酸，優(yōu)選約12至約50個(gè)核苷酸，且更優(yōu)選約15至約30個(gè)核苷酸。另外，所述試劑盒也可以含有可以用作雜交探針的寡核苷酸，所述雜交探針用于檢測編碼相互作用蛋白成員的cDNA或mRNA。優(yōu)選地，也在試劑盒中包含關(guān)于使用試劑盒或其中含有的試劑的說明書。本發(fā)明的CaM和TRPM8蛋白復(fù)合物的發(fā)現(xiàn)，允許設(shè)計(jì)鑒別增加或降低TRPM8的生物活性的化合物的新方法，所述TRPM8是可以用作鑒別用于治療疼痛、炎癥和皮膚病的藥物的治療靶的傷害性感受器。本發(fā)明的發(fā)現(xiàn)允許建立不使用TRPM8通道傳導(dǎo)性的測量(這是麻煩的)的篩選測定。結(jié)果，本發(fā)明的一個(gè)額外的總方面涉及筌別CaM-TRPM8蛋白復(fù)合物的調(diào)節(jié)劑的方法，所述調(diào)節(jié)劑又增加或降低TRPM8的生物活性。術(shù)語"調(diào)節(jié)劑，，包括可以造成CaM-TRPM8蛋白復(fù)合物的生物活性或功能的任何形式的改變的任何化合物，這包括，例如，增強(qiáng)或減少它們的生物活性，增加或降低它們的穩(wěn)定性，改變它們對某些其它生物分子的親和力或特異性，等。例如，調(diào)節(jié)劑可以是"相互作用拮抗劑"或"相互作用激動劑"。如本文所使用的，術(shù)語"相互作用拮抗劑"是指這樣的化合物它干擾、阻斷、破壞或去穩(wěn)定蛋白-蛋白相互作用；阻斷或干擾蛋白復(fù)合物的形成；或去穩(wěn)定、破壞或解離現(xiàn)有的蛋白復(fù)合物。本文使用的術(shù)語"相互作用激動劑"是指這樣的化合物它觸發(fā)、啟動、傳播、起核作用于(nucleate)或以其他方式增強(qiáng)蛋白-蛋白相互作用的形成；觸發(fā)、啟動、傳播、起核作用于或以其他方式增強(qiáng)蛋白復(fù)合物的形成；或穩(wěn)定現(xiàn)有的蛋白復(fù)合物?？墒褂贸Ｒ?guī)的實(shí)驗(yàn)室形式或在適合高通量的測定中，實(shí)施化合物鑒別方法。術(shù)語"高通量"指的是一種測定設(shè)計(jì)，該設(shè)計(jì)允許容易地同時(shí)和/或快速連續(xù)地篩選眾多樣品，且可包括用于自動操作的能力。高通量測定的另一個(gè)所需的特征是測定的設(shè)計(jì)，其被最優(yōu)化，以減少試劑的使用，或者使操作的數(shù)目最小化以完成所需的分析。測定形式的例子包括96孔或384孔板、懸浮液滴和用于液體處理實(shí)驗(yàn)的"芯片上的實(shí)驗(yàn)室(labonachip)"微通道芯片。本領(lǐng)域技術(shù)人員都知道，隨著塑料模具和液體處理裝置的小型化的進(jìn)展，或隨著改進(jìn)的測定裝置的設(shè)計(jì)，使用本發(fā)明的設(shè)計(jì)可以處理更大數(shù)目的樣品。在本發(fā)明的篩選測定中，可以篩選任何實(shí)驗(yàn)化合物，以選擇本發(fā)明的蛋白復(fù)合物的調(diào)節(jié)劑。術(shù)語"選擇"化合物意在包括(a)從以前不知道是蛋白復(fù)合物或其相互作用蛋白成員的調(diào)節(jié)劑組中選擇化合物；和(b)測試已知能結(jié)合或調(diào)節(jié)蛋白復(fù)合物或其相互作用蛋白成員的功能和活性的化合物。兩類化合物在本文中總稱為"實(shí)驗(yàn)化合物"或"候選化合物"。候選化合物包括許多化學(xué)類別，包括但不限于，小有機(jī)或無機(jī)化合物，天然的或合成的分子，例如抗體，蛋白或其片段，反義核苷酸，干擾RNA(iRNA)和核酶，和它們的書t生物，才莫擬物和類似物。優(yōu)選地，它們是小有機(jī)化合物，即，分子量不大于10,000道爾頓、更優(yōu)選小于5,000道爾頓的那些。優(yōu)選地，實(shí)-瞼化合物以本領(lǐng)域已知的庫形式提供，例如，化學(xué)合成庫(通常參見，Gordan等人丄C/2e肌，37:1385-1401(1994))、重組表達(dá)庫(例如，噬菌體展示庫)、和基于體外翻譯的庫(例如，核糖體展示庫)。候選化合物含有與多肽進(jìn)行結(jié)構(gòu)相互作用所必需的功能性化學(xué)基團(tuán)，且通常至少包括胺、羰基、羥基或羧基，優(yōu)選至少兩個(gè)功能性化學(xué)基團(tuán)，且更優(yōu)選至少三個(gè)功能性化學(xué)基團(tuán)。該候選化合物可包含環(huán)狀碳結(jié)構(gòu)或雜環(huán)結(jié)構(gòu)和/或芳族或多芳族(polyaromatic)結(jié)構(gòu)，它們;故一個(gè)或多個(gè)上述官能團(tuán)取代。候選化合物也可以是生物分子，例如肽、糖、脂肪酸、固醇、類異戊二烯、噪呤、嘧啶或如上所述的衍生物或結(jié)構(gòu)類似物，或者它們的組合等。當(dāng)該化合物是核酸時(shí)，該化合物通常是DNA或RNA分子，雖然具有非天然鍵或亞單位的改性核酸也是預(yù)期的。從包括合成或天然化合物庫的廣泛來源中得到候選化合物。例如有許多手段用來隨機(jī)和定向合成各式各樣的有機(jī)化合物和生物分子，包括表達(dá)隨機(jī)化的寡核苷酸、合成有機(jī)組合庫、隨機(jī)肽的噬菌體展示庫等。使用現(xiàn)有技術(shù)中已知的組合庫方法中的許多方法中的任何一種，包括生物庫、可空間平行尋址的固相或液相庫、需要去褶合的合成庫方法、"一珠一化合物，，庫法和使用親和層析選擇的合成庫方法也可以得到候選化合物(Lam(1997)j/^ctwcwZ>wgDm,12:145)。另外，以細(xì)菌、真菌、植物和動物提取物形式存在的天然化合物庫是可以獲得或容易制備的。此外，天然和合成制備的庫和化合物通過傳統(tǒng)的化學(xué)、物理和生物化學(xué)的手段可很容易改性。再有，可以對已知的藥理學(xué)試劑進(jìn)行定向的或隨機(jī)的化學(xué)改性，例如酰基化、烷基化、酯化、酰胺化等，以生產(chǎn)該試劑的結(jié)構(gòu)類似物。候選化合物可隨機(jī)地選擇，或者可基于與TRPM8活性的功能結(jié)合和/或?qū)ζ溥M(jìn)行調(diào)節(jié)的現(xiàn)有化合物。因此，候選試劑的來源是一個(gè)或超過一個(gè)基于使TRPM8通道傳導(dǎo)性增大或減小的一種或起過一種已知化合物的分子庫，其中所述化合物的結(jié)構(gòu)在分子的一個(gè)或多個(gè)位置上被改變，以含有更多或更少的化學(xué)部分或不同的化學(xué)部分。生成類似物活化劑/抑制劑庫時(shí)，對該分子進(jìn)行的結(jié)構(gòu)改變可以是定向的、隨機(jī)的、或者定向和隨機(jī)置換和/或添加的組合。在制備組合庫中，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員基于現(xiàn)有的化合物，可以容易地制備出這樣的庫。許多其它試劑也可以包含在混合物中。它們包括諸如鹽、緩沖劑、中性蛋白(例如，清蛋白)、去污劑等的試劑，它們可以用于促進(jìn)最佳的蛋白-蛋白和/或蛋白-核酸結(jié)合。這樣的試劑還可以減少反應(yīng)組分的非特異性或背景相互作用。也可以使用提高測定效率的其它試劑，例如核酸酶抑制劑、抗微生物劑等。在現(xiàn)有技術(shù)中能夠見到合成分子庫的方法的例子，例如見Zuckermann等人(1994).JMedCAem.37:2678?；衔飵炜纱嬖谟谌芤褐?例如Houghten(1992)歷Wec—證13:412-421),或在珠(Lam(1991)淑騰354:82-84)、芯片(Fodor(1993)胸訓(xùn)364:555-556)、細(xì)菌(美國專利號5,223，409)、孢子(專利號5,571,698)、質(zhì)粒(Cull等人(1992)/Voc.A^f/.爿cm/.USA89:1865-1869)或噬菌體(見例如Scott和Smith(1990)249:386-390)上?？梢詼y試選擇的化合物調(diào)節(jié)(即干擾或強(qiáng)化)本發(fā)明的蛋白復(fù)合物的TRPM8和CaM之間的相互作用的能力?？梢赃M(jìn)一步測試化合物增加或降低TRPM8的通道傳導(dǎo)性的能力。另外，可以在疼痛、炎癥或皮膚病等動物模型中測試化合物。2個(gè)蛋白域、片段或完整蛋白之間的"相互作用"可以通過許多方法來測定。例如，相互作用可以通過任何普遍接受的方法來4企測，包括功能測定例如酵母雙-雜交系統(tǒng)。蛋白-蛋白相互作用也可以基于2種相互作用配偶體之間的親合結(jié)合，通過各種生物物理學(xué)的和生化的方法來測定。本領(lǐng)域普遍已知的這樣的方法包括，但不限于，蛋白親和層析、親和印跡、共免疫沉淀、亞細(xì)胞分級分離和大分子復(fù)合物的分離等。每種這樣的方法都被充分表征，且可以由本領(lǐng)域技術(shù)人員容易地實(shí)施。參見，例如，美國專利號5,622,852和5,773,218,和PCT公開申請?zhí)朩O97/27296和WO99/65939,它們各自在本文中引作參考。2種相互作用蛋白之間的結(jié)合常數(shù)(它反映了相互作用的強(qiáng)度或質(zhì)量)，也可以使用本領(lǐng)域已知的方法來測定，包括表面表面等離子體共振和等溫滴定量熱術(shù)結(jié)合分析。參見Phizicky和Fields,A/zcra&o/."ev.,59:94-123(1995)?？梢栽隗w外測定中篩選實(shí)驗(yàn)化合物，以鑒別能結(jié)合本發(fā)明的CaM-TRPM8蛋白復(fù)合物的化合物。為此，使實(shí)驗(yàn)化合物接觸蛋白復(fù)合物，接觸的條件和時(shí)間足以允許發(fā)生實(shí)驗(yàn)化合物和靶組分之間的特異性相互作用，從而導(dǎo)致化合物與粑的結(jié)合，且形成復(fù)合物。隨后，檢測結(jié)合事件。在一個(gè)特定的實(shí)施方案中，將蛋白復(fù)合物固定化在固體支持體(例如蛋白微芯片)或細(xì)胞表面上。例如，使用非中和抗體，即能結(jié)合復(fù)合物、但是基本上不影響它的生物活性的抗體，可以將蛋白復(fù)合物直接固定化在微芯片基質(zhì)如載玻片上或多孔板上?？梢栽跇?biāo)準(zhǔn)的結(jié)合測定條件下，使實(shí)驗(yàn)化合物接觸固定化的蛋白復(fù)合物，以允許發(fā)生結(jié)合。使用眾所周知的標(biāo)記技術(shù)，可以用可^r測標(biāo)記來標(biāo)記實(shí)馬全化合物。例如，美國專利號5,741,713公開了用NMR活性同位素標(biāo)記的生化化合物的組合庫。