專利名稱：一種制備高濃度氨基酸及免疫活性肽的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
動(dòng)物血，主要是豬、牛血是屠宰行業(yè)中副產(chǎn)物中利用最不理想的、量又非常大的部分，除了豬血有一部分可以用于食用外，其余絕大部分都不能進(jìn)行有價(jià)值的深加工。國(guó)內(nèi)外研究人員一直都很重視動(dòng)物血液的綜合利用，不過(guò)一直沒有重大進(jìn)展。
生物小分子利用方面，人們主要把注意力放在氨基酸的提取中。以血蛋白為原料制備氨基酸，通常有兩種辦法酶解與酸解。1968年，Mullinger等人利用木瓜酶水解豬血，氨基酸得率不到10％，氨基酸濃度僅為1mg/ml。1994年，鄭遠(yuǎn)旗等人采用了硫酸氨法提純氨基酸，使氨基酸收率達(dá)到了55.3％，但由于水解條件激烈，未知產(chǎn)物較多，一些氨基酸完全被破壞，產(chǎn)生黑色素，還有些氨基酸遭到部分破壞，因此無(wú)法進(jìn)行實(shí)際應(yīng)用。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供一種制備高濃度氨基酸及免疫活性肽的方法，以解決目前對(duì)動(dòng)物血利用率低，且用蛋白酶解蛋白轉(zhuǎn)化率低，產(chǎn)品濃度小，成本高的問題。本發(fā)明采取的技術(shù)方案是包括下列步驟一、粗酶液的制備取新鮮豬胰臟1Kg，然后將其手工去脂肪組織，再使用經(jīng)過(guò)消毒的刀具將其切碎，放置在干凈，干燥的容器內(nèi)，加入0.5～1L的蒸餾水，用膠體磨研磨后勻漿，再向勻漿內(nèi)加入少量NaOH，調(diào)節(jié)pH值至7.5，再將該勻漿置于室溫環(huán)境存放8小時(shí)，然后將勻漿用干凈的綢布積壓過(guò)濾，取過(guò)濾液；二、取新鮮的豬血1份，置于干燥的容器內(nèi)，加入0.2～0.8倍體積的蒸餾水，攪拌至均勻，再加入NaOH，調(diào)pH至7.9～8.2，將液體加熱至100度，保持沸騰狀態(tài)20～30分鐘；然后降溫至25～45度，向液體內(nèi)加入步驟一所得到的0.1～0.5倍體積的粗酶液，混合均勻，再將其放入恒溫箱，調(diào)節(jié)溫度在39～45度，放置20～35小時(shí)，然后取出，加熱煮沸10分鐘，再加入鹽酸調(diào)節(jié)pH值至3.5～5.5，將液體過(guò)濾，得到濾液。
本發(fā)明從動(dòng)物血液中提純高濃度氨基酸及免疫活性肽工藝是一個(gè)利用豬牛血為原料，通過(guò)生物酶解，進(jìn)而分離純化得到的高濃度氨基酸，高免疫活性多肽的生物化學(xué)法制備工藝，氨基酸濃度在不經(jīng)濃縮的條件下，是80～90mg/ml。該發(fā)明的主要特點(diǎn)是能將大型養(yǎng)殖場(chǎng)，屠宰場(chǎng)，肉類加工廠所產(chǎn)生的幾乎未被利用的下腳料——?jiǎng)游镅行У乩闷饋?lái)，通過(guò)一系列生物化學(xué)方法，將其轉(zhuǎn)變?yōu)楦吒郊又档纳锂a(chǎn)品，即高濃度氨基酸及免疫活性肽。
本發(fā)明利用本工藝提純的氨基酸及免疫增強(qiáng)肽有著蛋白酶解蛋白轉(zhuǎn)化率高，產(chǎn)品濃度高，生產(chǎn)成本低廉等諸多優(yōu)勢(shì)，其中，血蛋白轉(zhuǎn)化率高于目前工藝水平的1倍以上，氨基酸濃度則超過(guò)目前工藝水平所能達(dá)到濃度的4倍，以成本來(lái)說(shuō)，遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于目前氨基酸生產(chǎn)的成本、且免疫活性好。產(chǎn)率血液的氨基酸轉(zhuǎn)化率是50％，即1Kg血液可以得到80g氨基酸，多肽可得到25g。
下面通過(guò)實(shí)驗(yàn)例證明本發(fā)明的免疫活性。
