美洲大蠊抗腫瘤有效部位凍干粉及其制備方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了美洲大蠊抗腫瘤有效部位凍干粉及其制備方法，所述凍干粉的制備方法，包括以下步驟：取美洲大蠊，粉碎成粉末，將所述粉末用石油醚脫脂，然后將脫脂后的粉末用乙醇浸泡，浸泡后的粉末再進(jìn)行滲漉，收集滲濾液后濃縮，將濃縮液純化后再冷凍干燥即得。本發(fā)明采用化學(xué)成分檢測結(jié)合體外腫瘤細(xì)胞生長抑制強度試驗，進(jìn)行抗腫瘤的活性篩選，確定提取方法，并對提取工藝參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化，得到最佳提取工藝參數(shù)；再用HP20大孔樹脂對提取液進(jìn)行純化處理，篩選出抗腫瘤有效部位，以探討美洲大蠊抗腫瘤的物質(zhì)基礎(chǔ)，為開發(fā)美洲大蠊有效部位的新制劑奠定基礎(chǔ)。
【專利說明】
美洲大蠊抗腫瘤有效部位凍干粉及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域
[0001 ]本發(fā)明屬于中藥化學(xué)，具體地說，涉及一種美洲大蠊抗腫瘤有效部位凍干粉及其 制備方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 美洲大蠊(Periplaneta americana(L.))為昆蟲綱有翅亞綱蜚蠊目蜚蠊科大蠊屬 昆蟲的干燥蟲體，又名蟑螂、石姜、滑蟲、偷油婆、茶婆子，入藥始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，謂"味 咸，寒。主血瘀、癥堅、寒熱，破積聚，喉咽痹，內(nèi)寒，無子"，具有活血化瘀、解毒消疳、利水消 腫等功效，用于治療小兒疳積、疔瘡、癰腫、喉蛾、無名腫毒、梅毒以及毒蛇、蜈蚣咬傷等疾 病。含有蛋白質(zhì)、氨基酸、肽類、糖類等多種有效成分，現(xiàn)代研究表明，在抗癌、提高免疫力、 治療心血管疾病、修復(fù)皮膚等方面具有顯著的作用。
[0003] 癌癥是僅次于心血管疾病的人類第二大殺手，嚴(yán)重危害人類健康，已逐漸成為重 大的社會公共衛(wèi)生問題。西醫(yī)對腫瘤的治療仍以手術(shù)、放療和化療為主，毒副作用嚴(yán)重和廣 泛，導(dǎo)致病人機體狀況的惡化及生命質(zhì)量的下降，多數(shù)患者因不能忍受而放棄治療，甚至死 于過度治療。中醫(yī)藥對腫瘤的治療起著不可估量的作用，惡性腫瘤屬于中醫(yī)"癌"、"巖"、"惡 月中"、"積聚"等范疇，中藥治療惡性腫瘤立足于整體觀念，扶正與祛邪相結(jié)合，標(biāo)本兼治，從 而增強療效，具有西醫(yī)不可比擬的獨特優(yōu)勢（多途徑、多靶點和多環(huán)節(jié)的共同作用），逐漸成 為抗腫瘤研究的熱點。
[0004] 美洲大蠊具有高蛋白的資源優(yōu)勢，其體內(nèi)粗蛋白質(zhì)含量在20%-70%之間，遠(yuǎn)遠(yuǎn)高 于豬肉、牛肉、雞肉等肉類。美洲大蠊還富含氨基酸18種以上，包括人體半必需氨基酸2種和 人體必需氨基酸7種。文獻(xiàn)報道現(xiàn)已從美洲大蠊中分離鑒定出50多種神經(jīng)肽，如神經(jīng)肽原肛 肽、昆蟲抗菌肽等。其中昆蟲抗菌肽是具有生物活性短鏈多肽，具對熱穩(wěn)定、廣譜抗菌等特 點，能抑制多種腫瘤細(xì)胞及動物實體瘤的生長，且不會對正常細(xì)胞造成傷害。廖吉在"蜚蠊 油脂在保健食品和醫(yī)藥上的應(yīng)用及制備方法"（CN1500495A)中指出："蜚蠊含油酸，亞油酸， 亞麻酸等不飽和脂肪酸，其含量高達(dá)71.903%，具有抗菌和修復(fù)創(chuàng)傷，增強免疫力等作用"。 蒙松年、焦春香等采用GC-MS對美洲大蠊的提取物進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)含有較多烯醇、烯酸類和 烷烴、多元醇、大環(huán)內(nèi)酯類物質(zhì)。此外，美洲大蠊體內(nèi)還含有信息素、糖類(如粘多糖等），酶， 酯酶，輔酶A及豐富的礦物質(zhì)和微量元素。
[0005] 蟑螂的不同溶劑提取物對小鼠518〇抑瘤實驗，抑瘤率為43%~63%。采用E玫瑰花 環(huán)試驗檢測蟑螂油的細(xì)胞免疫反應(yīng)，通過腹腔注射其蟑螂油可增強免疫反應(yīng)。蔣永新等研 究指出康復(fù)新液(美洲大蠊提取物)有抑制腫瘤生長，阻滯細(xì)胞周期，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡的 作用。廖劍英使用"康復(fù)新"治療惡性纖維組織細(xì)胞瘤，效果良好。陳利銘研究發(fā)現(xiàn)蟑螂提取 物AT 2具有抗腫瘤活性，能增強小鼠腹腔巨噬細(xì)胞的吞噬功能，并使脾臟指數(shù)增加，在體外 則可增加 T淋巴細(xì)胞對ConA的轉(zhuǎn)化反應(yīng)。
[0006] 以美洲大蠊為原料開發(fā)的"康復(fù)新"產(chǎn)品，經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)其含多元醇類、粘糖氨酸和 表面細(xì)胞生長因子EGF等，能增強巨噬細(xì)胞和NK細(xì)胞的吞噬能力，消除炎癥水腫，改善局部 血液循環(huán);能使傷口周圍中性粒細(xì)胞數(shù)量和趨化功能增加，促進(jìn)表皮細(xì)胞生長和肉芽組織 增生，利于創(chuàng)面清理和加速創(chuàng)面修復(fù)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 有鑒于此，本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是提供一種美洲大蠊抗腫瘤有效部位凍干 粉及其制備方法。
[0008] 為了解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明公開了一種美洲大蠊抗腫瘤有效部位凍干粉，凍 干粉分子量3Kd;多肽含量以牛血清蛋白計，不少于53.94%;氨基酸以丙氨酸計不少于 4.51 %;尿嘧啶彡0.22%，次黃嘌呤彡0.77%，肌酐彡4.62%。
[0009] 本發(fā)明還公開了上述美洲大蠊抗腫瘤有效部位凍干粉的制備方法，包括以下步 驟:取美洲大蠊，粉碎成粉末，將所述粉末用石油醚脫脂，然后將脫脂后的粉末用乙醇浸泡， 浸泡后的粉末再進(jìn)行滲漉，收集滲漉液后濃縮，將濃縮液純化后再冷凍干燥即得。