為了鑒別結(jié)合蛋白復(fù)合物的化合物，人們可以測量化合物上的標(biāo)記。當(dāng)篩選有機(jī)的非肽非核酸化合物的組合庫時(shí)，優(yōu)選地使用標(biāo)記的或編碼的(或"已標(biāo)記的，，)組合庫以允許先導(dǎo)結(jié)構(gòu)的快速解碼。這是特別重要的，因?yàn)榕c生物庫不同，在化學(xué)庫中發(fā)現(xiàn)的個(gè)別化合物不能通過自己擴(kuò)增來擴(kuò)增。已標(biāo)記的組合庫提供在，例如，Borchardt和Still,J.2w,C/zem.Soc.，116:373-374(1994)和Moran等人，《/.爿m.C/zem.117:10787-10788(1995),二者都在本文中引作參考。在替代實(shí)施方案中，可以將實(shí)驗(yàn)化合物固定化在固體支持體上，例如，從而形成實(shí)驗(yàn)化合物的微陣列。然后使蛋白復(fù)合物接觸實(shí)驗(yàn)化合物。可以用任何合適的檢測標(biāo)記來標(biāo)記蛋白復(fù)合物。例如，可以在發(fā)生結(jié)合反應(yīng)之前，用放射性同位素或熒光標(biāo)記來標(biāo)記復(fù)合物?；蛘撸诮Y(jié)合反應(yīng)之后，可以使用與復(fù)合物免疫反應(yīng)且用放射性材料、熒光標(biāo)記、酶或標(biāo)記的第二抗-Ig抗體標(biāo)記的抗體，來檢測任何結(jié)合的復(fù)合物，從而筌別結(jié)合化合物。該實(shí)施方案的一個(gè)實(shí)例是蛋白探測方法。也就是說，將根據(jù)本發(fā)明提供的蛋白復(fù)合物用作探針，以篩選蛋白或隨機(jī)肽的表達(dá)庫。表達(dá)庫可以是噬菌體展示庫、基于體外翻譯的庫或普通表達(dá)cDNA庫?？梢詫旃潭ɑ焦腆w支持體如硝酸纖維素濾膜上。參見例如，Sikela和Hahn,A^/.爿cadScz'.84:3038-3042(1987)。所述才果針可以用放射性同位素或熒光標(biāo)記來標(biāo)記?；蛘撸鎏结樋梢陨锼鼗?，并用鏈霉抗生物素蛋白-堿性磷酸酶綴合物檢測。更方便地，可以用抗體檢測結(jié)合的探針。也可以進(jìn)行體外測定，以鑒別能增加或降低本發(fā)明的蛋白復(fù)合物中CaM和TRPM8之間的相互作用的化合物。所述測定可以以類似于上述結(jié)合測定的方式進(jìn)行。例如，通過可與這2種蛋白形成的蛋白復(fù)合物選擇性地免疫反應(yīng)的抗體，可以檢測CaM-TRPM8蛋白復(fù)合物的水平。因而，將CaM-TRPM8蛋白復(fù)合物與實(shí)-瞼化合物溫育后，可以用抗體進(jìn)行免疫沉淀測定。如果實(shí)驗(yàn)化合物破壞蛋白復(fù)合物，則該測定中免疫沉淀的蛋白復(fù)合物的量將顯著小于其中相同的蛋白復(fù)合物沒有接觸實(shí)驗(yàn)化合物的對照測定中的量。類似地，2種蛋白，即CaM和TRPM8或其活性片段或衍生物，可以與實(shí)驗(yàn)化合物一起溫育。2種蛋白形成的蛋白復(fù)合物，可以通過可選擇性地免疫反應(yīng)的抗體來檢測?？梢詫⒌鞍讖?fù)合物的量與在沒有實(shí)驗(yàn)化合物存在下形成的量相對比。如果實(shí)驗(yàn)化合物增強(qiáng)蛋白復(fù)合物的形成，則該測定中免疫沉淀的蛋白復(fù)合物的量將顯著大于其中2種蛋白沒有接觸實(shí)驗(yàn)化合物的對照測定中的量。各種其它的檢測方法適用于測量上述CaM-TRPM8蛋白復(fù)合物的水平。在具體的實(shí)施方案中，TRPM8是在分離的細(xì)胞膜中，并接觸實(shí)驗(yàn)化合物。使用本領(lǐng)域已知的標(biāo)記技術(shù)，可以用可檢測標(biāo)記例如放射性材料或熒光標(biāo)記來標(biāo)記鈣調(diào)蛋白。使標(biāo)記的CaM能接觸TRPM8。洗掉未結(jié)合的CaM后，通過細(xì)胞膜上的標(biāo)記，；險(xiǎn)測形成的TRPM8-CaM蛋白復(fù)合物的水平。通過對比當(dāng)TRPM8接觸實(shí)騶M匕合物時(shí)形成的TRPM8-CaM復(fù)合物的水平和在沒有實(shí)驗(yàn)化合物時(shí)形成的水平，測定實(shí)-驗(yàn)化合物調(diào)節(jié)CaM和TRPM8之間的相互作用的能力?；蛘?，如技術(shù)人員將明白的，形成的TRPM8-CaM蛋白復(fù)合物的水平也可以用抗CaM的標(biāo)記的抗體來檢測，或用與CaM融合的多肽的特異性抗體來檢測。可以將可才全測的附加表位融合至CaM、TRPM8或其活性片,殳或衍生物，以便利本發(fā)明的蛋白復(fù)合物的檢測。這樣的附加表位的合適的實(shí)例包括源自例如流感病毒血凝素(HA)、猿猴病毒5(V5)、多組氨酸(6xHis)、c-myc、lacZ、GST等的序列。在另一個(gè)實(shí)施方案中，使用熒光共振能量轉(zhuǎn)移(FRET)來篩選本發(fā)明的蛋白復(fù)合物的調(diào)節(jié)劑。FRET測定測量一種熒光標(biāo)記向另一種熒光標(biāo)記的能量轉(zhuǎn)移。熒光標(biāo)記優(yōu)先吸收在一個(gè)波長的光，并優(yōu)先發(fā)射在第二個(gè)波長的光。FRET測定如下利用該特征選擇一種稱作供體熒光團(tuán)的熒光標(biāo)記，它優(yōu)先發(fā)射在稱作受體熒光團(tuán)的第二標(biāo)記優(yōu)先吸收光的波長的光。通過測量從供體熒光團(tuán)向受體熒光團(tuán)的能量轉(zhuǎn)移，可以測定供體和受體熒光團(tuán)的接近。如下測量能量轉(zhuǎn)移在供體熒光團(tuán)吸收光的波長，在含有受體和供體熒光團(tuán)的溶液上發(fā)出光，并在受體熒光團(tuán)發(fā)射光的波長，測量熒光。受體熒光團(tuán)的熒光的量，指示著供體和受體熒光團(tuán)的接近。在說明性的FRET測定中，用供體熒光團(tuán)如TP^標(biāo)記TRPM8或TRPM8的活性片l殳或衍生物，并用受體熒光團(tuán)如BODIPY-TMR標(biāo)記CaM或CaM的活性片段或衍生物。將本發(fā)明的蛋白復(fù)合物的這些熒光標(biāo)記的成員一起放入溶液中。在溶液上發(fā)出TP^優(yōu)先吸收的波長的光，且在BODIPY-TMR優(yōu)先發(fā)射的波長測量溶液的熒光。然后向溶液中加入實(shí)驗(yàn)化合物。在溶液上發(fā)出Tpw優(yōu)先吸收的波長的光，且在BODIPY-TMR優(yōu)先發(fā)射的波長測量溶液的熒光。如果與沒有實(shí)驗(yàn)化合物時(shí)相比，實(shí)-瞼化合物降低溶液的焚光，則該實(shí)-瞼化合物降低CaM和TRPM8之間的相互作用。在另一個(gè)實(shí)施方案中，使用熒光偏振(FP)測量來篩選本發(fā)明的蛋白復(fù)合物的調(diào)節(jié)劑。FP測量已經(jīng)用于提供關(guān)于分子取向和運(yùn)動性和調(diào)節(jié)它們的過程的信息，所述過程包括受體-配體相互作用、蛋白酶解、蛋白-DNA相互作用、膜流動性和肌肉收縮。FP測量法長期以來是一種有價(jià)值的生物物理學(xué)研究工具，其用于在分子水平研究諸如膜脂運(yùn)動性、肌球蛋白再定向和蛋白-蛋白相互作用的過程(參見例如，Jameson等人,M"/20^sEw2yw0/,1995,246:283-300)。已經(jīng)開發(fā)并廣泛用于臨床診斷的免疫測定，代表著生物分析應(yīng)用的最大組。配有偏振光學(xué)器件的微量培養(yǎng)板讀數(shù)器的最新進(jìn)展，已經(jīng)導(dǎo)致將熒光偏振用作高通量篩選的讀出才莫式。在示例性的FP測定中，選擇性地激發(fā)它們的吸收轉(zhuǎn)換矢量與線式偏振光的電矢量平行對齊(沿著垂直頁面軸)的染料分子。關(guān)于附著到小的、快速旋轉(zhuǎn)的分子上的染料，最初的光選擇的定向分布在發(fā)射之前變得隨機(jī)化，從而導(dǎo)致低熒光偏振。相反地，低分子量示蹤劑與大的、緩慢旋轉(zhuǎn)的分子的結(jié)合，導(dǎo)致高熒光偏振。熒光偏振因此提供了示蹤劑與蛋白、核酸和其它生物聚合物的結(jié)合程度的直接讀出。用于FP測定的染料和其它試劑可商業(yè)上得到，例如從Invitrogen。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，酵母雙-雜交系統(tǒng)之一或它們的類似的或衍生的形式可以用于鑒別CaM-TRPM8蛋白復(fù)合物的調(diào)節(jié)劑。本領(lǐng)域已知的合適的雙-雜交系統(tǒng)的實(shí)例包括，但不限于，公開于美國專利號5,283,173;5,525,4卯；5,585,245;5,637,463;5,695，941;5,733，726;5,776,689;5,885,779;5,905，025;6,037,136;6,057,101;6,114,111;和Bartel和Fields,編.，7Tzer衡-外6hc/5y他m，Cb:/oniL^m'vem.(y7V墮,臉w厄'1997中那些，它們都在本文中引作參考。通常，在經(jīng)典的基于轉(zhuǎn)錄的雙-雜交測定中，制備編碼2種融合蛋白的2個(gè)嵌合基因一種含有與本發(fā)明的蛋白復(fù)合物的相互作用蛋白成員或相互作用蛋白成員的相互作用域或片段融合的轉(zhuǎn)錄激活域，而另一種融合蛋白包括與蛋白復(fù)合物的另一個(gè)相互作用蛋白成員或其片段或相互作用域融合的DNA結(jié)合域。為了方便的目的，將2個(gè)相互作用蛋白成員、其片段或相互作用結(jié)構(gòu)域分別稱作"誘辨(bait)融合蛋白"和"獵物(prey)融合蛋白"。編碼這些融合蛋白的嵌合基因分別稱作"誘飾嵌合基因"和"獵物嵌合基因"。通常，提供"誘餅載體"和"獵物載體"，分別用于誘斜嵌合基因和獵物嵌合基因的表達(dá)。許多類型的載體可以用于基于轉(zhuǎn)錄的雙-雜交測定中。構(gòu)建誘鉺載體和獵物載體的方法，應(yīng)是獲知本發(fā)明公開內(nèi)容的本領(lǐng)域技術(shù)人員顯而易見的。通常參見,Cwre"f/Vc^oco/sM/ecw/arAo/ogy,Vol,2,Ed.Ausubel,等人，GreenePublish.Assoc.