體內(nèi)T淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化試驗(yàn)T淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化試驗(yàn)簡(jiǎn)介機(jī)體內(nèi)或機(jī)體外培養(yǎng)的淋巴細(xì)胞在受到抗原，促有絲分裂或非特異的刺激后，可導(dǎo)致細(xì)胞活化，產(chǎn)生細(xì)胞因子合成，細(xì)胞因子受體表達(dá)，細(xì)胞分化及細(xì)胞增殖的細(xì)胞行為的變化。細(xì)胞增殖反應(yīng)雖不能反映細(xì)胞的全部功能，但亦可代表細(xì)胞活化的事實(shí)。而且細(xì)胞增殖反應(yīng)的檢測(cè)手段，具有可靠性高，良好的重復(fù)性和簡(jiǎn)便性等特點(diǎn)，故可通過(guò)細(xì)胞增殖反應(yīng)的測(cè)定來(lái)判斷免疫細(xì)胞的功能一直得到廣泛的應(yīng)用。當(dāng)淋巴細(xì)胞在有絲分裂原或特意抗原的作用下，細(xì)胞內(nèi)核酸和蛋白質(zhì)的合成增加，同時(shí)細(xì)胞形態(tài)轉(zhuǎn)化為原始母細(xì)胞，是淋巴細(xì)胞的一種“返幼”現(xiàn)象，而且用此試驗(yàn)可測(cè)定淋巴細(xì)胞的應(yīng)答功能，稱為淋巴細(xì)胞的轉(zhuǎn)化試驗(yàn)，(Lyphocyte transformation test)簡(jiǎn)稱淋轉(zhuǎn)試驗(yàn)。
具體實(shí)驗(yàn)步驟1)免疫小鼠將40只昆明小鼠按給藥方式和給藥劑量的不同，隨機(jī)分為40.0mg/Kg.d，20.0mg/Kg.d，10.0mg/Kg.d，5.0mg/Kg.d四種給藥劑量以及生理鹽水作為對(duì)照的給注射給藥組，同時(shí)將40.0mg/Kg.d，20.0mg/Kg.d，10.0mg/Kg.d，5.0mg/Kg.d四種給藥劑量以及生理鹽水作為對(duì)照的口服組作為口服給藥組，共10組，每組為4只小鼠。從第一天開始，按上述給藥劑量和給藥方式開始給藥，連續(xù)給藥10天。并在第一天和第八天，每只小鼠用0.5ml，5％的兔紅細(xì)胞進(jìn)行免疫，最后一次給藥的24小時(shí)后，對(duì)小鼠取血然后處死。
2)動(dòng)物取血并制成脾細(xì)胞懸液取脾細(xì)胞懸液0.1ml，對(duì)等量0.4ml臺(tái)酚蘭染液，混勻，吸取50μL，加入細(xì)胞計(jì)數(shù)載玻片內(nèi)，使懸液充滿計(jì)數(shù)室，按白細(xì)胞計(jì)數(shù)方法計(jì)數(shù)，計(jì)數(shù)后以培養(yǎng)液調(diào)節(jié)脾細(xì)胞懸液濃度，使各小鼠脾細(xì)胞懸液的濃度均為1×10,000,000cells/ml備用。
細(xì)胞濃度(細(xì)胞數(shù)/ml原液)＝(4大格細(xì)胞總數(shù)/4)×10,000稀釋倍數(shù)3)T淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化試驗(yàn)取已配好的各實(shí)驗(yàn)小鼠的脾細(xì)胞懸液(1×10,000,000cells/ml)，用常規(guī)方法培養(yǎng)后待顆粒完全溶解，吹散打勻，最后在酶標(biāo)儀上讀出570nm下每孔OD結(jié)果。
結(jié)果判定＝ConA刺激孔吸光度均值/對(duì)照孔吸光度均值4)體內(nèi)T淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化試驗(yàn)結(jié)果注射對(duì)照組為1.091，給藥5mg/Kg，結(jié)果是1.538，高出對(duì)照50％以上。
口服對(duì)照組為1.281，給藥5mg/Kg，結(jié)果是1.741，高出對(duì)照36％以上。
具體實(shí)施例方式
實(shí)施例1一、粗酶液的制備取新鮮豬胰臟1Kg，然后將其手工去脂肪組織，再使用經(jīng)過(guò)消毒的刀具將其切碎，放置在干凈，干燥的容器內(nèi)，加入0.5L的蒸餾水，用膠體磨研磨后勻漿，再向勻漿內(nèi)加入少量NaOH，調(diào)節(jié)pH值至7.5，再將該勻漿置于室溫環(huán)境存放8小時(shí)，然后將勻漿用干凈的綢布積壓過(guò)濾，取過(guò)濾液。
二、取新鮮的豬血1份，置于干燥的容器內(nèi)，加入0.2倍體積的蒸餾水，攪拌至均勻，再加入NaOH，調(diào)pH至7.9，將液體加熱至100度，保持沸騰狀態(tài)20分鐘。然后降溫至25度，向液體內(nèi)加入步驟一所得到的0.1倍體積的粗酶液，混合均勻，再將其放入恒溫箱，調(diào)節(jié)溫度在39度，放置20小時(shí)。然后取出，加熱煮沸10分鐘，再加入適量鹽酸，調(diào)節(jié)pH值至3.5，將液體過(guò)濾，得到濾液。
