一種雞胚蛋卵黃高磷蛋白磷酸肽的提取方法
【專利摘要】一種雞胚蛋卵黃高磷蛋白磷酸肽的提取方法，屬于食品添加劑【技術(shù)領(lǐng)域】。本發(fā)明通過收集孵化至一定天數(shù)的雞胚蛋，經(jīng)組織勻漿、離心沉淀、脫脂過濾等手段提取卵黃高磷蛋白，之后在超高壓輔助條件下對(duì)其進(jìn)行水解，隨后通過超濾得到小分子組分，對(duì)產(chǎn)物進(jìn)行干燥處理，得到磷酸肽產(chǎn)品。該方法相比從普通雞蛋中制備磷酸肽的傳統(tǒng)工藝而言，充分利用了雞胚蛋內(nèi)源酶對(duì)卵黃高磷蛋白的酶解與脫磷，從而省去了人工脫磷等步驟，大大縮短工藝時(shí)間，節(jié)省成本。所得磷酸肽產(chǎn)品具有促進(jìn)礦物質(zhì)吸收的功效，可以作為新型功能食品進(jìn)行開發(fā)，或作為一種天然的促進(jìn)礦物質(zhì)吸收的食品添加劑加入到功能性食品當(dāng)中。
【專利說明】一種雞胚蛋卵黃高磷蛋白磷酸肽的提取方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種雞胚蛋卵黃高磷蛋白磷酸肽的提取方法，特別涉及一種利用雞胚蛋內(nèi)源酶對(duì)卵黃高磷蛋白進(jìn)行部分脫磷，再通過外源蛋白酶酶解得到的，具有促進(jìn)礦物質(zhì)吸收作用的磷酸肽的提取方法，屬于食品添加劑【技術(shù)領(lǐng)域】。
【背景技術(shù)】
[0002]近年來，生物活性肽成為保健品行業(yè)研究和開發(fā)的熱點(diǎn)，日本以及歐美國(guó)家目前已推出各種含有活性肽的功能性食品及食品添加劑。這種新型功能性食品有助于減少和控制與飲食有關(guān)的慢性疾病，成為一種具有極大商業(yè)前景的產(chǎn)業(yè)。
[0003]磷酸肽是被研究和開發(fā)最早的一種功能肽，因其含有大量的磷酸絲氨酸基團(tuán)，因此能與Ca2+、Fe2+等礦物質(zhì)離子在小腸弱堿性環(huán)境中形成可溶性絡(luò)合物，具有促進(jìn)礦物質(zhì)吸收的生理活性，從而可以促進(jìn)兒童骨骼和牙齒的發(fā)育，預(yù)防和改善中老年人骨質(zhì)疏松癥，促進(jìn)骨折患者的康復(fù)，預(yù)防和改善缺鐵性貧血，抗齲齒等多種功能。目前在國(guó)內(nèi)食品行業(yè)，應(yīng)用最廣泛的是酪蛋白磷酸肽(CPP)。石家莊維平功能食品科技有限公司研制出了添加有CPP的富鈣富鐵的梨汁；山東中德啤酒有限公司研制出添加CPP的多肽啤酒；伊利乳業(yè)、圣元乳業(yè)、龍丹乳業(yè)等都有添加CPP的乳制品面世；恒壽堂研發(fā)的金乳鈣中也添加有CPP。[0004]相比酪蛋白，雞蛋中的卵黃高磷蛋白含有更多的磷酸絲氨酸基團(tuán)(50%左右)，是自然界中磷酸化程度最高的一種蛋白質(zhì)。因而相比酪蛋白，卵黃高磷蛋白被認(rèn)為是一種新型的、更具有開發(fā)潛力的磷酸肽來源。自2000年以來，加拿大的Mine教授、江南大學(xué)的江波教授等團(tuán)隊(duì)對(duì)卵黃高磷蛋白磷酸肽(PPP)促進(jìn)礦物質(zhì)吸收的生理功效進(jìn)行了廣泛研究，本發(fā)明也對(duì)PPP的抗氧化活性進(jìn)行了深入研究。結(jié)果表面，PPP可以有效促進(jìn)礦物質(zhì)離子吸收，并具有較高的抗氧化活性。另一方面，由于卵黃高磷蛋白中磷酸基團(tuán)過多，反而降低其對(duì)蛋白酶的敏感度，導(dǎo)致磷酸肽的得率較低。為了克服這一缺點(diǎn)，在實(shí)際生產(chǎn)中，往往需要首先利用堿法對(duì)卵黃高磷蛋白進(jìn)行部分脫磷，以增加其對(duì)蛋白酶的敏感度。這一步驟雖然可以提高卵黃高磷蛋白的水解度，但同時(shí)也增加了工藝步驟與生產(chǎn)成本。