&WileyInterscience,Ch.13,1988;Glover,DA^C/omwg,Vol.II,IRLPress,Wash.,D.C.,Ch.3,1986;Bitter,等人，inA/"/zoA五"zymo/ogy153:516-544(1987);77zeM/ecw/arS/o/ogyo//7eYeaWS"cc/zar譜yces,Eds.Strathem等人,ColdSpringHarborPress,Vols.I和II,1982;和RothsteininDA^4C7o"/"g.'^尸認(rèn)⑩/勿訓(xùn)c/z,Vol.11，Ed.DMGlover,IRLPress,Wash"D,C.,1986。通常，誘斜和獵物載體包括具有可操作地連接到嵌合基因上的啟動子的表達(dá)盒，用于轉(zhuǎn)錄該嵌合基因。所述載體還可以包括用于在宿主細(xì)胞中復(fù)制載體的DNA復(fù)制起點(diǎn)、和用于在例如大腸桿菌中擴(kuò)增載體的復(fù)制起點(diǎn)、和用于僅選擇和維持?jǐn)y帶該載體的那些宿主細(xì)胞的選擇標(biāo)記。另外，所述表達(dá)盒也優(yōu)選地含有誘導(dǎo)型元件，其功能是控制嵌合基因的表達(dá)。在融合蛋白或其組分對宿主細(xì)胞有毒的情況下，使嵌合基因的表達(dá)可誘導(dǎo)且可控制是特別重要的。其它調(diào)節(jié)序列例如轉(zhuǎn)錄增強(qiáng)子序列和翻譯調(diào)節(jié)序列(例如，SD序列)也可以包含在表達(dá)盒中。終止序列例如牛生長激素、SV40、lacZ和AcMNPV多角體多腺苦酸化信號，也可以可操作地連接至表達(dá)盒中的嵌合基因上。用于檢測和/或純化融合蛋白的附加表位編碼序列，也可以可操作地連接至表達(dá)盒中的嵌合基因上。有用的附加表位的實(shí)例包括、但不限于，流感病毒血凝素(HA)、猿猴病毒5(V5)、多組氨酸(6xHis)、c-myc、lacZ、GST等。具有多組氨酸標(biāo)記的蛋白可以用Ni親和柱容易地才企測和/或純化，而對許多附加表位特異性的抗體通?？缮虡I(yè)上得到。通過本領(lǐng)域已知的任何技術(shù)，例如，通過直接DNA轉(zhuǎn)化、顯微注射、電穿孔、病毒感染、脂轉(zhuǎn)染、基因槍等，可以將載體導(dǎo)入宿主細(xì)胞。誘辨和獵物載體可以以染色體外狀態(tài)維持在宿主細(xì)胞中，即作為自我復(fù)制質(zhì)?；虿《?。或者，通過常規(guī)技術(shù)，例如穩(wěn)定細(xì)胞系的選擇或位點(diǎn)-特異性的重組，可以將一種或2種載體整合入宿主細(xì)胞的染色體中。盡管雙-雜交測定源自酵母，但此后已經(jīng)開發(fā)了在許多不同的宿主細(xì)胞中進(jìn)行的類似測定，包括]旦不限于細(xì)菌、酵母細(xì)胞、植物細(xì)胞、昆蟲細(xì)胞和哺乳動物細(xì)胞。技術(shù)人員將認(rèn)識到，載體的i殳計(jì)可以隨使用的宿主細(xì)力包而變。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述測定在原核細(xì)胞中進(jìn)4t,例如大腸桿菌、沙門氏菌屬(Sa/mo"e〃a)、克雷伯氏菌屬(f/eZ)wW/a)、單月包菌屬(尸化z/t/o附owow)、^f丙斥干菌屬(G2w/o6ac,er)和才艮瘤菌屬(A/z&oZ)^m)。用于本發(fā)明的該實(shí)施方案的表達(dá)載體的合適復(fù)制起點(diǎn)包括，例如，ColEl、pSC101和M13復(fù)制起點(diǎn)。合適的啟動子的實(shí)例包括，例如，T7啟動子、lacZ啟動子等。另外，誘導(dǎo)型啟動子也可以用于調(diào)節(jié)嵌合基因的表達(dá)。例如，來自噬菌體人plac5的lac操縱子是本領(lǐng)域眾所周知的，且可通過向生長培養(yǎng)基中加入IPTG來誘導(dǎo)?？捎糜诩?xì)菌表達(dá)系統(tǒng)中的其它已知的誘導(dǎo)型啟動子包括噬菌體X的pL、trp啟動子和雜種啟動子例如tac啟動子等。另外，用于僅選擇和維持表達(dá)所需的融合蛋白的那些原核細(xì)胞的選擇標(biāo)記序列也應(yīng)當(dāng)整合入表達(dá)載體中。包括營養(yǎng)缺陷型標(biāo)記和抗生素抗性標(biāo)記在內(nèi)的許多選擇標(biāo)記是本領(lǐng)域已知的，且都可以用于本發(fā)明目的。例如，賦予氨節(jié)青霉素抗性的bla基因是在原核表達(dá)載體中最常用的選擇標(biāo)記。其它合適的標(biāo)記包括賦予宿主細(xì)胞新霉素、卡那霉素或潮霉素抗性的基因。實(shí)際上，許多載體可從供應(yīng)商商業(yè)上得到，例如Carlsbad,Calif.的InvitrogenCorp.,PaloAlto,Calif.的ClontechCorp.,和LaJolla,Calif.的StratageneCorp,，和Madison,Wis,的PromegaCorp.。這些可商業(yè)得到的載體，例如，pBR322、pSPORT、pBluescriptllSK、pcDNAI和pcDNAII,都具有可以使用常規(guī)重組技術(shù)方便地將本發(fā)明的嵌合基因插入其中的多克隆位點(diǎn)。通過本領(lǐng)域普遍已知的各種轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染技術(shù)，可以將構(gòu)建的表達(dá)載體導(dǎo)入宿主細(xì)胞。在另一個(gè)實(shí)施方案中，將哺乳動物細(xì)胞用作用于表達(dá)融合蛋白和檢測蛋白-蛋白相互作用的宿主細(xì)胞。為此，實(shí)際上可以使用任何哺乳動物細(xì)胞，包括正常組織細(xì)胞、穩(wěn)定的細(xì)胞系和轉(zhuǎn)化的胂瘤細(xì)胞。方便地，使用哺乳動物細(xì)胞系，例如CHO細(xì)胞、JurkatT細(xì)胞、NIH3T3細(xì)胞、HEK-293細(xì)胞、CV-1細(xì)胞、COS-l細(xì)胞、HeLa細(xì)胞、VERO細(xì)胞、MDCK細(xì)胞、WI38細(xì)胞等。哺乳動物表達(dá)載體是本領(lǐng)域眾所周知的，且許多可商業(yè)得到。用于在哺乳動物細(xì)胞中轉(zhuǎn)錄嵌合基因的合適啟動子的實(shí)例包括源自下述病毒的病毒轉(zhuǎn)錄啟動子腺病毒、猿猴病毒40(SV40)(例如，SV40的早期和晚期啟動子)、勞斯肉瘤病毒(RSV)和巨細(xì)胞病毒(CMV)(例如，CMV立即早期啟動子)、人免疫缺陷病毒(HIV)(例如，長末端重復(fù)序列(LTR))、痘苗病毒(例如，7.5K啟動子)和單純皰疹病毒(HSV)(例如，胸苷激酶啟動子)。也可以使用誘導(dǎo)型啟動子。合適的誘導(dǎo)型啟動子包括，例如，四環(huán)素響應(yīng)元件(TRE)(參見Gossen等人,尸亂淑/JcWU&4,89:5547-5551(1992))、金屬硫蛋白IIA啟動子、蛻皮激素-響應(yīng)啟動子和熱激啟動子。用于在哺乳動物細(xì)胞中復(fù)制和維持表達(dá)載體的合適復(fù)制起點(diǎn)包括，例如，在有EpsteinBarr核抗原存在下的EpsteinBarr復(fù)制起點(diǎn)(參見Sugden等人，Mo/e.Ce〃.3/o/.，5:410-413(1985》和在有SV40T抗原(它存在于COS-l和COS-7細(xì)胞中)存在下的SV40復(fù)制起點(diǎn)(參見Margolskee等人，Mo/e.Ce〃.8:2837(1988))。合適的選擇標(biāo)記包括，但不限于，賦予對新霉素、潮霉素、zeocin等的抗性的基因。許多可商業(yè)得到的哺乳動物表達(dá)載體可以用于本發(fā)明，包括，例如，pCEP4、pcDNAI、pIND、pSecTag2、pVAXl、pcDNA3.1和pBI-EGFP和pDisplay。4吏用任何已知的4支術(shù)，例如石舞酸鈣沉淀、脂轉(zhuǎn)染、電穿孔等，可以將載體導(dǎo)入哺乳動物細(xì)胞?？梢詫⒄T餌載體和獵物載體共轉(zhuǎn)化進(jìn)相同細(xì)胞，或者，導(dǎo)入2個(gè)不同的細(xì)胞，隨后通過細(xì)胞融合或其它合適的技術(shù)將它們?nèi)诤系揭黄?。允許通過病毒感染將重組基因?qū)爰?xì)胞中的病毒表達(dá)載體，也可以用于表達(dá)融合蛋白。本領(lǐng)域普遍已知的病毒表達(dá)載體包括基于腺病毒、牛乳頭瘤病毒、鼠千細(xì)胞病毒(MSCV)、MFG病毒和反轉(zhuǎn)錄病毒的病毒載體。參見Sarver,等人，Mo/.Ce〃.5zo/.，1:486(1981);Logan&Shenk,尸麼.淑/.,,81:3655-3659(1984);Mackett,等人，尸腦淑/.爿c"dSc/.,，79:7415-7419(1982);Mackett,等人，丄Wra/.,49:857-864(1984);Panicali,等人，尸rac.A^f/.^cadS""&4,79:4927-4931(1982);Cone&Mulligan,尸rac.iW/f/.81:6349-6353(1984);Mann等人，Ce〃，33:153-159(1993);Pear等人,M/,/.爿c"t/.V&i90:8392-8396(1993);Kitamura等人，A/a"爿c^f.[/&4，92:9146-9150(1995);Kinsella等人，i/wma"772era/7乂7:1405-1413(1996);Hofmann等人，Ato/.JcadS"93:5185-5190(1996);Choate等人，i/wm朋77zera/^，7:2247(1996);WO94/19478;Hawley等人,Ge"e77^ra;乂1:136(1994)和Rivere等人，Ge"W(^,92:6733(1995),它們都引作參考。通常，為了構(gòu)建病毒載體，可以將根據(jù)本發(fā)明的嵌合基因可操作地連接至合適的啟動子。然后將啟動子-嵌合基因構(gòu)建體插入病毒載體的非必需區(qū)，通常是修飾的病毒基因組。這導(dǎo)致產(chǎn)生活的重組病毒，其能在感染的宿主細(xì)胞中表達(dá)由該嵌合基因編碼的融合蛋白。一旦進(jìn)入宿主細(xì)胞，重組病毒通常就整合入宿主細(xì)胞的基因組中。^旦是，重組牛乳頭瘤病毒通常作為染色體外元件進(jìn)行復(fù)制和保持。在另一個(gè)實(shí)施方案中，在植物細(xì)胞系統(tǒng)中進(jìn)行本發(fā)明的檢測測定。用于在植物細(xì)胞中表達(dá)外源蛋白的方法是本領(lǐng)域眾所周知的。通常參見,Weissbach&Weissbach,她f/zcxis/or尸/虛M>/ecw/"rAo/ogy,AcademicPress,NY,1988;Grierson&Corey,尸/虛楊/ecwAarS/o/ogy,2dEd,,Blackie,London,1988。