[0010] 進(jìn)一步的，所述美洲大蠊粉碎成粗粉。
[00?1 ] 進(jìn)一步的，所述滲漉速度為l-3ml/min/kg。
[0012]優(yōu)選的，所述滲漉速度為3ml/min/kg。
[0013] 進(jìn)一步的，所述乙醇浸泡步驟為用粉末10倍量的90%乙醇浸泡48h。
[0014] 進(jìn)一步的，所述滲漉液濃縮條件為50-60°C濃縮至1: lml/g。
[0015] 進(jìn)一步的，所述濃縮液純化方法為:加純化水使?jié)饪s液濃度為0.3g/ml，用2BV濃縮 液以2BV/h的速度通過HP20大孔樹脂色譜柱，靜置lh，然后用70%乙醇，以2BV/h的速度洗脫 lh，收集洗脫液，減壓濃縮至1: 2ml/g。
[0016] 進(jìn)一步的，所述冷凍干燥方法為:將純化后的濃縮液在-60°C條件下預(yù)冷至-40°C， 保持2h，然后程序升溫至-20°C，保持2h，快速升溫至30°C解析干燥6h。
[0017] 與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明可以獲得包括以下技術(shù)效果：
[0018] 1)本發(fā)明的美洲大蠊抗腫瘤有效部位凍干粉及制備方法采用化學(xué)成分檢測結(jié)合 體外腫瘤細(xì)胞生長抑制強度試驗，進(jìn)行抗腫瘤的活性篩選，確定提取方法，并對提取工藝參 數(shù)進(jìn)行優(yōu)化，得到最佳提取工藝參數(shù);再用HP20大孔樹脂對提取液進(jìn)行純化處理，篩選出抗 腫瘤有效部位，以探討美洲大蠊抗腫瘤的物質(zhì)基礎(chǔ)，為開發(fā)美洲大蠊有效部位的新制劑奠 定基礎(chǔ)。
[0019] 2)本發(fā)明的制備方法技術(shù)方案，步驟簡單，易于操作，重復(fù)性好，技術(shù)人員易學(xué)、易 掌握。
[0020] 當(dāng)然，實施本發(fā)明的任一產(chǎn)品必不一定需要同時達(dá)到以上所述的所有技術(shù)效果。
【附圖說明】
[0021] 此處所說明的附圖用來提供對本發(fā)明的進(jìn)一步理解，構(gòu)成本發(fā)明的一部分，本發(fā) 明的示意性實施例及其說明用于解釋本發(fā)明，并不構(gòu)成對本發(fā)明的不當(dāng)限定。在附圖中：
[0022] 圖1為本發(fā)明實施例1中美洲大蠊不同提取方法對K562細(xì)胞增殖的濃度抑制率曲 線圖（n = 3);
[0023] 圖2為本發(fā)明實施例1中美洲大蠊不同提取方法對SMMC-7721細(xì)胞增殖的濃度抑制 率曲線圖(n = 3);
[0024] 圖3為本發(fā)明實施例1中美洲大蠊不同提取方法對HCT116細(xì)胞增殖的濃度抑制率 曲線圖(n = 3);
[0025] 圖4為本發(fā)明實施例1中牛血清白蛋白標(biāo)準(zhǔn)曲線圖；
[0026] 圖5為本發(fā)明實施例1中丙氨酸對照品標(biāo)準(zhǔn)曲線圖；
[0027]圖6為本發(fā)明實施例1中美洲大蠊乙醇不同濃度提取物對K562細(xì)胞增殖的濃度抑 制率曲線圖(n = 3);
[0028] 圖7為本發(fā)明實施例1中美洲大蠊乙醇不同濃度提取物對SMMC-7721細(xì)胞增殖的濃 度抑制率曲線圖(n = 3);
[0029] 圖8為本發(fā)明實施例1中美洲大蠊乙醇不同濃度提取物對HCT-116細(xì)胞增殖的濃度 抑制率曲線圖(n = 3);
[0030] 圖9為本發(fā)明實施例1中樹脂對多肽的動態(tài)吸附曲線圖；
[0031] 圖10為本發(fā)明實施例1中不同乙醇濃度洗脫的美洲大蠊凍干粉對K562細(xì)胞增殖的 濃度抑制率曲線圖(n = 3);
[0032] 圖11為本發(fā)明實施例1中不同乙醇濃度洗脫的美洲大蠊凍干粉對SMMC-77 21細(xì)胞 增殖的濃度抑制率曲線圖(n = 3);
[0033] 圖12為本發(fā)明實施例1中不同乙醇濃度洗脫的美洲大蠊凍干粉對HCT116細(xì)胞增殖 的濃度抑制率曲線圖(n = 3);
[0034] 圖13為本發(fā)明實施例1中多肽洗脫曲線圖；
[0035] 圖14為本發(fā)明實施例2中美洲大蠊凍干粉電泳圖。
【具體實施方式】
[0036] 以下將配合附圖及實施例來詳細(xì)說明本發(fā)明的實施方式，藉此對本發(fā)明如何應(yīng)用 技術(shù)手段來解決技術(shù)問題并達(dá)成技術(shù)功效的實現(xiàn)過程能充分理解并據(jù)以實施。
[0037] 實施例1美洲大蠊抗腫瘤有效部位凍干粉的制備方法
[0038] 1、美洲大蠊不同提取方法對腫瘤細(xì)胞的影響
[0039] 1.1美洲大蠊不同的提取方法
[0040] 1.1.1 滲漉法
[0041] 取美洲大蠊粗粉100g，用石油醚浸泡脫脂后，藥渣中加入90%乙醇攪勻，密閉放置 待藥粉充分膨脹后，裝滲漉筒，再加入10倍量90 %乙醇浸泡48h，以3ml/min/kg的速度滲漉， 收集濾液，于50 °C下減壓濃縮，定容。
[0042] 1.1.2超聲法
[0043] 取美洲大蠊粗粉100g，用石油醚浸泡脫脂后，藥渣用10倍量90%乙醇浸泡48h，超 聲20min X 3，濾過，藥渣再加入8倍量90 %乙醇超聲2次，每次20min X 3，濾過，合并3次濾液， 于50°C下減壓濃縮，定容。
[0044] 1.1.3乙醇回流法
[0045] 取美洲大蠊粗粉100g，用石油醚浸泡脫脂后，藥渣用10倍量90%乙醇浸泡48h，回 流lh，濾過，藥渣再加入8倍量90 %乙醇回流2次，每次lh，濾過，合并3次濾液，于50°C下減壓 濃縮，定容。
[0046] 1.2陽性對照樣品配制
[0047] lmg/ml的順鉑(DDP)用培養(yǎng)基液配制為0 · lμg/ml，lμg/ml，10μg/ml三個濃度。
[0048] 1.3供試樣品的制備
[0049] 取三種不同提取方法制得的提取液減壓濃縮至l:2(ml:g)，再冷凍干燥成粉末。取 不同供試品，加水或DMS0溶解，再加入適量水，配置為不同濃度梯度進(jìn)行加板，所有樣品均 經(jīng)過一次性濾膜過濾滅菌。
[0050] 1.4細(xì)胞培養(yǎng)
[00511 人肝癌SMMC-7721細(xì)胞株，人紅白血病細(xì)胞株K562和人結(jié)腸癌細(xì)胞株HCT116，采用 含10 %胎牛血清的RPMI 1640pH7.4的完全培養(yǎng)基，在37 °C、5 % C02條件下常規(guī)培養(yǎng)。
[0052] 1.5美洲大蠊不同提取方法對腫瘤細(xì)胞增殖的影響