[0005]雞胚蛋是指受精雞蛋孵化至一定天數(shù)尚未破殼，可食用的雞蛋。在雞蛋蛋黃中，80%的磷與95%的鐵集中在卵黃高磷蛋白中。據(jù)Romano等人(2004)研究發(fā)現(xiàn)，在雞胚蛋孵化期間，卵黃高磷蛋白會(huì)隨著孵化時(shí)間的增長(zhǎng)而逐步降解，為雞胚發(fā)育提供營(yíng)養(yǎng)與能量?？上攵?，在雞胚蛋孵化期間，該蛋白的構(gòu)象與磷酸基團(tuán)含量可能發(fā)生變化，以利于胚胎對(duì)其吸收利用；另一方面，一些內(nèi)源性蛋白酶被激活，對(duì)該蛋白進(jìn)行部分脫磷或水解作用，有利于磷酸肽的釋放。同時(shí)，超高壓可以改變蛋白構(gòu)象，提高酶對(duì)底物的催化活性，是一種提高蛋白水解度的常用手段。目前關(guān)于這方面的研究，還未見相關(guān)報(bào)道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]本發(fā)明的目的是提供一種從雞胚蛋中制備磷酸肽的方法，相比傳統(tǒng)從普通雞蛋中制備磷酸肽的方法，本發(fā)明涉及的方法省去了對(duì)卵黃高磷蛋白堿法脫磷的步驟，從而簡(jiǎn)化工藝、節(jié)省成本。同時(shí)，本發(fā)明包括了全部的工藝步驟和最佳工藝條件，并對(duì)最終產(chǎn)品的促進(jìn)礦物質(zhì)吸收能力進(jìn)行了檢驗(yàn)。對(duì)實(shí)際生產(chǎn)具有顯著的指導(dǎo)意義。
[0007]本發(fā)明的技術(shù)方案，一種雞胚蛋卵黃高磷蛋白磷酸肽的提取方法，步驟如下:
(O受精雞蛋孵化:精選無損健康的受精雞蛋，放入孵化箱內(nèi)進(jìn)行孵化；待孵化12-15天，取出雞胚蛋，放入低溫環(huán)境中結(jié)束其生命并保存，以備加工用；
(2)提取卵黃高磷蛋白:對(duì)步驟(1)所得雞胚蛋表面進(jìn)行消毒，去除蛋殼取出雞胚胎，將雞胚胎用組織勻漿機(jī)粉碎，并用無菌水稀釋，調(diào)節(jié)PH 3飛，且充分?jǐn)嚢璧脛驖{液；之后將勻漿液在3000g條件下離心20min，收集沉淀物，用正己烷和乙醇按3: I的體積比混合后形成的混合液充分脫脂，并過濾；將過濾得到的截留物用NaCl溶液(1-2 M)充分溶解，隨后在60°C條件下保持IOmin以去除熱不穩(wěn)定蛋白，之后再次在3000g條件下離心20min,收集上層清液，即得到卵黃高磷蛋白；
(3)酶解卵黃高磷蛋白:將步驟(2)得到的卵黃高磷蛋白用蛋白酶在最適pH條件下進(jìn)行水解，超高壓輔助處理?xiàng)l件為10(Tl50MPa，溫度40~43°C，時(shí)間l(Tl5min ;之后用5 kDa超濾膜在4°C條件下進(jìn)行超濾，收集超濾得到小分子組分；
(4)后處理:將步驟(3)所得超濾組分用冷凍干燥機(jī)進(jìn)行冷凍干燥，冷凍干燥壓強(qiáng)參數(shù)為2(T25pa，溫度為-35'30°C，收集冷凍后所得產(chǎn)物，即得雞胚蛋卵黃高磷蛋白磷酸肽。
[0008]步驟(3)所述水解用蛋白酶為胰蛋白酶、胃蛋白酶、醇酶、木瓜蛋白酶、堿性蛋白酶、中性蛋白酶中的一種或幾種的復(fù)合酶。
[0009]本發(fā)明的有益效果:
1、相比于現(xiàn)有從普通雞蛋中制備卵黃高磷蛋白磷酸肽的技術(shù)手段，本發(fā)明省去了對(duì)卵黃高磷蛋白堿法脫磷的步驟，簡(jiǎn)化了生產(chǎn)工藝，節(jié)約了成本；
2、相比于傳統(tǒng)的酪蛋白磷酸肽(CPP)，雞胚來源的卵黃高磷蛋白磷酸肽(PPP)具有更高的促進(jìn)礦物質(zhì)吸收的生理活性；
3、本發(fā)明方法制備得到的卵黃高磷蛋白磷酸肽，不僅具有促進(jìn)礦物質(zhì)吸收的活性，而且具有抗氧化性，可作為多功能肽開發(fā)為功能性食品或食品添加劑。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0010]圖1是不同濃度磷酸肽促進(jìn)鈣吸收的結(jié)果。CPP為酪蛋白磷酸肽，PPP為雞胚蛋卵黃高磷蛋白磷酸肽，DPP為普通雞蛋卵黃蛋白磷酸肽，下同。
[0011]圖2是不同濃度磷酸肽促進(jìn)鐵吸收的結(jié)果。
[0012]圖3是不同磷酸肽抑制亞油酸氧化的結(jié)果?？瞻诪椴患恿姿犭牡脑嚇印?br> [0013]圖4是本發(fā)明工藝流程圖。
【具體實(shí)施方式】
[0014]實(shí)施例1
如圖4所示，一種雞胚蛋卵黃的高磷蛋白磷酸肽的提取方法，步驟如下:
(O受精雞蛋孵化:精選無損健康的受精雞蛋，放入孵化箱內(nèi)進(jìn)行孵化；待孵化12-15天，取出雞胚蛋，放入低溫環(huán)境中結(jié)束其生命并保存，以備加工用；
(2)提取卵黃高磷蛋白:對(duì)雞胚蛋表面進(jìn)行消毒，去除蛋殼取出雞胚胎，將雞胚胎用組織勻漿機(jī)粉碎，并用無菌水稀釋，調(diào)節(jié)PH 3飛，且充分?jǐn)嚢?；之后將勻漿液在3000g條件下離心20min，收集沉淀物，用正己烷和乙醇按3: I的體積比混合后形成的混合液充分脫脂，并過濾；將過濾得到的截留物用NaCl溶液(1.74 M)溶解，隨后在60°C條件下保持10 min以去除熱不穩(wěn)定蛋白，之后再次在3000g條件下離心20min，收集上層清液，即得到卵黃高憐蛋白；
(3)酶解卵黃高磷蛋白:將步驟(2)得到的卵黃高磷蛋白用蛋白酶進(jìn)行充分水解，同時(shí)用超高壓機(jī)(TFS-2L，Toyo Koatsu公司)予以輔助處理:壓力120 MPa，溫度42°C，時(shí)間12min。之后用5 kDa超濾膜在4°C條件下進(jìn)行超濾，收集得到小分子組分；
(4)后處理:用Lyph-Lock12 (Labconco公司)冷凍干燥機(jī)進(jìn)行冷凍干燥，冷凍干燥壓強(qiáng)參數(shù)為2(T25pa，溫度為-35'30°C，收集冷凍后所得產(chǎn)物，即得雞胚蛋卵黃高磷蛋白磷酸肽。
[0015]步驟(3)所述水解用蛋白酶為胰蛋白酶、胃蛋白酶、醇酶、木瓜蛋白酶、堿性蛋白酶、中性蛋白酶中的一種或幾種的復(fù)合酶。
[0016]實(shí)施例2
對(duì)所制備得到的磷酸肽進(jìn)行促鈣吸收、促鐵吸收、抑制亞油酸氧化的實(shí)驗(yàn)測(cè)定。具體實(shí)驗(yàn)方法如下:
促鈣吸收:不同濃度的磷酸肽溶液(O mg/L、200 mg/L、400 mg/L和600 mg/L)與5mMCaCl2和20mM、500mL磷酸鈉緩沖液(pH 8.0)充分混合。在20°C下反應(yīng)30 min，用NaOH滴定使PH維持在7.8，之后通過原子吸收色譜測(cè)定上清液中可溶性鈣含量。結(jié)果見附圖1。