基于例如花椰菜花葉病毒(CaMV)或煙草花葉病毒(TMV)的重組病毒表達(dá)載體都可以使用?；蛘?，重組質(zhì)粒表達(dá)載體例如Ti質(zhì)粒載體和Rl質(zhì)粒載體也是有用的。也可以將編碼本發(fā)明的融合蛋白的嵌合基因方便地克隆進(jìn)表達(dá)載體，并置于病毒啟動子(例如CaMV的"SRNA和19SRNA啟動子或TMV的外殼蛋白啟動子)或植物啟動子(例如，RUBISCO的小亞基啟動子和熱激啟動子(例如，大豆hspl7.5-E或hspl7.3-B啟動子))的控制下。另外，使用桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)，也可以在昆蟲細(xì)胞如草地夜蛾(5^ocfo/7化ra/rag^e^")細(xì)胞中進(jìn)行本發(fā)明的體內(nèi)測定。用于該系統(tǒng)中的表達(dá)載體和宿主細(xì)胞是本領(lǐng)域眾所周知的，且通?？蓮亩鄠€(gè)商業(yè)供應(yīng)商得到。例如，可以方便地將本發(fā)明的嵌合基因克隆進(jìn)苜蓿丫紋夜蛾(Jwtogra//2"cw7/on力ca)核型多角體病毒(AcNPV)載體的非必需區(qū)(例如，多角體蛋白基因)中，并置于AcNPV啟動子(例如，多角體蛋白啟動子)的控制下。這樣產(chǎn)生的未阻塞的重組病毒可以用于感染在其中表達(dá)嵌合基因的昆蟲宿主細(xì)胞，例如草地夜蛾細(xì)胞。參見美國專利號4,215,051。在本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案中，使用諸如啤酒糖酵母(Sacc/^TOm_ycM)、多形漢遜氏酵母(//a"化,/a;o(ymoT/za)、巴斯德畢赤氏酵母(尸/c/ziapasfohs)禾口粟酒裂歹直灃唐酵母(Sc/n'zoracc/wromyces/owZ)e)的酵母作為宿主細(xì)胞，在酵母表達(dá)系統(tǒng)中表達(dá)融合蛋白。在酵母中表達(dá)重組蛋白是一個(gè)充分開發(fā)的領(lǐng)域，且用于這方面的技術(shù)詳細(xì)公開在T7zeMo/ecw/orS/o/ogyq/"/7ze7eaW5^cc/wr謂ycM,Eds.Strathem等人,Vols.I和II,ColdSpringHarborPress,1982;Ausubel等人,CwreW/VWoco/s/"M/ecw/orA'o/ogy,NewYork,Wiley,1994;和Guthrie和Fink,GWt/eTeas1/GewWcsaw<iM/ecw/or_8z'o/cgy,inM"/ocfe5Vzz，o/ogy,Vol.194,1991,它們都在本文中引作參考。Sudbery，O^r.0^".Aofec/z.,7:517-524(1996)綜述了本領(lǐng)域在各種酵母物種中表達(dá)重組蛋白的成功；其中引用的完整內(nèi)容和參考文獻(xiàn)都在本文中引作參考。另外，Bartel和Fields,編.，T7ze7eaW7Vo-外6".(iS，em,OxfordUniversityPress,NewYork,N.Y.,1997含有在各種酵母雙-雜交系統(tǒng)的背景下在酵母中重組表達(dá)融合蛋白的廣泛討論，并引用了許多相關(guān)的參考文獻(xiàn)。這些和本領(lǐng)域已知的其它方法都可以用于本發(fā)明的目的。將這樣的方法用于本發(fā)明，應(yīng)是獲知本發(fā)明公開內(nèi)容的技術(shù)人員顯而易見的。通常，2個(gè)嵌合基因中的每一個(gè)包含在分開的表達(dá)載體(誘飾載體和獵物載體)中。2個(gè)載體可以共轉(zhuǎn)化進(jìn)單個(gè)酵母宿主細(xì)胞。如技術(shù)人員將明白的，也可能從單個(gè)載體表達(dá)2個(gè)嵌合基因。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，將誘何載體和獵物載體分別導(dǎo)入相反交配型(例如，a-型和a-型)的2個(gè)單倍體酵母細(xì)胞中。2個(gè)單倍體細(xì)胞可以在需要的時(shí)間交配，以形成表達(dá)2個(gè)嵌合基因的二倍體細(xì)胞。通常，用于在酵母中重組表達(dá)的誘餅和獵物載體包括酵母復(fù)制起點(diǎn)，例如用于在酵母細(xì)胞中復(fù)制和維持載體的2p起點(diǎn)或ARSH4序列。優(yōu)選地，所述載體也具有細(xì)菌復(fù)制起點(diǎn)(例如，ColEl)和細(xì)菌選擇標(biāo)記(例如，ampR標(biāo)記，即，bla基因)。任選地，包含CEN6著絲粒序列，以控制酵母細(xì)胞中載體的復(fù)制。可以采用能在酵母細(xì)胞中驅(qū)動基因轉(zhuǎn)錄的任何組成型或誘導(dǎo)型啟動子以控制嵌合基因的表達(dá)。這樣的啟動子可操作地連接到嵌合基因上。合適的組成型啟動子的實(shí)例包括，但不限于酵母ADH1、PGK1、TEF2、GPD1、HIS3和CYC1啟動子。合適的誘導(dǎo)型啟動子的實(shí)例包括，但不限于酵母GAL1(可被半乳糖誘導(dǎo))、CUP1(可被01++誘導(dǎo))和FUS1(可被信息素誘導(dǎo))啟動子；來自多形漢遜氏酵母和巴斯德畢赤氏酵母的AOX/MOX啟動子(被葡萄糖或乙醇抑制，且被甲醇誘導(dǎo))；嵌合啟動子例如含有LexA操縱基因的那些(可被含有LexA的轉(zhuǎn)錄因子誘導(dǎo))；等。當(dāng)嵌合基因編碼的融合蛋白對宿主細(xì)胞有毒時(shí)，誘導(dǎo)型啟動子是優(yōu)選的。如果需要，可以將某些轉(zhuǎn)錄阻遏序列如來自SP013啟動子的上游阻遏序列(URS)可操作地連接至啟動子序列，例如，啟動子區(qū)域的5'末端。這樣的上游阻遏序列的功能是微調(diào)嵌合基因的表達(dá)水平。優(yōu)選地，將轉(zhuǎn)錄終止信號可操作地連接至載體中的嵌合基因上。通常，可以使用源自例如CYC1和ADH1基因的轉(zhuǎn)錄終止信號序列。另外，優(yōu)選地，誘辨載體和獵物載體含有一個(gè)或多個(gè)選擇標(biāo)記，用于僅選擇和維持?jǐn)y帶一個(gè)或2個(gè)嵌合基因的那些酵母細(xì)胞。本領(lǐng)域已知的任何選擇標(biāo)記，可以用于本發(fā)明的目的，只要可以正鑒別或負(fù)選擇表達(dá)嵌合基因的酵母細(xì)胞即可?？梢哉b別的標(biāo)記的實(shí)例是基于顏色測定的那些，包括lacZ基因(它編碼P-半乳糖苷酶)、縈火蟲螢光素酶基因、分泌的堿性磷酸酶、辣根過氧化物酶、藍(lán)色熒光蛋白(BFP)和綠色熒光蛋白(GFP)基因(參見Cubitt等人，7>e"ASz<9c/2em.20:448-455(1995))。也可以使用允許通過熒光、化學(xué)發(fā)光、紫外吸收、紅外輻射等^r測的其它標(biāo)記?？梢赃x擇的標(biāo)記是營養(yǎng)缺陷型標(biāo)記，包4舌，但_不限于，URA3、HIS3、TRP1、LEU2、LYS2、ADE2等。通常，為了營養(yǎng)缺陷型選擇的目的，在缺少特定營養(yǎng)物的培養(yǎng)基中培養(yǎng)用誘飾載體和/或獵物載體轉(zhuǎn)化的酵母宿主細(xì)胞。其它選擇標(biāo)記不是基于營養(yǎng)缺陷型，而是基于對抗生素或其它異生素的抗性或敏感性。這樣的標(biāo)記的實(shí)例包括，但不限于氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶(CAT)基因，它賦予對氯霉素的抗性；CAN1基因，它編碼精氨酸通透酶，且從而使細(xì)胞對刀豆氨酸敏感(參見Sikorski等人，A/e仇E""wo/.，194:302-318(1991));細(xì)菌卡那霉素抗性基因(kan"，它使真核細(xì)胞抗氨基糖苷G418(參見Wach等人,R"W，10:1793-1808(1994));和CYH2基因，它賦予對環(huán)己酰亞胺的敏感性(參見Sikorski等人，Me仇五w矽wo/.,194:302-318(1991))。另外，編碼金屬硫蛋白并從而賦予對銅的抗性的CUP1基因，也是合適的選擇標(biāo)記。每種上述的選擇標(biāo)記可以單獨(dú)地或組合地-使用?？梢詫⒁粋€(gè)或多個(gè)選擇標(biāo)記包含在特定誘飾或獵物載體中。誘飾載體和獵物載體可以具有相同或不同的選擇標(biāo)記。另外，可以在交配單倍體酵母細(xì)胞之前或之后，將選擇壓力置于轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞上。如將是顯而易見的，使用的選擇標(biāo)記應(yīng)當(dāng)補(bǔ)償在其中表達(dá)誘餌和/或獵物載體的宿主菌抹。換而言之，當(dāng)將基因用作選擇標(biāo)記基因時(shí)，應(yīng)當(dāng)將缺少該選擇標(biāo)記基因(或具有相應(yīng)基因中的突變)的酵母菌林用作宿主細(xì)胞。本領(lǐng)域已知許多與各種選擇標(biāo)記相對應(yīng)的酵母菌株或衍生菌株。其中的許多已經(jīng)專門為某些酵母雙-雜交系統(tǒng)而開發(fā)。就本發(fā)明來說應(yīng)用和任選地修飾這些菌林，將是獲知本發(fā)明公開內(nèi)容的技術(shù)人員顯而易見的。使用遺傳雜交或重組誘變基因操作酵母菌抹的方法，是本領(lǐng)域眾所周知的。參見例如，Rothstein,她仇101:202-211(1983)。作為實(shí)例，下述酵母菌林是本領(lǐng)域眾所周知的，且在必要的修飾和調(diào)整后，可以用于本發(fā)明。L40菌抹，它具有基因型MATahis3A200trpl-901leu2-3,112ade2LYS2::(lexAop)4畫HIS3URA3::(lexAop)8國lacZ;。EGY48菌株，它具有基因型MATatrplhis3um36ops-LEU2;和。MaV103菌林，它具有基因型MATaura3-521eu2-3,112trpl-901his3A200ade2-101gal4Agal80ASPAL10::URA3GAL1::HIS3::lys2(參見Kumar等人，J.說o/.C/zem.272:13548-13554(1997);Vidal等人,？rac.Ato/.JcW.f/&4,93:10315-10320(1996》。這樣的菌林在研究界可遺傳地得到，且也可以通過簡單的酵母遺傳操作來得到。參見，例如，TheYeastTwo-HybridSystem,Bartel和Fields,編.，pages173-182,OxfordUniversityPress,NewYork,N.Y.,1997。