[0053]取對數(shù)生長期的腫瘤細(xì)胞，將腫瘤細(xì)胞濃度調(diào)整為(4X104~5X104)個/ml，以90μ 1/孔種入96孔培養(yǎng)板中。細(xì)胞種板后，置37°C、5%C02培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h，受試組分別加 ?ομL 不同濃度的樣品，陰性對照(DMS0)和陽性對照(DDP:0. lμg/ml，lμg/ml，10μg/ml三個濃度）， 空白對照孔僅加培養(yǎng)基，每組設(shè)3個復(fù)孔。樣品終濃度設(shè)為12.5、25、50、100、200、400μg/ml 進(jìn)行加藥，加藥后將96孔板置37°C，5 %⑶2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)48h，每孔加10μ1的CCK-8，置 37°C，5%⑶2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)2h，以450nm為測量波長，630nm為參考波長測定各孔的0D 值，每個實驗至少重復(fù)3次。細(xì)胞增殖抑制率計算公式如下:抑制率=[1_(0D給藥組-0D空白 孔)/(0D陰性對照組-0D空白孔）]X100%。半數(shù)抑制濃度（IC50)采用LOGIT法計算。不同部 位的濃度抑制率曲線見圖1-3，IC50見表1。
[0054] 表1美洲大蠊不同提取方法對不同腫瘤細(xì)胞的IC50(μg/ml，n = 3)
[0055] _
[0056] 從表1可知，采用乙醇滲漉法、超聲法、回流法提取的美洲大蠊則表現(xiàn)出不同程度 的體外抗腫瘤活性，其中滲漉法提取的藥液對三種腫瘤細(xì)胞的抑制作用最強，其IC50均最 小，故選擇滲漉法提取。
[0057]根據(jù)文獻(xiàn)報道，結(jié)合美洲大蠊抗腫瘤的臨床研究，選擇人肝癌SMMC-7721細(xì)胞株， 人紅白血病細(xì)胞株K562和人結(jié)腸癌細(xì)胞株HCT116采用體外腫瘤細(xì)胞生長抑制強度試驗對 美洲大蠊乙醇滲漉液、乙醇超聲提取液、乙醇回流提取液進(jìn)行考察，試驗結(jié)果顯示采用乙醇 滲漉法提取的美洲大蠊藥液對三種腫瘤細(xì)胞的抑制作用最強，抗癌活性最明顯。美洲大蠊 含有大量的脂肪油，在前期細(xì)胞毒性試驗中發(fā)現(xiàn)脂肪油對腫瘤細(xì)胞株無抑制作用，為無效 成分，故先采取石油醚脫脂后再進(jìn)行提取工藝研究。
[0058] 2、美洲大蠊乙醇滲漉工藝的研究
[0059]中藥成分的復(fù)雜性也決定自身具有多種藥理作用，乙醇的溶解范圍相當(dāng)廣泛，不 同乙醇濃度滲漉提取的物質(zhì)基礎(chǔ)差異較大，所產(chǎn)生的藥效也截然不同，如果僅用化學(xué)成分 作為考察指標(biāo)，很難確保制劑的有效性，故對影響藥效成分提取的主要因素乙醇濃度采用 體外腫瘤細(xì)胞生長抑制強度試驗來考察，即考察乙醇不同濃度提取物對人肝癌SMMC-7721 細(xì)胞株，人紅白血病細(xì)胞株K562和人結(jié)腸癌細(xì)胞株HCT116的細(xì)胞毒活性，確定乙醇濃度后， 以多肽、氨基酸含量及干膏率收率為評價指標(biāo)，對其余2個影響因素一乙醇用量和滲漉速度 采用單因素進(jìn)行考察，以優(yōu)選合理可行的乙醇滲漉提取工藝參數(shù)。
[0060] 2.1評價指標(biāo)的選擇
[0061 ] 2.1.1對腫瘤細(xì)胞增殖的抑制作用
[0062]參照"1.5美洲大蠊不同提取方法對腫瘤細(xì)胞增殖的影響"。
[0063] 2.1.2干膏收率測定
[0064] 精密吸取25ml各滲漉液于蒸發(fā)皿中（干燥至恒重），水浴揮干后，在105°C干燥3小 時，迅速移置干燥器中，冷卻30min后，精密稱定重量，計算收膏率。
[0065] 2.1.3多肽含量的測定
[0066]多肽的測定方法較多，主要有凱氏定氮法、雙縮脲法、Lowry法、考馬斯亮藍(lán)G-250 法、BCA法等，凱氏定氮法最準(zhǔn)確但操作繁瑣，雙縮脲法簡單易行但靈敏度差，考馬斯亮藍(lán)法 與BCA法對小分子量的多肽顯色不完全，Lowry法操作簡單，重現(xiàn)性好，靈敏度高，對蛋白質(zhì) 和小分子多肽，具有同樣的顯色反應(yīng)，故選其作為美洲大蠊多肽的含量測定方法。
[0067] (1)對照品溶液的制備
[0068] 精密稱取51.80mg牛血清白蛋白對照品（BSA)，置100ml容量瓶中，加水溶解至刻 度，搖勾，配成每lml含0.5180mg牛血清白蛋白的對照品溶液。
[0069] (2)線性范圍考察
[0070] 精密吸取BSA對照品溶液0 (空白），0.2,0.4,0.6,0.8,1.0ml，加蒸餾水補足至 1.0ml。加堿性銅試劑5.00ml，混勻，快速加入酚試劑0.5ml，快速搖勻，55 °C水浴15min，取出 冷卻至室溫，顯色后，照分光光度法（中華人共和國藥典2010年版I部，附錄VA)，在740nm處 測定吸光度，以吸光度Y為縱坐標(biāo)，多肽濃度X為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，結(jié)果見表2和圖4。
[0071] 表2多肽線性范圍的考察
[0072]
[0073] 直線回歸方程為：Y = 0.0071X+0.087(r = 0.9993)，表明牛血清白蛋白在15·938μ g/ml~79.692μg/ml內(nèi)，樣品濃度與吸光度線性關(guān)系良好。
[0074] (3)供試樣品溶液制備
[0075]按單因素對樣品進(jìn)行滲漉提取，分別精密吸取各樣品液置100ml容量瓶中，加蒸餾 水至刻度，再分別吸取lml樣品液，照標(biāo)準(zhǔn)曲線制備項下的方法，自"加堿性銅試劑5.00ml" 起，依法測定吸收度。
[0076] 2.1.4氨基酸的含量測定
[0077]茚三酮顯色法常常用于氨基酸含量的測定，該法重現(xiàn)性好，操作簡單，靈敏度高， 便于工藝控制，故美洲大蠊?jié)B漉液中游離氨基酸的含量采用茚三酮顯色法測定。
[0078] (1)對照品溶液的配制
[0079] 精密稱取16.08mg丙氨酸對照品，加適量10 %的異丙醇溶解，置100ml容量瓶中，并 稀釋至刻度，作為母液。精密量取4ml，至50ml容量瓶中，用超純水稀釋至刻度，配制成每lml 含12.86yg丙氨酸的對準(zhǔn)品溶液。
[0080] (2)線性范圍考察
