專(zhuān)利名稱(chēng)：纈酪肽片段及其制備方法和用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種纈酪肽截短后的片段，該多肽片段具有刺激分泌胰島素的作用，本發(fā)明同時(shí)還提供了上述多肽片段的制備方法。
背景技術(shù)：
纈酪肽是ー種二十五肽，由二十五個(gè)氨基酸通過(guò)肽鍵連接而成，最初在豬小腸中分離而得，目前主要應(yīng)用于治療消化系統(tǒng)的腫瘤中。糖尿病是ー種血液中的葡萄糖容易堆積過(guò)多的疾病。國(guó)外給它的別名為“沉默的殺手” (Silent Killer)，特別是〃成人型糖尿病〃。四十歲以上的中年人染患率特別高，在日本，四十歲以上的人口中發(fā)病率占10%，即十人當(dāng)中就有一位糖尿病患者，一旦患上〃糖 是促進(jìn)胰島素分泌的藥物和直接補(bǔ)充胰島素，但是這些藥物要么效果不好要么會(huì)產(chǎn)生胰島素抵抗性。所以尋找新的治療糖尿病的藥物一直在進(jìn)行中。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供了ー種多肽片段，經(jīng)檢測(cè)后發(fā)現(xiàn)其為纈酪肽的截?cái)嗪蟮钠危衫i酪肽3 25位的氨基酸殘基組成，其氨基酸序列如下YPVEHPDKFLKFGMTPSKGVLFY。本發(fā)明同時(shí)還提供了如上所述的多肽在生物醫(yī)藥上被認(rèn)可的經(jīng)化學(xué)修飾后的多肽。本發(fā)明提供了上述多肽的制備方法，包括以下步驟(I)、將豬腸道洗浄后浸入沸水中浸泡3 7分鐘，浸泡完成后取出冷凍并剁碎，然后在O 10° C條件下用醋酸對(duì)腸道進(jìn)行浸取后過(guò)濾得浸出液，用鹽酸對(duì)浸出液中的浸出物洗脫并抽濾得耐熱腸多肽；(2)、將耐熱腸多肽溶解于水中，加入抗氧化劑及足量異丙醇溶液，室溫下充分靜置后離心除去沉淀，然后再加入足量溫度為-25で -15 °C的異丙醇溶液并在-25°C _15°C條件下充分靜置后抽濾去除沉淀，將所得濾液的PH值調(diào)節(jié)為5. 8 6. 1，再在-25で -15°C條件下充分靜置后抽濾得白色沉淀，將白色沉淀充分洗滌后即制得粗肽；(3)、將步驟(2)中制得的粗肽溶解于醋酸溶液中制得肽溶液，將肽溶液過(guò)柱層析分離得到分離物，選取分離物中具有刺激胰腺分泌胰島素功能的ー份，將其凍干即得粗提取物；(4)、將粗提取物溶解于碳酸氫銨溶液中并攪拌，離心后去除沉淀得上清液，將所得上清液過(guò)柱層析并采用PH值為8. O、濃度為O. 02mol/L的碳酸氫銨溶液進(jìn)行洗滌，洗滌后得到的洗滌物凍干，再將洗滌物經(jīng)過(guò)兩次高效液相色譜分離后，將分離物凍干即制得權(quán)利要求I所述氨基酸序列的多肽。步驟(I)中醋酸的濃度為O. 5mol/L，鹽酸的濃度為O. 2mol/L。步驟(2)中抗氧化劑為硫ニ甘醇，添加量為I. 2毫升；洗滌分兩次進(jìn)行，第一次洗滌選用異丙醇溶液，第二次洗滌選用こ醚溶液，第二次洗滌完成后將白色沉淀放入真空環(huán)境中使こ醚在真空中蒸發(fā)。所述步驟(4)中的兩次高效液相色譜分離中，第一次分離所用洗提液為O. 1%的三氟こ酸水溶液，第二次分離所用洗提液為O. I %的三氟こ酸的こ腈溶液。本發(fā)明同時(shí)還提供了上述多肽及其藥學(xué)上可接受的鹽的用途，用于制造刺激胰腺分泌胰島素的藥物。本發(fā)明提供的多肽以及其在生物醫(yī)藥上被認(rèn)可的經(jīng)修飾后的多肽，能夠有效的刺激胰腺細(xì)胞分泌胰島素，與目前的治療糖尿病藥物中采用最多的高糖相比，本發(fā)明提供的多肽的效果更明顯。