另外，下述酵母菌林可商業(yè)得到。Y190菌抹，它可從Clontech,PaloAlto,Calif.得到，且具有基因型MATagal4gal80his3A200trpl-901ade2-101ura3-52leu2國3，112URA3::GALl-lacZLYS2::GALl畫fflS3cyhr;和。YRG-2菌抹，它可從Stratagene,LaJolla,Calif.得到，且具有基因型MATaura3-52his3國200ade2-101lys2-801打pl國901leu2-3,112gal4-542gal80陽538LYS2::GAL1國HIS3URA3::GAL1/CYC1-lacZ。實(shí)際上，為酵母雙-雜交系統(tǒng)分析專門設(shè)計(jì)的不同版本的載體和宿主菌抹可在來自商業(yè)供應(yīng)商的試劑盒中得到，例如Clontech,PaloAlto,Calif.和Stratagene,LaJolla,Calif.,它們都可以經(jīng)修改用于本發(fā)明。在相互作用拮抗劑的篩選測定中，將CaM或其活性片段或衍生物和TRPM8或其活性片段或衍生物用作用于雙-雜交測定目的的以上述融合蛋白形式表達(dá)的實(shí)驗(yàn)蛋白。在宿主細(xì)胞中表達(dá)融合蛋白，并在有一種或多種實(shí)驗(yàn)化合物存在下允許它們彼此相互作用。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，將反選擇標(biāo)記用作報(bào)道分子，以便僅在實(shí)-驗(yàn)化合物能干擾2種實(shí)驗(yàn)蛋白之間的相互作用時(shí)，存在可檢測的信號(例如，顏色或熒光的出現(xiàn)，或細(xì)胞存活)。在這方面，可以使用在本領(lǐng)域已知的各種"反向雙-雜交系統(tǒng)"中使用的報(bào)道分子。反向雙-雜交系統(tǒng)公開在，例如，美國專利號5,525,490;5,733,726;5,885,779;Vidal等人，尸rac.Ato/.Jc^/.(7&4,93:10315-10320(1996);和Vidal等人，尸toc.A^/.Xcac/.93:10321-10326(1996)，它們都在本文中引作參考。用于酵母系統(tǒng)的合適反選擇報(bào)道分子的實(shí)例包括，URA3基因(編碼乳清苷-5'-脫羧酶，它將5-氟乳清酸(5-FOA)轉(zhuǎn)化成有毒的代謝物5-氟尿嘧啶)，CAN1基因(編碼精氨酸通透酶，它將有毒的精氨酸類似物刀豆氨酸運(yùn)輸進(jìn)酵母細(xì)胞)，GAL1基因(編碼半乳糖激酶，它催化2-脫氧半乳糖向有毒的2-脫氧半乳糖-l-磷酸的轉(zhuǎn)化)，LYS2基因(編碼a-氨基己二酸還原酶，它使酵母細(xì)胞不能在含有a-氨基己二酸作為唯一氮源的培養(yǎng)基上生長)，MET15基因(編碼0-乙酰高絲氨酸硫化氫解酶，它賦予酵母細(xì)胞對曱基汞的敏感性)，和CYH2基因(編碼L29核糖體蛋白，它賦予對環(huán)己酰亞胺的敏感性)。另外，任何已知的細(xì)胞毒性劑，包括細(xì)胞毒性蛋白如白喉毒素(DTA)催化域，也可以用作反選擇報(bào)道分子。參見美國專利號5,733,726。DTA造成延伸因子-2的ADP-核糖基化，并從而抑制蛋白合成，且造成細(xì)胞死亡。細(xì)胞毒性劑的其它實(shí)例包括篦麻毒蛋白、志賀菌毒素和銅綠假單孢菌(尸"i^owowayaerwg/wo加)的夕卜毒素A。例如，當(dāng)將URA3基因用作反選擇報(bào)道基因時(shí)，可以將含有突變URA3基因的酵母細(xì)胞用作體內(nèi)測定的宿主細(xì)胞(Um下oa11表型)。這樣的細(xì)胞缺少URA3-編碼的功能性乳清苷-5'-磷酸脫羧酶，即生物合成尿嘧啶所需的酶。結(jié)果，該細(xì)胞不能在缺少尿嘧啶的培養(yǎng)基上生長。但是，因?yàn)椴淮嬖谝吧腿榍蹇?5'-磷酸脫羧酶，該酵母細(xì)胞不能將無毒的5-氟乳清酸(5-FOA)轉(zhuǎn)化成有毒的產(chǎn)物5-氟尿嘧啶。因而，這樣的酵母細(xì)胞是5-FOA抗性的，且可以在含有5-FOA的培養(yǎng)基上生長。因此，例如，為了篩選能破壞AP0A1(或其同源物、片段或衍生物)或AP0A1的突變形式(或其同源物、片段或衍生物)與PRA1(或其同源物、片段或衍生物)或PRA1的的突變形式(或其同源物、片段或衍生物)之間的相互作用的化合物，將AP0A1(或其同源物、片段或衍生物)表達(dá)為具有合適的轉(zhuǎn)錄激活劑的DNA-結(jié)合域的融合蛋白，而將PRA1(或其同源物、片段i菌抹中，可以將報(bào)道分子ur13基因'可操;地連接^到特異性響應(yīng)于轉(zhuǎn)錄激活域和DNA-結(jié)合域的結(jié)合的啟動子上。在Ura下oa11酵母細(xì)胞中表達(dá)融合蛋白后，可以在有實(shí)驗(yàn)化合物存在下進(jìn)行體內(nèi)篩選測定，所述酵母細(xì)胞培養(yǎng)在含有尿嘧啶和5-FOA的培養(yǎng)基中。如果實(shí)驗(yàn)化合物不破壞APOA1和PRA1之間的相互作用，則表達(dá)有活性的URA3基因產(chǎn)物即乳清香-5'-脫羧酶，它將5-FOA轉(zhuǎn)化成有毒的5-氟尿嘧啶。結(jié)果，酵母細(xì)胞不能生長。另一方面，當(dāng)實(shí)驗(yàn)化合物破壞ap0a1和pra1之間的相互作用時(shí)，不在宿主酵母細(xì)胞中生成有活性的乳清苷-5'-脫羧酶。結(jié)果，酵母細(xì)胞將存活，并在含有5-FOA的培養(yǎng)基上生長。因此，基于菌落形成，可以這樣鑒別能干擾或解離APOA1和PRA1之間的相互作用的化合物。如將是顯而易見的，本發(fā)明的篩選測定可以以適合大規(guī)模篩選的格式應(yīng)用。例如，可以使用組合技術(shù)來構(gòu)建小有機(jī)分子或小肽的組合庫。通常參見，例如，Kenan等人，7Vem^Aoc/zew.19:57-64(1994);Gallop等人，丄M^/.C7ze肌，37:1233-1251(1994);Gordon等人，丄7kfedC/zew.，37:1385-1401(1994);Ecker等人，^Wec/mo/ogy，13:351-360(1995)。這樣的化合物組合庫可以應(yīng)用于本發(fā)明的篩選測定中，以分離特定蛋白-蛋白相互用的特異性調(diào)節(jié)劑。在隨機(jī)肽庫的情況下，隨機(jī)肽可以在宿主細(xì)胞中與本發(fā)明的融合蛋白共表達(dá)，并體內(nèi)測定。參見例如，Yang等人，M/c/.爿c/A"e&，23:1152-1156(1995)。或者，可以將它們加入培養(yǎng)基，用于由宿主細(xì)胞攝入。方便地，在體內(nèi)篩選測定中使用酵母交配。例如，使表達(dá)一種上迷融合蛋白的a-交配型的單倍體細(xì)胞與表達(dá)其它融合蛋白的a-交配型的單倍體細(xì)胞交配。交配后，將二倍體細(xì)胞涂布到合適的培養(yǎng)基上，以形成菌苔?？梢詫?shí)驗(yàn)化合物滴沉積在菌苔的不同區(qū)域上。培養(yǎng)菌苔適當(dāng)時(shí)間段后，通過滴附近生長的刺激或抑制，可以鑒別出含有能調(diào)節(jié)特定實(shí)驗(yàn)蛋白和融合蛋白之間的相互作用的化合物的滴。也可以通過各種技術(shù)來微調(diào)本發(fā)明的鑒別能調(diào)節(jié)蛋白-蛋白相互作用的化合物的篩選測定，以調(diào)節(jié)正選擇和負(fù)選擇的閾值或靈敏度?？梢詫⑼蛔儗?dǎo)入報(bào)道蛋白，以調(diào)節(jié)它們的活性。也可以調(diào)節(jié)宿主細(xì)胞對實(shí)驗(yàn)化合物的攝入。例如，酵母高攝入突變體例如erg6突變型菌抹，可以促進(jìn)酵母的實(shí)驗(yàn)化合物攝入。參見Gaber等人，Mo/.Ce//.5,》/.,9:3447-3456(1989)。同樣，也可以微調(diào)選擇化合物的攝入，例如5-FOA、2-脫氧半乳糖、環(huán)己酰亞胺、a-氨基己二酸等。通常，進(jìn)行對照測定，其中在沒有實(shí)驗(yàn)化合物存在下進(jìn)行上述篩選測定。然后將該測定的結(jié)果與在有實(shí)驗(yàn)化合物存在下得到的結(jié)果相對比。在相互作用激動劑的篩選測定中，可以以上述相互作用拮抗劑相同的方式進(jìn)行測定，例外是，使用正選擇標(biāo)記。將CaM或其活性片段或衍生物和TRPM8其或活性片段或衍生物用作以上述融合蛋白形式表達(dá)的實(shí)驗(yàn)蛋白，用于雙-雜交測定目的。在宿主細(xì)胞中表達(dá)融合蛋白，并在有一種或多種實(shí)驗(yàn)化合物存在下使它們彼此相互作用。編碼正選擇標(biāo)記如p-半乳糖苦酶的基因可以用作報(bào)道基因，以便當(dāng)實(shí)驗(yàn)化合物使得能實(shí)現(xiàn)、增強(qiáng)或強(qiáng)化第一種蛋白(或其同源物、片段或衍生物)或第一種蛋白的突變形式(或其同源物、片段或衍生物)與第二種蛋白(或其同源物、片段或衍生物)或笫二種蛋白的突變形式(或其同源物、片段或衍生物)之間的相互作用時(shí)，表達(dá)p-半乳糖苷酶。結(jié)果，基于當(dāng)在含有X-Gal的培養(yǎng)基中培養(yǎng)宿主細(xì)胞時(shí)藍(lán)色的出現(xiàn)，可以鑒別化合物。通常，進(jìn)行對照測定，其中在沒有實(shí)-驗(yàn)化合物存在下進(jìn)行上述篩選測定。然后將該測定的結(jié)果與在有實(shí)驗(yàn)化合物存在下得到的結(jié)果相對比。一旦選擇出能調(diào)節(jié)蛋白復(fù)合物中CaM和TRPM8之間的相互作用的實(shí)-瞼化合物，就在笫二個(gè)測定中測試該實(shí)-驗(yàn)化合物，以證實(shí)它的特異性和效果。示例性的第二個(gè)測定是基于細(xì)胞的測定或基于動物的測定。在一個(gè)實(shí)施方案中，還可以評價(jià)實(shí)駘、化合物增加或降4氐TRPM8通道的離子傳導(dǎo)性的能力。本領(lǐng)域技術(shù)人員已知測量TRPM8通道傳導(dǎo)性的方法，例如，通過細(xì)胞去極化的刺激或細(xì)胞內(nèi)鈣離子水平的增加。使用4丐離子-敏感的熒光指示劑，例如4丐離子-敏感的熒光染料，可以評估細(xì)胞內(nèi)銬的水平。合適的鈣離子-敏感的熒光染料包括，例如，quin-2(參見，例如，Tsien等人，JCellBioL,94:325,1982)、fura國2(參見，例如，Grynkiewicz等人，JBioLChem.