[0081 ] 精密吸取丙氨酸對照品溶液（12 · 86μg/ml)0ml (空白）、0 · 4、0 · 8、1 · 2、1 · 6、2ml至 l〇ml具塞刻度試管中，分別加入蒸餾水至2ml，加0. lml新鮮配制的1 %Vc溶液，3ml茚三酮醇 溶液，混勻，在100 °C水浴中加熱15min，取出迅速冷至室溫，加入60 %乙醇至刻度，照分光光 度法（中華人共和國藥典2010年版I部，附錄VA )，在570nm處測定吸光度，以吸光度Y為縱坐 標(biāo)，濃度X為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，結(jié)果見表3和圖5。
[0082]表3氨基酸線性范圍的考察
[0083]
[0084] 直線回歸方程為：Y = 0.249X+0.1137(r = 0.9996)，表明丙氨酸在 0.5146μg/ml ~ 2.5728μg/ml內(nèi)，樣品濃度與吸光度線性關(guān)系良好。
[0085] (3)供試樣品溶液制備
[0086]按單因素對樣品進(jìn)行滲漉提取，分別精密吸取各樣品液置100ml容量瓶中，加蒸餾 水至刻度，再分別吸取2ml樣品液，照標(biāo)準(zhǔn)曲線制備項下的方法，自"加0. lml新鮮配制的1% Vc溶液"起，依法測定吸收度。
[0087] 2.2乙醇濃度的考察
[0088] 稱取美洲大蠊粗粉適量，石油醚脫脂，分別加10倍量90%、70%、40%的乙醇浸泡 48h，收集各滲漉液，于50°C下減壓回收乙醇至無醇味，冷凍干燥，照3.1.5項下方法測定對 腫瘤細(xì)胞增殖的影響，計算細(xì)胞增殖抑制率和半數(shù)抑制濃度（IC50)，各供試品的濃度抑制 率曲線見圖6-8，IC50見表4。
[0089] 表4美洲大蠊乙醇不同濃度提取物對不同腫瘤細(xì)胞的IC50(μg/ml，n = 3)
[0090]
[0091] 由表4和圖6-8可知，美洲大蠊40%的乙醇提取物對K562、SMMC-7721和HCT116細(xì)胞 的增殖均無明顯的抑制作用，不能計算IC50。但美洲大蠊90%、70%的乙醇提取物具有較強 的抑制作用，其中以90%的乙醇提取物對各腫瘤細(xì)胞的IC50最小，活性最強，因此提取溶劑 選用90%的乙醇進(jìn)行滲漉。
[0092] 2.3吸醇率的測定
[0093]稱取美洲大蠊飲片粗粉，石油醚脫脂后，加5倍量90 %乙醇浸泡，觀察潤濕程度，待 藥粉充分潤濕至透心為止，過濾，藥渣稱重，計算吸醇率，結(jié)果見表5。
[0094] 表5吸醇率試驗結(jié)果
[0095]
[0096] 由表5可知，美洲大蠊飲片吸醇率約為146.9 %，因此提取時應(yīng)額外加入1.5倍量 90%乙醇以補足藥材的吸醇量。
[0097] 2.4乙醇用量的考察
[0098] 稱取適量美洲大蠊粗粉，每份100g，石油醚脫脂后，加90 %乙醇攪勻，密閉放置一 段時間后，裝滲漉筒，再分別加6倍、8倍、10倍、12倍量90 %乙醇浸泡48h，以3ml/min/kg的流 速滲漉，收集滲漉液，以多肽含量、氨基酸含量、出膏率為評價指標(biāo)，照2.1項下方法分別測 定，結(jié)果見表6。
[0099]表6乙醇用量的考察 [0100]
[0101] ~由表6可知，乙醇用量在10倍以上對多肽與氨基酸含量影響不大，從節(jié)約出發(fā)，選_ 用10倍量90 %乙醇進(jìn)行提取。
[0102] 2.5滲漉速度的考察
[0103] 稱取適量美洲大蠊粗粉，每份100g，石油醚脫脂后，加90 %乙醇拌濕，密閉放置一 段時間后，裝滲漉筒，加入10倍量90%乙醇浸潤4811，分別以11111/111；[11/1^、31111/111；[11/1^、51111/ min/kg的速度進(jìn)行滲漉，收集滲漉液，以多肽含量、氨基酸含量、出膏率為指標(biāo)，照2.1項下 方法分別測定，結(jié)果見表7。
[0104] 表7滲漉速度的考察
[0105] _
[0106] 由表7可知，以lml/min/kg滲漉，多肽、氨基酸含量及出膏率均比以3ml/min/kg的 略高，但實際差異不大，為節(jié)約生產(chǎn)成本和時間，故確定乙醇滲漉流速為3ml/min/kg。
[0107] 2.6提取工藝的驗證實驗
[0108] 根據(jù)上述結(jié)果可知，美洲大蠊乙醇滲漉工藝為:取美洲大蠊飲片粗粉，石油醚脫脂 后，用10倍量90%乙醇浸泡48h，以3ml/min/kg的速度進(jìn)行滲漉，收集滲漉液。為確保滲漉工 藝的重現(xiàn)性和可靠性，取三批美洲大蠊飲片進(jìn)行驗證試驗，結(jié)果見表8。
[0109] 表8驗證試驗結(jié)果
[0110]
[0111] 由表8可知，該滲漉提取工藝合理可行，重現(xiàn)性好。
[0112] 滲漉法屬于動態(tài)浸出方法，有效成分浸出完全，沒有加熱過程，避免了有效成分受 熱分解。滲漉速度以1~3ml/min/kg提取效果為好，可能是因為美洲大蠊屬于昆蟲類，壁層 較厚，慢速滲漉更有利于溶劑滲入組織細(xì)胞。
[0113] 3、濃縮工藝研究
[0114] 美洲大蠊所含的主要成分為多肽、氨基酸類物質(zhì)，溫度過高會引起蛋白質(zhì)肽鍵斷 裂，結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，從而失去活性，而減壓濃縮具有濃縮時間短，能夠防止或減少熱敏性物 質(zhì)的分解，故本工藝考慮采用減壓濃縮，以多肽、氨基酸的含量作為考察指標(biāo)，比較了分別 在50 °C、60 °C、70 °C下減壓濃縮前后其含量的變化，結(jié)果見表9。
[0115] 表9濃縮工藝考察結(jié)果
[0116]
[0117] 由表9可知，提取液在50 °C和60 °C下濃縮，多肽與氨基酸的含量變化較小，在70°C 時二者含量減少明顯，考慮到生產(chǎn)效率及盡可能保留有效成分，選擇50~60°C范圍內(nèi)進(jìn)行 濃縮。
[0118] 4、分離純化工藝研究
[0119] 中藥的提取液中含有大量的無效成分和構(gòu)材物質(zhì)，為盡可能地富集有效成分，增 加藥物的療效、減少服用量以及有利于成型，常常對中藥提取液進(jìn)行一定的純化處理。美洲 大蠊抗腫瘤的主要有效成分為多肽物質(zhì)，目前該類成分的分離方法主要有：鹽析法、超濾 法、凝膠過濾法、等電點沉淀法、層析法等。文獻(xiàn)表明對于多肽類化合物的分離純化，大孔吸 附樹脂具有較好的效果。大孔樹脂分離具有選擇性好、成本較低、吸附容量大、再生處理方 便等優(yōu)點，是繼離子交換樹脂后發(fā)展起來的，近年來被廣泛應(yīng)用于中藥產(chǎn)業(yè)，適合工業(yè)化生 產(chǎn)的分離提純技術(shù)。因此，本研究采用大孔樹脂分離純化技術(shù)對美洲大蠊?jié)B漉液中多肽進(jìn) 行純化，但大孔樹脂根據(jù)極性大小分為不同的類型，從而對化合物的分離純化也不盡相同， 考慮到中藥成分的復(fù)雜多樣性，故對大孔樹脂的種類進(jìn)行選擇并對其吸附解吸的影響因素 進(jìn)行了系統(tǒng)考察，以期得到最佳純化工藝參數(shù)，為動物類藥材中多肽的分離純化及日后工 業(yè)化大生產(chǎn)提供一定的參考和依據(jù)。