圖I為本發(fā)明實(shí)施例I中的粗肽層析分離結(jié)果圖；圖2為本發(fā)明實(shí)施例I中第二次高效液相色譜分離結(jié)果圖；圖3為本發(fā)明提供的多肽的氨基酸序列圖；圖4為本發(fā)明提供的胰腺刺激試驗(yàn)的實(shí)驗(yàn)結(jié)果圖。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明做詳細(xì)具體的說(shuō)明。實(shí)施例I本實(shí)施例中采用以下制備步驟(I)、取30千克新鮮豬腸，將豬腸道洗浄后浸入沸水中浸泡4分鐘，浸泡完成后取出冷凍并剁碎，然后在5° C條件下用O. 5mol/L的醋酸對(duì)腸道進(jìn)行浸取后過(guò)濾得浸出液，然后用O. 2mol/L的鹽酸對(duì)浸出液中的浸出物洗脫并抽濾得耐熱腸多肽約30克，耐熱腸多肽的產(chǎn)率約為豬腸濕重的O. 01%。(2)、將30克耐熱腸多肽溶解于O. 24L水中，加入I. 2毫升抗氧化劑硫ニ甘醇及
I.08L異丙醇溶液，室溫下靜置2小時(shí)后離心除去沉淀，然后再加入I. 32L溫度為_(kāi)20°C的異丙醇溶液并在_20°C條件下靜置24小時(shí)后抽濾去除沉淀，將所得濾液的PH值用鹽酸調(diào)節(jié)為6，再在-20°C條件下充分靜置后抽濾得白色沉淀，將白色沉淀分兩次進(jìn)行洗滌，第一次洗滌選用異丙醇溶液，第二次洗滌選用こ醚溶液，第二次洗滌完成后將白色沉淀放入真空環(huán)境中使こ醚在真空中蒸發(fā)即制得粗肽6. 5克。(3)、將步驟(2)中制得的粗肽6. 5克溶解于300mL0. 2mol/L的醋酸溶液中制得肽溶液，將肽溶液過(guò)柱層析分離得到分離物，選取分離物中具有刺激胰腺分泌胰島素功能的ー份，將其凍干即得粗提取物，如圖I所示，選取圖I中所標(biāo)記的ー份為目標(biāo)物。(4)、將粗提取物溶解于81. 5mL0. 01mol/L的碳酸氫銨溶液中并攪拌20分鐘，離心后去除沉淀得上清液，將所得上清液過(guò)柱層析并采用PH值為8. O、濃度為O. 02mol/L的碳酸氫銨溶液進(jìn)行洗滌，洗滌后得到的洗滌物凍干，再將洗滌物經(jīng)過(guò)兩次高效液相色譜分離后，所述的兩次高效液相色譜分離中，第一次分離所用洗提液為O. 1%的三氟こ酸水溶液；第二次分離所用洗提液為O. 1%的三氟こ酸的こ腈溶液，將第二次分離后所得沉淀收集并凍干即制得權(quán)利要求I所述氨基酸序列的多肽，如圖2所示，目標(biāo)物即為本發(fā)明所提供的多肽。對(duì)上述步驟中制的多肽經(jīng)SDS-PAGE膠純化。進(jìn)行氨基酸測(cè)序用Edman降解法做肽序列分析。Applied Biosystems 477A儀器偶聯(lián)120 Aanalyzer、Milligen 6600> Waters 440分析儀,進(jìn)行氨基酸序列分析。測(cè)序結(jié)果如圖3所示