，260:3440,1985)、fluo國3(參見，例如，Kao等人，JBioL-43Chem.,264:8179,1989)和rhod國2(參見，例如，Tsien等人，JBiol.Chem.,Abstract89a,1987)。合適的鈣離子-敏感的熒光染料可從例如MolecularProbes(Eugene,OR)商業(yè)上得到。也可以4吏用熒光計(jì)或具有熒光燈和檢測器的流式細(xì)胞儀來監(jiān)控細(xì)胞熒光。TRPM8陽離子通道的功能是，不僅運(yùn)輸二價(jià)陽離子，例如，Ca++,而且運(yùn)輸單價(jià)陽離子，例如，Na+或K+。因此，也可以進(jìn)行測定單價(jià)陽離子的運(yùn)輸?shù)淖兓臏y定，以測量TRPM8通道的傳導(dǎo)性。Na+4口K+-敏感的染料是本領(lǐng)域已知的，且可從例如MolecularProbes(Eugene,OR)商業(yè)上得到。通過電生理學(xué)技術(shù)例如膜片鉗，也可以測量TRPM8通道的傳導(dǎo)性。膜片鉗技術(shù)常規(guī)地用于研究細(xì)胞、細(xì)胞膜和分離的組織中的電活性。它包含在微量移液管和質(zhì)膜之間形成電緊密的、高電阻的密封。然后可以測量流過質(zhì)膜內(nèi)的個(gè)別離子通道的電流。該技術(shù)的不同變形允許將質(zhì)膜的不同表面暴露于沐浴介質(zhì)中。4種最常見的變形包括細(xì)胞-上的膜片(on-cellpatch)、內(nèi)面向外式膜片、外面向外式膜片、和全細(xì)胞鉗。膜片鉗方法常與電壓鉗一起使用，所述電壓鉗控制跨膜的電壓并測量電流流動。在電壓鉗方法過程中，將微電極插入細(xì)胞中，且通過該電極注入電流，以便將細(xì)胞膜電勢維持在某個(gè)預(yù)定的水平。膜片鉗方法也可以與電流-鉗方法一起^吏用，其中控制電流，并測量電壓。在另一個(gè)實(shí)施方案中，可以通過施用給活動物來進(jìn)一步評價(jià)實(shí)騶、化合物。這可以用于確立對于確立給藥方案重要的毒性和其它藥理學(xué)參數(shù)。例如，可以將化合物施用給狗，以檢查化合物在狗中的各種藥理學(xué)方面。狗試驗(yàn)對于鑒別和確立在人類中的給藥方案是特別有益的，因?yàn)榕c大鼠或小鼠相比，狗、尤其大品種的重量與人類更接近，且因此為估計(jì)人類給藥提供了更合適的動物模型。也可以將化合物施用給動物，來評估化合物改變傷害性過程的能力。存在各種疼痛動物模型，例如，神經(jīng)損傷的脊神經(jīng)結(jié)扎(SNL)模型，它是由Kim和Chung開發(fā)的大鼠神經(jīng)病疼痛模型(Pain,50:355-363,1992)。其它合適的疼痛動物模型可以與本文的教導(dǎo)結(jié)合使用。經(jīng)常研究的神經(jīng)病疼痛的嚙齒類動物模型包括慢性縮窄性損傷(CCI)或Bennett模型；神經(jīng)瘤或軸索顯微外科術(shù)(axotomy)模型；和部分坐骨神經(jīng)橫斷或Seltzer模型(Shir等人，A^wms"115:62-67,1990)。示例性神經(jīng)病疼痛模型包括幾種外傷性神經(jīng)損傷制劑(Bennett爭乂，尸W"33:87-107,1988;Decosterd爭乂，尸Ww87:149-58,2000;Kim爭乂，尸w"50:355-363,1992;Shir爭人，iVewos".15:62-7,1990),神經(jīng)炎癥片莫型(Chacur爭乂，尸m力94:231-44,2001;Milligan爭乂，5razw861:105-16,2000)、糖尿病性神經(jīng)病(Calcutt爭入，5r/尸/wwwco/122:1478-82,1997)、病毒誘發(fā)的神經(jīng)病(Fleetwood-Walker爭乂，/Ge"Kz>o/80:2433-6,1999)、長春新石咸神經(jīng)病(Aley爭人，iVewmsc&"ce73:259-65,1996;Nozaki-Taguchi爭乂，尸w"93:69-76,2001)和紫杉醇神經(jīng)病(Cavaletti爭乂，ExpA^/ra/133:64-72,1995),以及急性傷害性實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ秃脱装Y才莫型(Brennan,T丄等人尸a&64:493,1996;D,Amour,F.E.和Smith,D丄，J尸/^rwaco/72:74-79,1941;Eddy,N.B.等人/尸tonw"co/~77^98:121,1950;Haffner,F.D加/z她d阪/ze彥/^55:731,1929;Hargreaves,K.等人尸a/w32:77-88,1988;Hunskaar,S.等人/7Vewms"她A14:69,1985;Randall,L.O.和Selitto,J.J.Ac/z.M尸/^r應(yīng)co—111:409-419,1957;Siegmund,E.等人SocExpS/oM^/95:729,1957)。另夕卜，一旦選擇出能調(diào)節(jié)蛋白復(fù)合物中CaM和TRPM8之間的相互作用的實(shí)驗(yàn)化合物，就可以生成數(shù)據(jù)集合，其包含定義實(shí)驗(yàn)化合物的鑒別或特征的數(shù)據(jù)。所述數(shù)據(jù)集合可以包含與選擇的實(shí)驗(yàn)化合物的性質(zhì)相關(guān)的信息，所述性質(zhì)例如化學(xué)結(jié)構(gòu)、手性、分子量、熔點(diǎn)等?；蛘撸鰯?shù)據(jù)集合可以簡單地包含指定的鑒別號碼，后者能被進(jìn)行篩選測定的研究人員和/或接受數(shù)據(jù)集合作為代表特定實(shí)驗(yàn)化合物的研究人員所理解。所述數(shù)據(jù)或信息可以以可交流或傳遞給其它研究人員(尤其不同國家的研究人員)的可傳遞形式進(jìn)行安排。這樣的可傳遞形式可以變化，且可以是有形的或無形的。例如，可以將定義一種或多種選擇的實(shí)騶、化合物的數(shù)據(jù)集合具體化成文本、表格、圖表、分子結(jié)構(gòu)、照片、圖、圖像或任何其它可視形式。所述數(shù)據(jù)或信息可以記錄在有形介質(zhì)如紙上，或具體化成計(jì)算機(jī)可讀形式(例如，電子、電磁、光或其它信號)。計(jì)算機(jī)可讀形式的數(shù)據(jù)可以儲存在計(jì)算機(jī)用儲存介質(zhì)(例如，軟盤、磁帶、光盤等)中或通過通信基礎(chǔ)結(jié)構(gòu)直接傳遞。具體地，以電子信號具體化的數(shù)據(jù)可以以email形式傳遞，或發(fā)送到因特網(wǎng)或內(nèi)部網(wǎng)的網(wǎng)站上。另外，也可以將選擇的實(shí)驗(yàn)化合物的信息或數(shù)據(jù)記錄成聲頻形式，并通過電話、傳真、無線移動電話、因特網(wǎng)電話等，通過任何合適的介質(zhì)(例如，模擬或數(shù)字纜線，光導(dǎo)纖維電纜等)傳遞。面討論的虛擬篩選選擇的實(shí)驗(yàn)化合物的信息和數(shù)據(jù)，并傳遞到不同位置。例如，當(dāng)在國外進(jìn)行篩選測定時(shí)，可以產(chǎn)生關(guān)于選擇的實(shí)驗(yàn)化合物的信息和數(shù)據(jù)，并以上述可傳遞形式進(jìn)行安排。從而可以將可傳遞形式的數(shù)據(jù)和信息輸入美國或傳遞到任何其它國家，在這些地方可以將所述數(shù)據(jù)和信息用于進(jìn)一步測試選擇的實(shí)驗(yàn)化合物和/或改性和最優(yōu)化選擇的實(shí)驗(yàn)化合物，以開發(fā)用于在臨床試驗(yàn)中測試的先導(dǎo)化合物。也可以基于粑蛋白或蛋白復(fù)合物和/或?qū)嶒?yàn)化合物的結(jié)構(gòu)模型，選擇化合物。另夕卜，一旦鑒別出有效的化合物，就可以基于合理的藥物設(shè)計(jì)，生產(chǎn)它們的結(jié)構(gòu)類似物或模擬物，其目的是提高藥物攻效和穩(wěn)定性，和降低副作用。本領(lǐng)域已知的合理藥物設(shè)計(jì)的方法可以用于本發(fā)明中。參見，例如，Hodgson等人，Ao/7^c/mo/ogy，9:19-21(1991);美國專利號5,800,998和5,891,628,它們都在本文中引作參考。在這方面，得到關(guān)于靶蛋白或蛋白復(fù)合物的結(jié)構(gòu)信息。優(yōu)選地，可以得到定義蛋白復(fù)合物的三維結(jié)構(gòu)的原子座標(biāo)。例如，使用各種生物物理學(xué)技術(shù)，包括，例如，X-射線晶體學(xué)、NMR、計(jì)算機(jī)建沖莫、質(zhì)譜分析法等，可以研究相互作用的TRPM8-CaM復(fù)合物。同樣地，也可以從由相互作用蛋白和啟動或穩(wěn)定該蛋白的相互作用的化合物形成的蛋白復(fù)合物獲得結(jié)構(gòu)信息。通過X-射線晶體學(xué)、NMR等獲得這樣的原子座標(biāo)的方法是本領(lǐng)域已知的，且結(jié)構(gòu)生物學(xué)領(lǐng)域的技術(shù)人員應(yīng)明白它們在本發(fā)明的靶蛋白或蛋白復(fù)合物中的應(yīng)用。參見Smyth和Martin,Mo/.尸W/w/.:53:8-14(2000);Oakley和Wilce，尸/^rmaco/.尸/z;wo/.，27(3):145-151(2000);Ferentz和Wagner,Q.Aev.Ao/一&，33:29-65(2000);Hicks,Cwr.Met/.C/zew.,8(6):627-650(2001);牙口Roberts,Cz#r.5她c/mo/.,10:42-47(1999)。另外，使用酵母雙-雜交系統(tǒng)或檢測蛋白-蛋白相互作用的其它方法，通過誘變分析，也可以理解在有或沒有調(diào)節(jié)劑存在下蛋白復(fù)合物之間的相互作用。在這方面，可以將各種突變導(dǎo)入相互作用蛋白，并通過合適的方法例如酵母雙-雜交系統(tǒng)，檢查突變對蛋白-蛋白相互作用的作用。使用常規(guī)的重組DNA技術(shù)，可以將包括氨基酸置換、缺失和插入的各種突變導(dǎo)入蛋白序列。通常，特別需要破譯蛋白結(jié)合位點(diǎn)。因而，重要的是，導(dǎo)入的突變僅僅影響蛋白-蛋白相互作用，并造成最小的結(jié)構(gòu)紊亂。優(yōu)選地，基于相互作用蛋白的三維結(jié)構(gòu)的知識來設(shè)計(jì)突變。優(yōu)選地，導(dǎo)入突變來改變暴露于蛋白表面的帶電荷的氨基酸或疏水氨基酸，因?yàn)殡x子相互作用和疏水相互作用經(jīng)常參與蛋白-蛋白相互作用?；蛘?，使用"丙氨酸分區(qū)誘變法，，技術(shù)。