[0017]促鐵吸收:不同濃度的磷酸肽溶液(O mg/L、200 mg/L、400 mg/L和600 mg/L)與5mM FeCl2和20禮、50011^磷酸鈉緩沖液(pH 8.0)充分混合。在20°C下反應(yīng)30 min，用NaOH滴定使PH維持在7.8，之后通過原子吸收色譜測(cè)定上清液中可溶性鐵含量。結(jié)果見附圖2。
[0018]抗氧化測(cè)定:將1.3mg的磷酸肽用磷酸鈉緩沖液(pH 7.0, 50mM、IOmL)溶解，之后加入0.13mL的亞油酸溶液(稀釋于IOmL的95%乙醇中)，并用無菌水定容至25mL，于40°C下暗處存放。每隔固定時(shí)間(24h)，取出100 μ L反應(yīng)液與4.7mL的乙醇溶液、100 μ L的硫氰酸銨溶液(30%質(zhì)量分?jǐn)?shù))、100 μ L的氯化亞鐵(20mM溶于3.5%的鹽酸)充分混合，靜置3min后在500nm波長(zhǎng)下測(cè)吸光度，吸光度越大說明氧化程度越高。結(jié)果見圖3。
[0019]從結(jié)果可以看出，相比傳統(tǒng)方法得到的磷酸肽，本發(fā)明方法得到的產(chǎn)品具有更高的促進(jìn)礦物質(zhì)吸收的能力，并且具有很高的抗氧化活性。因此，雞胚蛋來源卵黃高磷蛋白磷酸肽具有巨大的 商業(yè)前景，可以加工成為具有促進(jìn)礦物質(zhì)吸收的功能性食品，或者作為功能因子添加到功能性食品中。
【權(quán)利要求】
1.一種雞胚蛋卵黃高磷蛋白磷酸肽的提取方法，其特征在于步驟如下: (1)受精雞蛋孵化:精選無損健康的受精雞蛋，放入孵化箱內(nèi)進(jìn)行孵化；待孵化12-15天，取出雞胚蛋，放入低溫環(huán)境中結(jié)束其生命并保存，以備加工用； (2)提取卵黃高磷蛋白:對(duì)步驟(1)所得雞胚蛋表面進(jìn)行消毒，去除蛋殼取出雞胚胎，將雞胚胎用組織勻漿機(jī)粉碎，并用無菌水稀釋，調(diào)節(jié)PH 3飛，且充分?jǐn)嚢璧脛驖{液；之后將勻漿液在3000g條件下離心20min，收集沉淀物，用正己烷和乙醇按3: I的體積比混合后形成的混合液充分脫脂，并過濾；將過濾得到的截留物用1-2 M的NaCl溶液充分溶解，隨后在60°C條件下保持10 min以去除熱不穩(wěn)定蛋白，之后再次在3000g條件下離心20min,收集上層清液，即得到卵黃高磷蛋白； (3)酶解卵黃高磷蛋白:將步驟(2)得到的卵黃高磷蛋白用蛋白酶在最適pH條件下進(jìn)行水解，并輔以超高壓輔助處理?xiàng)l件為10(Tl50MPa，溫度4(T43°C，時(shí)間l(Tl5min ;之后用5kDa的超濾膜在4°C下進(jìn)行超濾，收集超濾得到小分子組分； (4)后處理:將步驟(3)所得超濾組分用冷凍干燥機(jī)進(jìn)行冷凍干燥，冷凍干燥壓強(qiáng)參數(shù)為2(T25pa，溫度為-35'30°C，收集冷凍后所得產(chǎn)物，即得雞胚蛋卵黃高磷蛋白磷酸肽。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述雞胚蛋卵黃高磷蛋白磷酸肽的提取方法，其特征在于:步驟(3)所述水解用蛋白酶為胰蛋白酶、胃蛋白酶、醇酶、木瓜蛋白酶、堿性蛋白酶、中性蛋白酶中的一種或幾種的復(fù)合酶。
【文檔編號(hào)】C07K1/36GK103952456SQ201410162051
【公開日】2014年7月30日 申請(qǐng)日期:2014年4月22日 優(yōu)先權(quán)日:2014年4月22日
【發(fā)明者】徐學(xué)明, 段翔, 楊哪, 吳鳳鳳, 金征宇, 周星, 田耀旗, 焦愛權(quán), 王金鵬, 趙建偉 申請(qǐng)人:江南大學(xué)