多肽IYPVEHPDKFLKFGMTPSKGVLFY 23與纈酪肽其序列為VQ YPVEHPDKFLKFGMTPSKGVLFY只有兩個(gè)氨基酸的差異。由此可知，本發(fā)明中的多肽為纈酪肽第3至第25氨基酸殘基所組成的多肽片段。對(duì)本發(fā)明中制得的多肽性能進(jìn)行研究，測(cè)試在離體大鼠胰島灌流系統(tǒng)進(jìn)行葡萄糖誘導(dǎo)的胰島素分泌的影響。雄性SD大鼠(體重200 250克)，經(jīng)麻醉后取出胰腺，然后用膠原酶消化。上述胰腺在37°C下用RPMI 1640培養(yǎng)基培養(yǎng)過(guò)夜，所述的培養(yǎng)基中第一組添加有3. 3mM的葡萄糖，第二組中添加有16. 7mM的葡萄糖，第三組中添加有16. 7mM的葡萄糖和IOnM的纈酪肽3-25。用放射免疫分析法來(lái)確定三個(gè)胰腺所釋放的胰島素量。測(cè)定結(jié)果如圖4所示，由此可見(jiàn)纈酪肽3-25具有明顯的促胰島素分泌的作用。實(shí)施例2本實(shí)施例中采用以下制備步驟(I)、取20千克新鮮豬腸，將豬腸道洗浄后浸入沸水中浸泡6分鐘，浸泡完成后取出冷凍并剁碎，然后在8° C條件下用O. 5mol/L的醋酸對(duì)腸道進(jìn)行浸取后過(guò)濾得浸出液，然后用O. 2mol/L的鹽酸對(duì)浸出液中的浸出物洗脫并抽濾得耐熱腸多肽約19克，耐熱腸多肽的產(chǎn)率約為豬腸濕重的O. 01%。(2)、將19克耐熱腸多肽溶解于O. 15L水中，加入I毫升抗氧化劑硫ニ甘醇及O. 7L異丙醇溶液，室溫下靜置2小時(shí)后離心除去沉淀，然后再加入O. 89L溫度為_(kāi)23°C的異丙醇溶液并在_20°C條件下靜置24小時(shí)后抽濾去除沉淀，將所得濾液的PH值用鹽酸調(diào)節(jié)為6，再在-18°C條件下充分靜置后抽濾得白色沉淀，將白色沉淀分兩次進(jìn)行洗滌，第一次洗滌選用異丙醇溶液，第二次洗滌選用こ醚溶液，第二次洗滌完成后將白色沉淀放入真空環(huán)境中使こ醚在真空中蒸發(fā)即制得粗肽4. 3克。(3)、將步驟(2)中制得的粗肽4. 3克溶解于200mL0. 2mol/L的醋酸溶液中制得肽溶液，將肽溶液過(guò)柱層析分離得到分離物，選取分離物中具有刺激胰腺分泌胰島素功能的ー份，將其凍干即得粗提取物。(4)、將粗提取物溶解于54mL0. 01mol/L的碳酸氫銨溶液中并攪拌20分鐘，離心后去除沉淀得上清液，將所得上清液過(guò)柱層析并采用PH值為8. O、濃度為O. 02mol/L的碳酸氫銨溶液進(jìn)行洗滌，洗滌后得到的洗滌物凍干，再將洗滌物經(jīng)過(guò)兩次高效液相色譜分離后，所述的兩次高效液相色譜分離中，第一次分離所用洗提液為O. 1%的三氟こ酸水溶液；第二次分離所用洗提液為O. 1%的三氟こ酸的こ腈溶液，將第二次分離后所得沉淀收集并凍干即制得權(quán)利要求I所述氨基酸序列的多肽。對(duì)上述步驟中制的多肽經(jīng)SDS-PAGE膠純化。采用Edman降解法做肽序列分析。分析儀器為Applied Biosystems 477A儀器偶聯(lián)120 A analyzer、Milligen 6600> Waters 440分析儀,進(jìn)行氨基酸序列分析。測(cè)序結(jié)果如圖3所示
多肽IYPVEHPDKFLKFGMTPSKGVLFY 23與纈酪肽其序列為VQ YPVEHPDKFLKFGMTPSKGVLFY只 有兩個(gè)氨基酸的差異。由此可知，本發(fā)明中的多肽為纈酪肽第3至第25氨基酸殘基所組成的多肽片段。對(duì)本實(shí)施例中制得的多肽的性能進(jìn)行研究，其結(jié)果與實(shí)施例I相同。
權(quán)利要求
1.一種多肽，其氨基酸序列如下YPVEHPDKFLKFGMTPSKGVLFY。
2.如權(quán)利要求I所述的多肽在生物醫(yī)藥上被認(rèn)可的經(jīng)修飾的多肽，其氨基酸序列如下YPVEHPDKFLKFGMTPSKGVLFY。