參見Wells,等人，7WeAoA五w矽mo/.，202:301-306(1991);Bass等人，尸rac.iVa".Jcat/.S"V&4，88:4498-4502(1991);Bennet等人，J.Ao/.C/zem.,266:5191-5201(1991);Diamond等人，J.Kz>o/.，68:863-876(1994)。使用該技術(shù)，用丙氨酸替換相互作用蛋白的帶電荷的或疏水的氨基酸殘基，并使用例如酵母雙-雜交系統(tǒng)來分析對蛋白之間的相互作用的作用。例如，可以在5個(gè)氨基酸的窗口中掃描整個(gè)蛋白序列。當(dāng)2個(gè)或更多個(gè)帶電荷的或疏水的氨基酸出現(xiàn)在窗口中時(shí)，使用標(biāo)準(zhǔn)的重組DNA技術(shù)，將帶電荷的或疏水的氨基酸更換成丙氨酸。將這樣突變的蛋白用作上述雙-雜交測定中的"實(shí)驗(yàn)蛋白"，以檢查突變對蛋白-蛋白相互作用的作用。優(yōu)選地，在有和沒有鑒別的調(diào)節(jié)劑化合物存在下，進(jìn)行突變分析。以此方式，可以鑒別出對于蛋白-蛋白相互作用和/或調(diào)節(jié)劑化合物和相互作用蛋白之間的相互作用而言重要的蛋白的域或殘基?；诘玫降男畔?，闡明了相互作用蛋白之間以及鑒別的調(diào)節(jié)劑和相互作用蛋白之間的結(jié)構(gòu)關(guān)系。例如，對于鑒別的調(diào)節(jié)劑(即，先導(dǎo)化合物)，揭示了對于它們對相互作用蛋白的調(diào)節(jié)作用至關(guān)重要的三維結(jié)構(gòu)和化學(xué)部分。使用該信息和分子建模(即，模擬退火)領(lǐng)域已知的各種技術(shù)，醫(yī)學(xué)化學(xué)家然后可以設(shè)計(jì)出類似化合物，它們可能是本發(fā)明的蛋白-蛋白相互作用的更有效的調(diào)節(jié)劑。例如，所述類似化合物可能表現(xiàn)出與它們的靶的更特異性的或更緊密的結(jié)合，且從而可能表現(xiàn)出更少的副作用，或可能具有更需要的藥理學(xué)特征(例如，更高的溶解性)。另外，如果先導(dǎo)化合物是肽，也可以通過丙氨酸掃描技術(shù)和/或雙-雜交測定進(jìn)行分析，以確定對于它對特定蛋白-蛋白相互作用的調(diào)節(jié)作用而言重要肽域或殘基。肽化合物可以用作先導(dǎo)分子，用于合理地設(shè)計(jì)小有機(jī)分子或肽才莫擬物。參見Huber等人，Cwr.A/W.C/^m.，1:13-34(1994)。對于調(diào)節(jié)鑒別的化合物的作用而言關(guān)鍵的域、殘基或部分，構(gòu)成該化合物的活性區(qū)域，稱作它的"藥效團(tuán)"。一旦已闡明藥效團(tuán)，就可以通過建模過程確立結(jié)構(gòu)模型，所述建模過程可能整合來自NMR分析、X-射線衍射數(shù)據(jù)、丙氨酸掃描、光譜技術(shù)等的數(shù)據(jù)。包括計(jì)算分析(例如，分子建模和模擬退火)、相似性作圖等的各種技術(shù)，都可以用于該建模過牙呈。參見夯'J長口,Perry等人，見(9&4W..gwot"htodveS^w"w/^畫^4c/7vz'(y化/(2/7o朋/z—Z>wgDew'gw,pp.189-193,AlanR.Liss,Inc.,1989;Rotivinen等人，Jcfa^P/zarwacewdca/Feww/c",97:159-166(1988);Lewis等人，尸rac.A.Soc.Lorn/.,236:125-140(1989);McKinaly等人，J薩.Aev.尸/(377waco/.rox/c/o/.,29:111-122(1989)。可從PolygenCorporation,Waltham,Mass.商業(yè)得到的分子建模系統(tǒng)包括，CHARMm程序，它執(zhí)行能量最低化和分子動力學(xué)功能，和QUANTA程序，它執(zhí)行分子結(jié)構(gòu)的構(gòu)建、圖形建模和分析。這些程序允許分子的相互作用構(gòu)建、修飾和可視化。其它計(jì)算機(jī)建才莫程序也可以從BioDesign,Inc.(Pasadena,Calif.)、Hypercube,Inc.(Cambridge,Ontario)和Allelix,Inc.(Mississauga,Ontario,加拿大)得到。可以基于確立的模型形成模板。然后可以通過將各種化學(xué)基團(tuán)或部分連接到該模板上，設(shè)計(jì)各種化合物。也可以替換模板的各個(gè)部分。另外，在肽先導(dǎo)化合物的情況下，可以環(huán)化肽或其模擬物，例如，通過將N-末端和C-末端連接到一起，以增加它的穩(wěn)定性。進(jìn)一步測試這些合理設(shè)計(jì)的化合物。以該方式，可以開發(fā)出具有提高的功效和降低的副作用的藥理學(xué)上可接受的和穩(wěn)定的化合物。根據(jù)本發(fā)明鑒別的化合物可以摻入適合施用給個(gè)體的藥物制劑中。另外，也可以在虛擬篩選中使用定義粑蛋白或蛋白復(fù)合物的三維結(jié)構(gòu)的結(jié)構(gòu)模型或原子座標(biāo)，以選擇能調(diào)節(jié)靶蛋白或蛋白復(fù)合物的化合物。使用原子座標(biāo)的基于計(jì)算機(jī)的虛擬篩選的各種方法通常是本領(lǐng)域已知的。例如，美國專利號5,798,247(它在本文中引作參考)公開了通過測定有機(jī)化合物與靶蛋白內(nèi)的結(jié)合腔的結(jié)合位點(diǎn)之間的結(jié)合相互作用，鑒別化合物(具體地，白細(xì)胞介素轉(zhuǎn)變酶抑制劑)的方法。結(jié)合位點(diǎn)由原子座標(biāo)來定義?？梢詼y試基于合理的藥物設(shè)計(jì)或虛擬篩選而設(shè)計(jì)或選擇的化合物調(diào)節(jié)(干擾或強(qiáng)化)本發(fā)明的蛋白復(fù)合物內(nèi)相互作用配偶體之間的相互作用的能力。另外，可以在上述的TRPM8通道傳導(dǎo)性測定或動物才莫型中進(jìn)一步測試化合物。根據(jù)上述公開的方法選擇所需的化合物后，本發(fā)明的方法進(jìn)一步提供了選擇的化合物的生產(chǎn)?？梢陨a(chǎn)化合物用于其它實(shí)驗(yàn)研究，或用于治療用途。在本發(fā)明的篩選方法中鑒別出的化合物可以制成治療或預(yù)防上有效的藥物，用于預(yù)防或改善由CaM-TRPM8蛋白復(fù)合物或其相互作用成員造成的或與其有關(guān)的疾病、病癥或癥狀，例如疼痛、炎癥和皮膚實(shí)施例蛋白構(gòu)建和生產(chǎn)為了查明TRPM8上的CaM結(jié)合位點(diǎn)，將大鼠TRPM8cDNA的片段分別亞克隆進(jìn)pAGA3或pGEX-4TlN表達(dá)載體，用于通過體外翻譯"S-曱硫氨酸標(biāo)記蛋白，或用于在細(xì)菌中表達(dá)GST融合蛋白。這些亞克隆編碼各種大鼠TRPM8片段，它們具有一些重疊(參見表1)。表1.大鼠TRPM8構(gòu)建體和它們對4丐調(diào)蛋白的結(jié)合活性構(gòu)建體殘基長度蛋白大小(aaxl10)結(jié)合TRPM8-l/pAGA3:M1—K432432aa48kDa+TRPM8-2/pAGA3:M353-T690337aa37kDa-TRPM8"4/pAGA3:1609-K1104(末端)495aa54kDa-TRPM8-6/pAGA3:M63-S352289aa32kDa+TRPM8-7/pAGA3:V145-S352207aa23kDa+TRPM8-8/pAGA3:M219-S352133aa15kDa-TRPM8-9/pAGA3:A172-S352180aa20kDa-TRPM8-10/pAGA3:D198-S352154aa17kDa-TRPM8-11/pGEX4T-lN:V145-W21773aaGST融合體+TRPM8-12/pGEX4T-lN:V145-D19853肌GST融合體+通過常規(guī)限制酶切消化和連接技術(shù)，構(gòu)建了構(gòu)建體TRPM8-1/pAGA3和TRPM8-4/pAGA3。為了得到TRPM8-l/pAGA3，用HindIII消化攜帶全長大鼠TRPM8cDNA的TRPM8/pAGA3，以去除編碼大鼠TRPM8的羧基末端的cDNA片段。重新連接攜帶編碼大鼠TRPM8的氨基末端的cDNA片段的質(zhì)粒的剩余部分，以生成TRPM8-l/pAGA3。為了構(gòu)建TRPM8-4/pAGA3,在用EcoRV和Xbal消化TRPM8/pAGA3后，從TRPM8/pAGA3分離出編碼大鼠TRPM8的羧基末端的1.5kbDNA片段。隨后將該1.5kb片段在EcoRV和Xbal位點(diǎn)亞克隆進(jìn)pAGA3，以生成TRPM8-4/pAGA3。通過PCR擴(kuò)增大鼠TRPM8cDNA片段(表2),隨后亞克隆進(jìn)合適的表達(dá)載體中，構(gòu)建其它構(gòu)建體。PCR條件是30個(gè)下述循環(huán)，94°C30秒(變性)，55°C30秒(退火)，和使用AdvantageTM-HF2DNA聚合酶(Clontech)在72°C2分鐘(延伸)。在PCR引物中包含適宜的限制酶切消化位點(diǎn)，例如SalI或NcoI,以促進(jìn)隨后的亞克隆步驟(表3)。凝膠純化PCR擴(kuò)增的rTRPM8cDNA片段，用適宜的限制酶消化，并按照標(biāo)準(zhǔn)的分子克隆4支術(shù)，克隆進(jìn)pAGA3(對于rTRPM8-2和rTRPM8-6至rTRPM8-10)或pGEX-4T-lN(對于rTRPM8-ll和rTRPM8-12)表達(dá)載體。表2.rTRPM8cDNA片段和它們的PCR擴(kuò)增使用的引物<table>tableseeoriginaldocumentpage50</column></row><table>表3.PCR引物<table>tableseeoriginaldocumentpage51</column></row><table>按照銷售商推薦的規(guī)程，使用TnTT7Quick偶聯(lián)轉(zhuǎn)錄/翻譯(CoupledTranscription/Translation)系統(tǒng)(Promega),合成353-甲碌^氨酸標(biāo)記的TRPM8片段。簡而言之，將10pi0.1ng/^il基于pAGA3的TRPM8構(gòu)建體(表1所示)加入90pi含有2^["S]-曱硫氨酸(lOOOCi/mmmol,在10mCi/ml)的TNTQuick主混合物(MasterMix)中。將反應(yīng)混合物在30。C溫育90分鐘。