[0120] 4.1美洲大蠊?jié)B漉液的制備
[0121 ]按照"2、美洲大蠊乙醇滲漉工藝的研究"結(jié)果制備滲漉液。
[0122] 4.2樹脂的預(yù)處理
[0123] 將一定量的NKA-9 (極性）、DM-301 (中極性）、AB-8 (弱極性）、D-101 (非極性）、DA-201(非極性）、HP20(非極性)型大孔吸附樹脂先用95%乙醇浸泡24h，使其充分溶脹，濕法裝 柱，用95%乙醇以3BV/h流速洗滌，洗至流出的乙醇與蒸餾水混合不渾濁為止，最后以蒸餾 水以3BV/h流速充分洗至無醇味，抽濾備用。
[0124] 4.3樹脂的靜態(tài)吸附、解吸性能考察
[0125] 分別稱取2g已處理好的6種大孔樹脂，于50ml具塞錐形瓶中，分別加入生藥濃度為 〇. 2g/ml的美洲大蠊?jié)B漉液30ml，置25°C恒溫振蕩器中，以150r/min振蕩12h，過濾，收集濾 液，測定多肽含量，按照公式（1)計算樹脂靜態(tài)吸附率;將吸附飽和的美洲大蠊?jié)B漉液樹脂 抽干后，加入70%的乙醇3〇1111，置25°(：恒溫振蕩器中振蕩1211(振蕩速度為15(^/1^11)解吸， 分別取各解吸液測定多肽含量，按照公式(2)計算不同樹脂對美洲大蠊多肽的解吸率，結(jié)果 見表10。
[0126] 吸附率（％ ) = (〇)-&)/0) X 100 (1)
[0127] 解吸率（％) = (C2Xv2)/[(C『C1)Xv1]X 100 (2)
[0128] 其中Co為原液多肽濃度(mg/ml)，Ci為吸附液多肽濃度(mg/ml)，νι為吸附液體積 (ml)，C2為解吸液多肽濃度(mg/ml)，V2為解吸液體積(ml)。
[0129] 表10不同大孔樹脂對美洲大蠊多肽的靜態(tài)吸附解吸情況(n = 3)
[0130]
[0131] 由表10可知，6種大孔樹脂中AB-8、D-101、DA-201、HP20型大孔樹脂的吸附率相差 不大，但HP20解吸率要明顯大于其他幾類，故選擇HP20型大孔樹脂來分離純化美洲大蠊多 肽。
[0132] 4.4樹脂的動態(tài)吸附性能考察
[0133] 將預(yù)處理好的HP20樹脂濕法裝柱(2cmX 30cm，30g樹脂），取生藥濃度為0.2g/ml的 美洲大蠊?jié)B漉液適量，以2BV/h流速通過樹脂，每20ml (即0.5倍BV)收集1個流份，共20個流 份。以流出液體積為橫坐標(biāo)，多肽質(zhì)量濃度為縱坐標(biāo)，繪制樹脂對多肽的動態(tài)吸附曲線，見 圖9。
[0134] 從圖9可知，在開始0.5BV時，流出液中多肽濃度很低，隨著上樣體積的增加，流出 液中多肽濃度不斷上升，從第2.5BV時，多肽濃度急劇增加，出現(xiàn)較大量泄漏，因此確定藥液 上樣量為2BV。
[0135] 4.5上樣液質(zhì)量濃度的考察
[0136] 分別量取生藥濃度為0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6g/ml美洲大蠊?jié)B漉液2BV，以2BV/ h通過樹脂柱，收集流出液，測定流出液中多肽的含量，計算吸附率，結(jié)果見表11。
[0137] 表11上樣液質(zhì)量濃度的考察
[0138]
?0?39?~由表11可知，上樣液質(zhì)量濃度越低，多肽吸附率越大，吸附效果逐漸增強，這可能 由于濃度越低，多肽與樹脂充分接觸，從而吸附較完全，〇.l、〇.2、0.3g/ml的上樣濃度，多肽 吸附率相差不大，但樣品質(zhì)量濃度越稀，耗費的時間越長，考慮到生產(chǎn)的實際可操作性，故 確定樣品液質(zhì)量濃度為〇. 3g/ml。
[0140] 4.6上樣液流速對吸附的影響
[0141] 取生藥濃度為0.3g/ml的美洲大蠊?jié)B漉液2BV，分別以lBV/h、2BV/h、3BV/h的流速 通過樹脂柱，測定流出液中多肽的含量，得不同流速上樣液流速的吸附效果，考察流速對樹 脂吸附率的影響，結(jié)果見表12。
[0142] 表12上樣液流速對吸附的影響
[0143]
[0144] ~由表12可知，隨著流速由lBV/h增加到3BV/h，多肽回收率逐漸減小，吸附效果減_ 弱，而lBV/h、2BV/h的上樣流速對樹脂的吸附效果影響不大，為縮短時間，提高效率，采用 2BV/h的上樣速率。
[0145] 4.7洗脫溶媒對解吸效果的影響
[0146] 取生藥濃度為0.3g/ml美洲大蠊提取液2BV，以2BV/h流速通過樹脂柱，靜置lh，然 后分別用30%、50%、70%、90%乙醇（28￥/11，48￥)洗脫，收集不同乙醇濃度的洗脫液，測定 各洗脫液中多肽的質(zhì)量濃度，得到不同乙醇濃度的解吸效果，結(jié)果見表13。
[0147] 表13不同乙醇濃度對解吸率的影響
[0148]
[0149] ~不同濃度的乙醇具有不同的洗脫能力，洗脫的物質(zhì)基礎(chǔ)有所差異，因而對藥效也, 會存在一定的影響，為盡可能保證療效，故本實驗取不同乙醇濃度的洗脫液旋蒸至無醇味， 再冷凍干燥成粉末。其余照1.3項下方法制備供試樣品，1.5項下方法測試對腫瘤細(xì)胞增殖 的影響，結(jié)果見圖10-12和表14。
[0150] 表14不同乙醇濃度洗脫的美洲大蠊凍干粉對不同腫瘤細(xì)胞的IC50(μg/ml，n = 3)
[0151]

[0152] 由表13可知，不同乙醇濃度對多肽的洗脫有較大的影響，用50%和70%的乙醇洗 脫時解吸率較高，兩者相差不明顯，但由圖10-12和表14可知，除30%乙醇洗脫凍干粉外， 50 %、70 %及90 %乙醇洗脫凍干粉均可抑制腫瘤細(xì)胞的增殖，但以70 %的乙醇洗脫的凍干 粉抑制率最強，IC50最小，故選擇70 %的乙醇洗脫。
[0153] 4.8洗脫劑用量對解吸效果的影響
[0154] 取生藥濃度為0.3g/ml美洲大蠊提取液2BV，以2BV/h流速通過樹脂柱，靜置lh，用 70%乙醇（28￥/11，58￥)洗脫層析柱，每201111(8卩0.5倍階)收集1個流份，共10個流份，以流出 液體積為橫坐標(biāo)，多肽質(zhì)量濃度為縱坐標(biāo)，繪制多肽洗脫曲線，見圖13。
[0155] 由圖13可知，用70 %乙醇洗脫，多肽濃度隨洗脫體積的增加而逐漸增大，至2BV后， 洗脫液中幾乎已無多肽，故選擇2BV的70%乙醇洗脫。