3.如權(quán)利要求I所述的多肽的制備方法，其特征在于采用以下步驟 (1)、將豬腸道洗浄后浸入沸水中浸泡3 7分鐘，浸泡完成后取出冷凍并剁碎，然后在O 10° C條件下用醋酸對(duì)腸道進(jìn)行浸取后過(guò)濾得浸出液，用鹽酸對(duì)浸出液中的浸出物洗脫并抽濾得耐熱腸多肽； (2)、將耐熱腸多肽溶解于水中，加入抗氧化劑及足量異丙醇溶液，室溫下充分靜置后離心除去沉淀，然后再加入足量溫度為_(kāi)25°C _15°C的異丙醇溶液并在-25°C _15°C條件下充分靜置后抽濾去除沉淀，將所得濾液的PH值調(diào)節(jié)為5. 8 6. 1，再在-25°C _15°C條件下充分靜置后抽濾得白色沉淀，將白色沉淀充分洗滌后即制得粗肽； (3)、將步驟(2)中制得的粗肽溶解于醋酸溶液中制得肽溶液，將肽溶液過(guò)柱層析分離得到分離物，選取分離物中具有刺激胰腺分泌胰島素功能的ー份，將其凍干即得粗提取物； (4)、將粗提取物溶解于碳酸氫銨溶液中并攪拌，離心后去除沉淀得上清液，將所得上清液過(guò)柱層析并采用PH值為8. O、濃度為O. 02mol/L的碳酸氫銨溶液進(jìn)行洗滌，洗滌后得到的洗滌物凍干，再將洗滌物經(jīng)過(guò)兩次高效液相色譜分離后，將分離物凍干即制得權(quán)利要求I所述氨基酸序列的多肽。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的制備方法，其特征在于步驟(I)中醋酸的濃度為0.5mol/L，鹽酸的濃度為O. 2mol/L。
5.根據(jù)權(quán)利要求3所述的制備方法，其特征在于步驟(2)中抗氧化劑為硫ニ甘醇，添加量為I. 2毫升；洗滌分兩次進(jìn)行，第一次洗滌選用異丙醇溶液，第二次洗滌選用こ醚溶液，第二次洗滌完成后將白色沉淀放入真空環(huán)境中使こ醚在真空中蒸發(fā)。
6.根據(jù)權(quán)利要求3所述的制備方法，其特征在于所述步驟(4)中的兩次高效液相色譜分離中，第一次分離所用洗提液為O. I %的三氟こ酸水溶液,第二次分離所用洗提液為O.I %的三氟こ酸的こ腈溶液。
7.權(quán)利要求I所述多肽的用途，其特征在于用于制造刺激胰腺分泌胰島素的藥物。
8.權(quán)利要求2所述多肽在生物醫(yī)藥上被認(rèn)可的經(jīng)修飾的多肽的用途，其特征在于用于制造刺激胰腺分泌胰島素的藥物。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種多肽及其制備方法和用途，該多肽為纈酪肽截?cái)嗪蟮钠?，由其?～25位的氨基酸殘基組成，其氨基酸序列如下YPVEHPDKFLKFGMTPSKGVLFY。本發(fā)明提供的多肽的制備方法如下首先將耐熱腸多肽從豬腸道中提取出，然后從耐熱腸多肽中提取中粗肽，將粗肽溶于醋酸溶液中制得肽溶液，將肽溶液過(guò)柱層析分離得到分離物，選取分離物中具有刺激胰腺分泌胰島素功能的一份，將其凍干即得粗提取物，將粗提取物進(jìn)行提純后即可制得上述多肽。本發(fā)明中還提供了上述多肽及其藥學(xué)上可接受的鹽的用途，用于制造刺激胰腺分泌胰島素的藥物。
文檔編號(hào)C07K1/16GK102838669SQ20121027181
公開(kāi)日2012年12月26日 申請(qǐng)日期2012年8月1日 優(yōu)先權(quán)日2012年8月1日
發(fā)明者李臣鴻, 汪俊漢, 陳正望 申請(qǐng)人:中南民族大學(xué)