將溫育混合物的等分試樣直接用于SDS/PAGE分析，以證實(shí)所需大小的蛋白的合成，或結(jié)合GST或GST-CaM的能力。GST-CaM融合質(zhì)?；趐GEX-4T-l(>4wera/^m尸/z"rmac^)。將CaM融合至GST的C-末端。轉(zhuǎn)化進(jìn)義應(yīng)^^"BL21后，挑取單個(gè)菌落，且在brow培養(yǎng)基中生長至在600nm的OD為1.0。用0.2111]^異丙基&-0-硫代半乳糖苷(IPTG)誘導(dǎo)融合蛋白的合成。在有IPTG存在下、在2TC生長2-3小時(shí)后，通過離心收集細(xì)胞，重新懸浮于NETN裂解緩沖液(0.5%NonidetP-40/lmMEDTA/20mMTris-HCl,pH8.0/100mMNaCl;1ml緩沖液/20ml培養(yǎng)物)，通過超聲處理裂解。通過在4°C、10,000g離心10分鐘，從細(xì)胞碎片分離細(xì)胞裂解物。在室溫，將細(xì)胞裂解物中的GST-CaM吸附到瓊脂糖-谷胱苷肽(GSH)珠(AmershamPharmacia)上30分鐘(l體積的裂解物/1體積的50。/。(體積/體積)瓊脂糖-GSH珠于NETN中的漿)。用結(jié)合緩沖液(20mMTris-HCl,pH7,5/100mMNaC1/2mMCaCl2/0.5%吐溫20)洗滌珠。類似于上面關(guān)于GST-CaM融合體所述的程序，將TRPM8片段TRPM8-11或TRPM8-12融合至GST的C-末端，并從轉(zhuǎn)化的義應(yīng)yf^"BL21表達(dá)和純^ft。蛋白-蛋白相互作用將結(jié)合了約1|ugGST或GST-CaM的瓊脂糖-GSH珠(50%(體積/體積))與10|ul"S-標(biāo)記的TRPM8片段在室溫、在終體積為200|ul的結(jié)合緩沖液中溫育30分鐘。在溫育結(jié)束時(shí)，用1.0ml結(jié)合緩沖液洗滌珠3次，并重新懸浮于202xlaemmli樣品裝載緩沖液。通過SDS/PAGE分離結(jié)合到珠上的蛋白，包括GST-CaM融合蛋白，和可能與GST-CaM融合蛋白相互作用的"S-標(biāo)記的TRPM8片段，隨后放射自顯影。如圖1所示，發(fā)現(xiàn)由大鼠TRPM8的N-末端432個(gè)氨基酸殘基組成的TRPM8-1片段結(jié)合CaM，但是TRPM8-2和TRPM8-4片l殳不結(jié)合。進(jìn)一步測試了更小的含有N-末端432個(gè)氨基酸殘基的TRPM8片段結(jié)合CaM的能力。如圖2所示，發(fā)現(xiàn)TRPM8-6、TRPM8-7、TRPM8-11和TRPM8-12結(jié)合CaM?；谶@些結(jié)果，CaM相互作用域可能存在于TRPM8-12中，后者具有SEQIDNO:9的氨基酸序列。權(quán)利要求1.分離的多肽復(fù)合物，其包含1)TRPM8或TRPM8的活性片段或衍生物，它與2)鈣調(diào)蛋白或鈣調(diào)蛋白的活性片段或衍生物相互作用。2.權(quán)利要求1的多肽復(fù)合物，其中所述TRPM8與分離的膜結(jié)合。3.權(quán)利要求1的多肽復(fù)合物，其中所述TRPM8或所述TRPM8的活性片段或衍生物包含SEQIDNO:9的氨基酸序列。4.權(quán)利要求1的多肽復(fù)合物，其中所述TRPM8包含SEQIDNO:2、SEQIDNO:3、或SEQIDNO:4的氨基酸序列。5.權(quán)利要求1的多肽復(fù)合物，其中所述TRPM8的活性片段或衍生物基本上由SEQIDNO:5、SEQIDNO:6、或SEQIDNO:7、SEQIDNO:8或SEQIDNO:9的氨基酸序列組成。6.權(quán)利要求1的多肽復(fù)合物，其中所述鈣調(diào)蛋白包含SEQIDNO:1的氨基酸序列。7.生產(chǎn)多肽復(fù)合物的方法，其包含下述步驟a.在允許形成多肽復(fù)合物的條件下，使1)TRPM8或TRPM8的活性片段或衍生物接觸2)鈣調(diào)蛋白或釣調(diào)蛋白的活性片段或衍生物，所述多肽復(fù)合物包含與2)的蛋白相互作用的l)的蛋白，其中1)和2)的蛋白中的至少一種是分離形式或;f皮重組表達(dá)；和b.分離該多肽復(fù)合物。8.權(quán)利要求7的方法，其中所述TRPM8與分離的細(xì)胞膜結(jié)合。9.權(quán)利要求7的方法，其中所述TRPM8或TRPM8的活性片段或衍生物存在于細(xì)月包中。10.權(quán)利要求9的方法，其中所述細(xì)胞是培養(yǎng)的神經(jīng)元。11.權(quán)利要求9的方法，其中所述細(xì)胞重組表達(dá)TRPM8或TRPM8的活性片段或衍生物。12.權(quán)利要求11的方法，其中所述細(xì)胞包含具有編碼SEQIDNO:9的氨基酸序列的核苷酸序列的表達(dá)載體。13.權(quán)利要求7的方法，其中所述TRPM8或TRPM8的活性片段或衍生物是分離的形式。14.權(quán)利要求13的方法，其中所述TRPM8或TRPM8的活性片段或衍生物包含SEQIDNO:9的氨基酸序列。15.權(quán)利要求7的方法，其中所述鈣調(diào)蛋白是分離的形式。16.權(quán)利要求7的方法，其中所述鈣調(diào)蛋白存在于細(xì)胞中。17.權(quán)利要求16的方法，其中所述細(xì)胞重組表達(dá)鈣調(diào)蛋白。18.權(quán)利要求17的方法，其中所述細(xì)胞包含具有編碼SEQIDNO:1的氨基酸序列的核苷酸序列的表達(dá)載體。19.鑒別TRPM8-鉤調(diào)蛋白多肽復(fù)合物的調(diào)節(jié)劑的方法，其包含下述步驟a.在允許形成多肽復(fù)合物的條件下，4吏1)TRPM8或TRPM8的活性片段或衍生物接觸2)鈣調(diào)蛋白或釣調(diào)蛋白的活性片段或衍生物，所述多肽復(fù)合物包含與2)的蛋白相互作用的l)的蛋白；b.使實(shí)驗(yàn)化合物接觸1)和2)的蛋白中的至少一種；測定形成的多肽復(fù)合物內(nèi)l)的蛋白和2)的蛋白之間的相互作c.用d.重復(fù)步驟a)和c);e.對比從步驟b)檢測到的蛋白-蛋白相互作用和從步驟d)檢測到的相互作用。20.權(quán)利要求19的方法，其中步驟a)在步驟b)之前進(jìn)行。21.權(quán)利要求19的方法，其中步驟a)在步驟b)之后進(jìn)行。22.權(quán)利要求19的方法，其中步驟a)和b)同時(shí)進(jìn)行。23.權(quán)利要求19的方法，其中所述TRPM8與分離的膜結(jié)合。24.權(quán)利要求19的方法，其中所述TRPM8或TRPM8的活性片殺:或衍生物存在于細(xì)胞中。25.權(quán)利要求19的方法，其中所述TRPM8或TRPM8的活性片段或衍生物是分離的形式。26.權(quán)利要求19的方法，其中所述TRPM8或所述TRPM8的活性片段或衍生物包含SEQIDNO:9的氨基酸序列。27.權(quán)利要求19的方法，其中所述TRPM8的活性片段或衍生物基本上由SEQIDNO:5、SEQIDNO:6、或SEQIDNO:7、SEQIDNO:8或SEQIDNO:9的氨基酸序列組成。28.權(quán)利要求19的方法，其中所述TRPM8包含SEQIDNO:2、SEQIDNO:3、或SEQIDNO:4的氨基酸序列。29.權(quán)利要求19的方法，其中所述4丐調(diào)蛋白包含SEQIDNO:1的氨基酸序列。30.權(quán)利要求19的方法，其中所述鈣調(diào)蛋白存在于細(xì)胞中。31.權(quán)利要求19的方法，其中所述鈣調(diào)蛋白是分離的形式。32.權(quán)利要求19的方法，其中使用酵母雙-雜交系統(tǒng)或其類似系統(tǒng)，測定形成的多肽復(fù)合物內(nèi)1)的蛋白和2)的蛋白之間的相互作用。33.權(quán)利要求19的方法，其中使用焚光偏振測定，測定形成的多肽復(fù)合物內(nèi)1)的蛋白和2)的蛋白之間的相互作用。34.權(quán)利要求19的方法，其中使用熒光共振能量轉(zhuǎn)移測定，測定形成的多肽復(fù)合物內(nèi)l)的蛋白和2)的蛋白之間的相互作用。35.養(yǎng)別用于治療疼痛的化合物的方法，其包含鑒別TRPM8-鈣調(diào)蛋白多肽復(fù)合物的調(diào)節(jié)劑的步驟。36.權(quán)利要求35的方法，還包含下述步驟a.使鑒別的調(diào)節(jié)劑接觸TRPM8;和b.測定鑒別的調(diào)節(jié)劑改變TRPM8的通道傳導(dǎo)性的程度。37.權(quán)利要求35的方法，還包含下迷步驟a.給動物施用鑒別的調(diào)節(jié)劑；和b.測定該調(diào)節(jié)劑改變動物的傷害性響應(yīng)的程度。38.減少受試者的疼痛的方法，其包含給受試者施用有效量的化合物的步驟，所迷化合物是TRPM8-鈣調(diào)蛋白多肽復(fù)合物的調(diào)節(jié)劑。39.TRPM8的分離的活性片段，其包含SEQIDNO:9的氨基酸序列，前提是，該活性片段不是全長CMR1。40.權(quán)利要求39的TRPM8的分離的活性片段，其基本上由SEQIDNO:5、SEQIDNO:6、SEQIDNO:7、SEQIDNO:8或SEQIDNO:9的氨基酸序列組成。41.編碼TRPM8的活性片段的分離的核酸分子，所述活性片段包含SEQIDNO:3的氨基酸序列，前提是，所述活性片段不是全長CMRl。42.權(quán)利要求41的分離的核酸分子，它編碼基本上由SEQIDNO.5、SEQIDNO:6、SEQIDNO:7、SEQIDNO:8或SEQIDNO:9的氨基酸序列組成的TRPM8的活性片段。43.包含編碼TRPM8的活性片段的核香酸序列的表達(dá)載體，所述活性片段包含SEQIDNO:3的氨基酸序列，前提是，所述活性片段不是全長CMR1。44.重組宿主細(xì)胞，其包含權(quán)利要求44的表達(dá)載體。45.生產(chǎn)TRPM8的活性片段的方法，其包含下述步驟在重組表達(dá)TRPM8的活性片段的條件下，培養(yǎng)權(quán)利要求45的重組細(xì)胞。全文摘要本發(fā)明發(fā)現(xiàn)，哺乳動物TRPM8會結(jié)合鈣調(diào)蛋白。本發(fā)明提供了一種多肽復(fù)合物，其包含冷-薄荷醇受體(TRPM8)或TRPM8的活性片段或衍生物和鈣調(diào)蛋白或鈣調(diào)蛋白的活性片段或衍生物，和該多肽復(fù)合物的用途。文檔編號C07K14/435GK101351473SQ200680049566公開日2009年1月21日申請日期2006年10月31日優(yōu)先權(quán)日2005年10月31日發(fā)明者C·M·弗洛爾斯,N·泰申請人:詹森藥業(yè)有限公司