[0156] 4.9洗脫劑流速對解吸效果的影響
[0157] 取生藥濃度為0.3g/ml美洲大蠊提取液2BV，以2BV/h流速通過樹脂柱，靜置lh，用 2BV的70 %乙醇以不同流速(1、2、3BV/h)洗脫層析柱，結(jié)果見表15。
[0158] 表15不同洗脫速度的影響
[0159]
[0160]由表15可知，在洗脫劑用量一定時，流速越小，洗脫劑與樹脂接觸的時間長，解吸 充分，洗脫效果越好，可見低流速有利于多肽的洗脫，但流速過小費時費力，綜合考慮，選擇 洗脫劑流速為2BV/h，保質(zhì)保效。
[0161] 4.10驗證試驗
[0162] 根據(jù)上述試驗結(jié)果，按照上述最佳條件重復(fù)3次試驗，取生藥濃度為0.3g/ml美洲 大蠊?jié)B漉液，以2BV/h流速通過樹脂柱，靜置lh，用70%乙醇（2BV/h，2BV)洗脫層析柱，收集 乙醇洗脫液，測定洗脫液中多肽含量，計算回收率，結(jié)果見表16。
[0163] 表16驗證試驗結(jié)果
[0164]
[0165] 由表16可知，HP20大孔樹脂純化工藝合理可行，重現(xiàn)性好。
[0166] HP20大孔樹脂對美洲大蠊提取液中多肽具有較好的吸附特性，用70%乙醇可以比 較集中地將提取液中的多肽類成分有效分離出來，以達(dá)到純化的效果。
[0167] 大孔吸附樹脂主要以甲基丙烯酸甲酯、苯乙烯等為原料加入一定量致孔劑(二乙 烯苯)聚合而成的一種不溶于酸、堿及有機溶劑的高分子聚合物，根據(jù)極性大小的不同分為 非極性、弱極性和極性幾種類型。大孔吸附樹脂帶有一定的極性基團，且顆粒的總表面積較 大，使大孔樹脂具有較大的吸附能力，另一方面又具有不同孔徑大小的網(wǎng)狀孔穴結(jié)構(gòu)，使得 它們根據(jù)化合物分子量的不同而具有一定的選擇性，調(diào)整體系的親水與疏水平衡及化合物 的性質(zhì)，就可以引起吸附的增加或解吸。HP20為非極性樹脂，主要是基于化合物的疏水集團 與非極性吸附劑之間的范德華引力進(jìn)行吸附，降低洗脫劑極性，洗脫能力增加。從生產(chǎn)的可 行性和安全性綜合考慮，本實驗采用調(diào)整乙醇一水的比例來改變洗脫劑的極性，從而對多 肽進(jìn)行富集。
[0168] 在用乙醇洗脫中發(fā)現(xiàn)，較高濃度的乙醇洗脫不僅在解吸率和抑制腫瘤細(xì)胞的增殖 方面效果都好于低濃度的乙醇，說明美洲大蠊提取液中多是疏水性較強的小分子肽段，能 很好地被HP20吸附，用較高濃度的乙醇洗脫多肽的解吸率高。
[0169] 5、冷凍干燥工藝確定
[0170] 冷凍干燥是在低溫下將物料中含有的水分轉(zhuǎn)化成固態(tài)的冰，然后在真空環(huán)境下加 熱，讓水分由固態(tài)的冰升華為氣態(tài)的水蒸氣除去，從而使物料脫水得以干燥獲得凍干制品 的技術(shù)。常常用來干燥多肽、蛋白質(zhì)、微生物等熱敏性藥品，防止藥品的理化和生物學(xué)方面 的變性，從而保持藥品生物活性的一種有效方法。為提高凍干的效率，本實驗在前期研究工 作基礎(chǔ)上，對美洲大蠊提取液的凍干工藝參數(shù)進(jìn)行確定，制定工藝條件為，將提取液裝如物 料拖盤，高度約l〇mm，放入凍干機冷阱內(nèi)預(yù)凍(冷阱溫度-60 °C )，冷至物料溫度-40 °C，保持 2h，完成預(yù)冷凍。按照預(yù)先設(shè)定的梯度升溫程序加熱至-20°C進(jìn)行升華干燥（凍干箱壓力 30Pa左右），待冰層消失，再保持2h，且物料溫度上升接近擱板的溫度時，快速升溫至30°C進(jìn) 行解析干燥6h，即得美洲大蠊多肽類凍干粉。
[0171] 6、最終確定的制備工藝
[0172]根據(jù)美洲大蠊提取、純化工藝考察結(jié)果，確定其多肽有效部位的制備工藝條件為： 取美洲大蠊l〇kg，粉碎成粗粉，將粉末用石油醚脫脂，然后用10倍量的90%乙醇浸泡48h，以 3ml/min/kg的速度進(jìn)行滲漉，收集滲漉液，濾過，濾液在50-60°C濃縮至1: l(ml :g)，然后加 純化水調(diào)整濃縮液濃度至〇.3g/ml，以2BV/h的速度通過HP20大孔樹脂色譜柱，靜置lh，然后 用70%乙醇，以2BV/h的速度洗脫lh，收集洗脫液，減壓濃縮至1:2(ml: g)，純化后的濃縮液 在-60°C條件下預(yù)冷至_40°C，保持2h，然后程序升溫至-20°C，保持2h，快速升溫至30°C解析 干燥6h即得。
[0173]以上述方法制備三批凍干粉，結(jié)果見表17。
[0174]表17三批凍干粉樣品含量測定結(jié)果
[0175]
[0176] 實施例2美洲大蠊抗腫瘤有效部位凍干粉質(zhì)量研究
[0177] 1、多肽含量測定
[0178] 精密稱取牛血清白蛋白對照品（BSA)51.80mg，置100ml容量瓶中，加蒸餾水溶解至 刻度，搖勻，配成每lml含0.5180mg牛血清白蛋白的對照品溶液。
[0179]精密稱取凍干粉0.2g，置容量瓶中，加入70 %的乙醇2.0ml，精密稱定重量，超聲提 取lOmin，放冷，用70%乙醇補足減失的重量，搖勻，取上清液lml用70%乙醇定容于100ml容 量瓶中，搖勻，作為供試品溶液。
[0180] 取供試品溶液和對照品溶液各lml，分別加堿性銅試劑5.00ml，混勻，快速加入酚 試劑0.5ml，快速搖勻，55°C水浴15min，取出冷卻至室溫，顯色后，照分光光度法，在740nm處 測定吸光度，計算即得。按上述方法測定三批凍干粉多肽含量，結(jié)果見表18。
[0181] 表18凍干粉多肽含量的測定
[0182]
[0183]由表18可知，凍干粉中平均多肽含量為67.43%，考慮到飲片的來源，加工，制劑生 產(chǎn)等因素，暫定凍干粉每克含多肽以牛血清白蛋白計不得少于53.94%。
[0184] 2、氨基酸含量測定
[0185] 精密稱取16.08mg丙氨酸對照品，置100ml容量瓶中，加10%的異丙醇溶解，并稀釋 至刻度，作為母液;精密量取所述母液4ml，至50ml容量瓶中，用水稀釋至刻度，配制成每lml 含12.86yg丙氨酸的對照品溶液；
[0186] 精密稱取凍干粉0.2g，置具塞錐形瓶中，加入70%的乙醇10ml，精密稱定重量，超 聲提取15min，放冷，用70 %乙醇補足減失的重量，搖均，濾過，取續(xù)濾液lml用70 %乙醇定容 于100ml容量瓶中，搖勻，作為供試品溶液；
[0187] 取供試品溶液和對照品溶液各2ml至10ml具塞刻度試管中，分別加入蒸餾水至 2ml，加0. lml新鮮配制的1 % Vc溶液，3ml茚三酮醇溶液，混勻，在100°C水浴中加熱15min，取 出迅速冷至室溫，加入60%乙醇至刻度，在570nm處測定吸光度，計算即得。按上述方法測定 三批凍干粉氨基酸含量，結(jié)果見表19。