實(shí)施例2一、粗酶液的制備取新鮮豬胰臟1Kg，然后將其手工去脂肪組織，再使用經(jīng)過(guò)消毒的刀具將其切碎，放置在干凈，干燥的容器內(nèi)，加入0.8L的蒸餾水，用膠體磨研磨后勻漿，再向勻漿內(nèi)加入少量NaOH，調(diào)節(jié)pH值至7.5，再將該勻漿置于室溫環(huán)境存放8小時(shí)，然后將勻漿用干凈的綢布積壓過(guò)濾，取過(guò)濾液。
二、取新鮮的豬血1份，置于干燥的容器內(nèi)，加入0.5倍體積的蒸餾水，攪拌至均勻，再加入NaOH，調(diào)pH至7.5，將液體加熱至100度，保持沸騰狀態(tài)25分鐘。然后降溫至30度，向液體內(nèi)加入步驟一所得到的0.3倍體積的粗酶液，混合均勻，再將其放入恒溫箱，調(diào)節(jié)溫度在40度，放置25小時(shí)。然后取出，加熱煮沸10分鐘，再加入適量鹽酸，調(diào)節(jié)pH值至4.5，將液體過(guò)濾，得到濾液。
實(shí)施例3一、粗酶液的制備取新鮮豬胰臟1Kg，然后將其手工去脂肪組織，再使用經(jīng)過(guò)消毒的刀具將其切碎，放置在干凈，干燥的容器內(nèi)，加入1L的蒸餾水，用膠體磨研磨后勻漿，再向勻漿內(nèi)加入少量NaOH，調(diào)節(jié)pH值至7.5，再將該勻漿置于室溫環(huán)境存放8小時(shí)，然后將勻漿用干凈的綢布積壓過(guò)濾，取過(guò)濾液。
二、取新鮮的豬血1份，置于干燥的容器內(nèi)，加入0.8倍體積的蒸餾水，攪拌至均勻，再加入NaOH，調(diào)pH至8.2，將液體加熱至100度，保持沸騰狀態(tài)30分鐘。然后降溫至45度，向液體內(nèi)加入步驟一所得到的0.5倍體積的粗酶液，混合均勻，再將其放入恒溫箱，調(diào)節(jié)溫度在45度，放置35小時(shí)。然后取出，加熱煮沸10分鐘，再加入適量鹽酸，調(diào)節(jié)pH值至5.5，將液體過(guò)濾，得到濾液。
權(quán)利要求
1.一種制備高濃度氨基酸及免疫活性肽的方法，包括下列步驟一、粗酶液的制備取新鮮豬胰臟1Kg，然后將其手工去脂肪組織，再使用經(jīng)過(guò)消毒的刀具將其切碎，放置在干凈，干燥的容器內(nèi)，加入0.5～1L的蒸餾水，用膠體磨研磨后勻漿，再向勻漿內(nèi)加入少量NaOH，調(diào)節(jié)pH值至7.5，再將該勻漿置于室溫環(huán)境存放8小時(shí)，然后將勻漿用干凈的綢布積壓過(guò)濾，取過(guò)濾液；二、取新鮮的豬血1份，置于干燥的容器內(nèi)，加入0.2～0.8倍體積的蒸餾水，攪拌至均勻，再加入NaOH，調(diào)pH至7.9～8.2，將液體加熱至100度，保持沸騰狀態(tài)20～30分鐘，然后降溫至25～45度，向液體內(nèi)加入步驟一所得到的0.1～0.5倍體積的粗酶液，混合均勻，再將其放入恒溫箱，調(diào)節(jié)溫度在39～45度，放置20～35小時(shí)，然后取出，加熱煮沸10分鐘，再加入適量鹽酸，調(diào)節(jié)pH值至3.5～5.5，將液體過(guò)濾，得到濾液。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種制備高濃度氨基酸及免疫活性肽的方法，屬于生物技術(shù)領(lǐng)域。包括粗酶液的制備取新鮮豬胰臟，加水，研磨，勻漿，調(diào)節(jié)pH值，過(guò)濾，取過(guò)濾液；取新鮮的豬血，加入水，調(diào)pH至7.9～8.2，將液體加熱至100度，然后降溫至25～45度，向液體內(nèi)加入粗酶液，混合均勻，再將其放入恒溫箱，再加入適量鹽酸，調(diào)節(jié)pH至3.5～5.5，將液體過(guò)濾，得到濾液。本發(fā)明利用本工藝提純的氨基酸及免疫增強(qiáng)肽有著蛋白酶解蛋白轉(zhuǎn)化率高，產(chǎn)品濃度高，生產(chǎn)成本低廉等諸多優(yōu)勢(shì)，且免疫活性好。
文檔編號(hào)A61K35/14GK1876821SQ20061001677
公開日2006年12月13日 申請(qǐng)日期2006年4月19日 優(yōu)先權(quán)日2006年4月19日
發(fā)明者佟振宇 申請(qǐng)人:佟振宇