[0188] 表19凍干粉氨基酸含量的測定
[0189]
[0190] 由表19可知，凍干粉中氨基酸含量為5.64%，考慮到飲片的產(chǎn)地來源，制劑生產(chǎn)等 因素，暫定凍干粉每克氨基酸含量以丙氨酸計不得少于4.51 %。
[0191] 3、核苷類成分含量測定
[0192] 色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗：以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑；甲醇為流動相 A，0.7 %冰乙酸溶液為流動相B進(jìn)行梯度洗脫；檢測波長為254nm，柱溫30 °C，流速0.7ml/ min〇
[0193] 洗脫梯度為： 時間（min) 流動相A ( % ) 流動相B ( % ) 0 0 100
[0194] 15 1 99 40 8 92 50 55 45
[0195] 對照品溶液的制備:取尿嘧啶、次黃嘌呤、肌苷對照品，精密稱定，置量瓶中，加超 純水制成含尿嘧啶5.02μg/ml、次黃嘌呤25.2μg/ml、肌苷127.5μg/ml的混合對照品溶液。
[0196] 供試品溶液的制備:精密稱取凍干粉0.2g，置具塞錐形瓶中，蒸餾水10ml，精密稱 定重量，超聲提取l〇min，放冷，用蒸餾水補足減失的重量，搖均，濾過，精密量取續(xù)濾液5ml， 蒸干，殘渣加水定容至l〇ml量瓶中，0.45μπι濾膜過濾，取續(xù)濾液作為供試品溶液。
[0197] 測定方法:分別精密吸取對照品溶液與供試品溶液各ΙΟμΙ，注入液相色譜儀，測 定，計算即得。按上述方法測定三批凍干粉多肽含量，結(jié)果見表20。
[0198] 表20凍干粉核苷類成分的含量測定
[0199]
[0200]由表20可知，凍干粉中平均尿嘧啶含量為0.28%、平均次黃嘌呤含量為0.96%、平 均肌苷含量為5.78%，考慮到飲片的來源，加工，制劑生產(chǎn)等因素，暫定凍干粉每克含尿嘧 啶不得少于0.22%、次黃嘌呤不得少于0.77%、肌酐不得少于4.62%。
[0201] 4、多肽分子量研究
[0202] Tr i c ine-SDS-PAGE 電泳試劑的配制
[0203] 凝膠緩沖液（1.5mol/LTris-HCl pH 8.45):稱取182.0g三羥基甲基氨基甲烷 (Tris)，用400ml超純水將其充分溶解，調(diào)pH為8 · 45(lmol/L HC1)，加1 · 5g SDS充分溶解后， 加超純水定容至500ml。
[0204] T = 49.5 %、C = 3 %的丙烯酰胺溶液(AB-3)，濃縮膠和夾層膠:稱取48.0g丙烯酰 胺、1.5g N，N-亞甲基雙丙烯酰胺，加超純水充分溶解，再定容至100ml，過濾，避光條件下(4 °C)保存，在1個月內(nèi)使用。
[0205] T = 49.5%、C = 6%的丙烯酰胺溶液（AB-6)，分離膠：稱取48·0g丙烯酰胺、3·0g N， N-亞甲基雙丙烯酰胺，加超純水充分溶解，再定容至100ml，過濾，避光條件下(4°C)保存，在 1個月內(nèi)使用。
[0206] 10 %過硫酸銨溶液:稱取1.0g過硫酸銨，加注射用水10ml充分溶解，臨用新鮮配 制，或者配制后分裝，_20°C保存，一周內(nèi)使用。
[0207] Tris-HCl/SDS(pH6 · 8):稱取3 ·025gTris，加超純水20ml充分溶解，調(diào)pH至6 · 8(濃 HC1)，用超純水定容至50ml，然后加入0.2g SDS，充分溶解，即得。
[0208] 陽極電泳緩沖液(pH8·9):稱取121 · lgTris base，用400ml超純水溶解，調(diào)pH為8 ·9 (mol/L HC1)，再加超純水定容至500ml，用前稀釋10倍。
[0209] 陰極電泳緩沖液(pH約8 · 25):稱取60 · 55gTris base，89 · 58gTricine和5gSDS，用 超純水充分溶解，再定容至500ml，用前稀釋10倍。
[0210] 供試品緩沖液:巰基乙醇3.085g，溴酚藍(lán)0.2g，用超純水溶解，加入甘油20ml，10 % SDS 40ml，lmol/L的Tris-Hcl緩沖液 10ml(pH6.8)，再用超純水定容至 100ml。
[0211] 0 · 005%Na2S2〇3溶液:稱取0 · 05g Na2S2〇3，加超純水溶解，定容至 1000ml。
[0212] 0.25 %考馬斯亮藍(lán)染色液:稱取2.5g考馬斯亮藍(lán)R-250，加入甲醇450ml、冰醋酸 100ml、超純水450ml充分溶解混勻，即得。
[0213] 考馬斯亮藍(lán)R-250脫色液：量取100ml甲醇、100ml冰HAc、加注射用水定容至 1000ml〇
[0214]供試品溶液的配制：取各標(biāo)記樣品，取1〇此置于EP管中，加入樣品緩沖液，混勾，置 沸水中煮沸3_5min，取出冷卻至室溫，即得。
[0215]制備膠溶液:按表21制成分離膠溶液，夾層膠、濃縮膠，制板厚度1.0mm。
[0216] 表21膠溶液的配制
[0217]
[0218] 加樣:將制備好的凝膠板，后放入電泳槽內(nèi)，陰極電泳緩沖液加入兩玻璃板間，陽 極電泳緩沖液加入電泳槽內(nèi)。待濃縮膠聚合后拔出樣品梳，點樣，依次加入Marker對照品和 供試品。
[0219] 電泳：接通電泳儀電源后，開始電壓70-80V，待樣品進(jìn)入分離膠后，電壓調(diào)為90-100V;待溴酚藍(lán)指示劑前沿距電泳膠板l-2cm時，停止電泳。
[0220] 凝膠板剝離與染色、脫色：電泳完畢后，取出玻璃板，標(biāo)記區(qū)分，將膠片置于平皿 中，加入R250染色液染色2h左右，用超純水漂洗數(shù)次，浸入脫色液脫色，直到蛋白質(zhì)區(qū)帶清 晰為止。
[0221] 結(jié)果:采用凝膠成像系統(tǒng)觀察電泳圖譜，結(jié)果見圖14。圖中1為超低分子量標(biāo)準(zhǔn)蛋 白（3313-20100Da)，2、3、4均為美洲大蠊凍干粉。由圖14可以看出，超低分子量標(biāo)準(zhǔn)蛋白 Marker得到了初步的分析，在此條件下，美洲大蠊凍干粉中分子量為3kd左右的小分子多肽 能夠有效的分離。
[0222] 5、氨基酸組成分析與相對含量檢測
[0223] 離子交換柱：4.6mmX60mm(3ym);檢測波長：頻道l(570nm)，頻道2,（440nm，脯氨 酸，Pro);流動相:檸檬酸納和檸檬酸的緩沖液;茚三酮反應(yīng)液;柱溫:57 °C ;流速:柱栗1 (洗 脫溶液）：0.4ml/min，栗2(茚三酮溶液）：0.35ml/min，進(jìn)樣體積:20μ1。
[0224] 對照品溶液的制備：精密吸取0.200ml氨基酸混合對照品液于5ml容量瓶中，用 pH2.2的緩沖液稀釋至刻度，0.2μπι濾膜過濾，取續(xù)濾液，即得。
[0225] 供試品溶液的制備：稱取美洲大蠊有效部位0.2g，加70%乙醇50ml溶解，過濾，取 續(xù)濾液適量，加鹽酸酸解劑(6mol/L)，置安瓿中，沖入氮氣約lmin，于110°C恒溫鼓風(fēng)干燥箱 中，真空封管酸水解24小時，冷卻后移入25ml量瓶中，并用6mol/L鹽酸稀釋至刻度，蒸去鹽 酸，加入鹽酸(0.02mo 1 /L)溶解，0.2μπι濾膜過濾，取續(xù)濾液，供測試用。
[0226] 供試品溶液的檢測：以外標(biāo)法測定供試品液中的氨基酸含量，結(jié)果見表22。
[0227] 表22美洲大蠊凍干粉中氨基酸的種類與含量
[0228]
[0229]由表22可知，美洲大蠊有效部位含有水解氨基酸18種（其中色氨酸通過堿水解）， 含游離氨基酸17種，含量為3.76% (天門冬氨酸沒有檢出），含結(jié)合型氨基酸即多肽約 55.64%〇
[0230]本發(fā)明的美洲大蠊抗腫瘤有效部位凍干粉，凍干粉分子量3Kd;多肽含量以牛血清 蛋白計，不少于53.94% ;氨基酸以丙氨酸計不少于4.51 % ;尿嘧啶多0.22 %，次黃嘌呤多 0.77%，肌酐彡 4.62%。
[0231]本發(fā)明的美洲大蠊抗腫瘤有效部位凍干粉及制備方法采用化學(xué)成分檢測結(jié)合體 外腫瘤細(xì)胞生長抑制強度試驗，進(jìn)行抗腫瘤的活性篩選，確定提取方法，并對提取工藝參數(shù) 進(jìn)行優(yōu)化，得到最佳提取工藝參數(shù);再用HP20大孔樹脂對提取液進(jìn)行純化處理，篩選出抗腫 瘤有效部位，以探討美洲大蠊抗腫瘤的物質(zhì)基礎(chǔ)，為開發(fā)美洲大蠊有效部位的新制劑奠定 基礎(chǔ)。本發(fā)明的制備方法技術(shù)方案，步驟簡單，易于操作，重復(fù)性好，技術(shù)人員易學(xué)、易掌握。 [0232]如在說明書及權(quán)利要求當(dāng)中使用了某些詞匯來指稱特定成分或方法。本領(lǐng)域技術(shù) 人員應(yīng)可理解，不同地區(qū)可能會用不同名詞來稱呼同一個成分。本說明書及權(quán)利要求并不 以名稱的差異來作為區(qū)分成分的方式。如在通篇說明書及權(quán)利要求當(dāng)中所提及的"包含"為 一開放式用語，故應(yīng)解釋成"包含但不限定于"。"大致"是指在可接收的誤差范圍內(nèi)，本領(lǐng)域 技術(shù)人員能夠在一定誤差范圍內(nèi)解決所述技術(shù)問題，基本達(dá)到所述技術(shù)效果。說明書后續(xù) 描述為實施本發(fā)明的較佳實施方式，然所述描述乃以說明本發(fā)明的一般原則為目的，并非 用以限定本發(fā)明的范圍。本發(fā)明的保護(hù)范圍當(dāng)視所附權(quán)利要求所界定者為準(zhǔn)。
[0233]還需要說明的是，術(shù)語"包括"、"包含"或者其任何其他變體意在涵蓋非排他性的 包含，從而使得包括一系列要素的商品或者系統(tǒng)不僅包括那些要素，而且還包括沒有明確 列出的其他要素，或者是還包括為這種商品或者系統(tǒng)所固有的要素。在沒有更多限制的情 況下，由語句"包括一個……"限定的要素，并不排除在包括所述要素的商品或者系統(tǒng)中還 存在另外的相同要素。
[0234]上述說明示出并描述了本發(fā)明的若干優(yōu)選實施例，但如前所述，應(yīng)當(dāng)理解本發(fā)明 并非局限于本文所披露的形式，不應(yīng)看作是對其他實施例的排除，而可用于各種其他組合、 修改和環(huán)境，并能夠在本文所述發(fā)明構(gòu)想范圍內(nèi)，通過上述教導(dǎo)或相關(guān)領(lǐng)域的技術(shù)或知識 進(jìn)行改動。而本領(lǐng)域人員所進(jìn)行的改動和變化不脫離本發(fā)明的精神和范圍，則都應(yīng)在本發(fā) 明所附權(quán)利要求的保護(hù)范圍內(nèi)。
【主權(quán)項】
1. 美洲大蠊抗腫瘤有效部位凍干粉的制備方法，其特征在于，包括以下步驟:取美洲大 蠊，粉碎成粉末，將所述粉末用石油醚脫脂，然后將脫脂后的粉末用乙醇浸泡，浸泡后的粉 末再進(jìn)行滲漉，收集滲漉液后濃縮，將濃縮液純化后再冷凍干燥即得。2. 如權(quán)利要求1所述的美洲大蠊抗腫瘤有效部位凍干粉的制備方法，其特征在于，所述 美洲大蠊粉碎成粗粉。3. 如權(quán)利要求2所述的美洲大蠊抗腫瘤有效部位凍干粉的制備方法，其特征在于，所述 滲漉速度為l_3ml/min/kg。4. 如權(quán)利要求3所述的美洲大蠊抗腫瘤有效部位凍干粉的制備方法，其特征在于，所述 滲漉速度為3ml/min/kg。5. 如權(quán)利要求4所述的美洲大蠊抗腫瘤有效部位凍干粉的制備方法，其特征在于，所述 乙醇浸泡步驟為用粉末10倍量的90 %乙醇浸泡48h。6. 如權(quán)利要求5所述的美洲大蠊抗腫瘤有效部位凍干粉的制備方法，其特征在于，所述 滲漉液濃縮條件為50-60°C濃縮至1: lml/g。7. 如權(quán)利要求6所述的美洲大蠊抗腫瘤有效部位凍干粉的制備方法，其特征在于，所述 濃縮液純化方法為:加純化水使?jié)饪s液濃度為0.3g/ml，用2BV所述濃縮液以2BV/h的速度通 過HP20大孔樹脂色譜柱，靜置lh，然后用70%乙醇，以2BV/h的速度洗脫lh，收集洗脫液，減 壓濃縮至1:2ml/g。8. 如權(quán)利要求7所述的美洲大蠊抗腫瘤有效部位凍干粉的制備方法，其特征在于，所述 冷凍干燥方法為:將純化后的濃縮液在_60°C下預(yù)冷至_40°C，保持2h，然后程序升溫至-20 。(：，保持2h，快速升溫至30°C解析干燥6h。9. 美洲大蠊抗腫瘤有效部位凍干粉，其特征在于，所述凍干粉分子量3Kd;多肽含量以 牛血清蛋白計，不少于53.94% ;氨基酸以丙氨酸計不少于4.51 % ;尿嘧啶多0.22%，次黃嘌 呤彡0.77%，肌酐彡4.62%。10. 如權(quán)利要求9所述的美洲大蠊抗腫瘤有效部位凍干粉，其特征在于，所述凍干粉采 用權(quán)利要求1 -8的方法制備得到。
【文檔編號】A61K9/19GK106038607SQ201610632815
【公開日】2016年10月26日
【申請日】2016年8月3日
【發(fā)明人】張丹, 徐良, 廖芳, 劉明華, 余昕, 何穎, 陳斯瑋, 傅超美
【申請人】西南醫(yī)科大學(xué)