用于疫苗接種或免疫的化合物和方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種疫苗接種或免疫的方法，所述方法涉及使用光敏化劑、抗原分子(例如疫苗組分)、和增強(qiáng)光化學(xué)內(nèi)化(PCI)介導(dǎo)的疫苗接種效果的試劑，并用有效活化所述光敏化劑的波長的光進(jìn)行照射，其中，所述試劑是本文定義的Toll樣受體(TLR)的配體。本發(fā)明還涉及可用于所述方法的抗原組合物，例如疫苗組合物。本發(fā)明還提供了產(chǎn)生抗原呈遞細(xì)胞的方法，所述抗原呈遞細(xì)胞可用于產(chǎn)生免疫應(yīng)答，例如用于疫苗接種，該方法涉及利用與上述相同的組分將抗原分子(例如疫苗組分)引入到細(xì)胞中以實(shí)現(xiàn)抗原呈遞，和可用于所述方法的抗原組合物。本發(fā)明還提供了將利用所述方法體外產(chǎn)生的細(xì)胞用于對患者體內(nèi)施用以引發(fā)免疫應(yīng)答，例如實(shí)現(xiàn)疫苗接種。還提供了將抗原分子內(nèi)化到細(xì)胞中的方法。
【專利說明】用于疫苗接種或免疫的化合物和方法
[0001] 本發(fā)明涉及一種疫苗接種或免疫的方法，所述方法涉及使用光敏化劑、抗原分子 (例如疫苗組分）、和增強(qiáng)光化學(xué)內(nèi)化(PCI)介導(dǎo)的疫苗接種效果的試劑，并用有效活化所述 光敏化劑的波長的光進(jìn)行照射，其中，所述試劑是本文定義的Toll樣受體(TLR)的配體。本 發(fā)明還涉及可用于所述方法的抗原組合物，例如疫苗組合物。本發(fā)明還提供了產(chǎn)生抗原呈 遞細(xì)胞的方法，所述抗原呈遞細(xì)胞可用于產(chǎn)生免疫應(yīng)答，例如用于疫苗接種，該方法涉及利 用與上述相同的組分將抗原分子(例如疫苗組分）引入到細(xì)胞中以實(shí)現(xiàn)抗原呈遞，和可用于 所述方法的抗原組合物。本發(fā)明還提供了將利用所述方法體外產(chǎn)生的細(xì)胞用于對患者體內(nèi) 施用以引發(fā)免疫應(yīng)答，例如實(shí)現(xiàn)疫苗接種。還提供了將抗原分子內(nèi)化到細(xì)胞中的方法。
[0002] 疫苗接種涉及施用抗原分子以激發(fā)免疫系統(tǒng)從而刺激發(fā)展對病原體的適應(yīng)性免 疫。疫苗可預(yù)防或改善感染的發(fā)病率。疫苗接種是預(yù)防傳染性疾病的最有效方法，由疫苗接 種引起的廣泛免疫力是全球根除天花和世界上大部分地區(qū)限制如脊髓灰質(zhì)炎、麻疹和破傷 風(fēng)等疾病的主要原因。
[0003] 疫苗的活性劑可以是完整但失活(非感染性)或減毒(具有降低的感染性）的致病 病原體形式，或病原體的已發(fā)現(xiàn)具有免疫原性的純化組分(例如，病毒外殼蛋白）。產(chǎn)生類毒 素以針對基于毒素的疾病進(jìn)行免疫，如對破傷風(fēng)的破傷風(fēng)痙攣毒素進(jìn)行修飾以去除其毒性 作用，但保留其免疫原性作用。
[0004] 由于大多數(shù)疫苗通過內(nèi)吞作用被抗原呈遞細(xì)胞攝取，通過核內(nèi)體運(yùn)輸至溶酶體以 進(jìn)行抗原消化，并經(jīng)由MHC-II類途徑呈遞，疫苗接種主要激活CD4T輔助細(xì)胞和B細(xì)胞。為抗 擊病癥或疾病如癌癥和細(xì)胞內(nèi)感染，對細(xì)胞毒性CD8T-細(xì)胞應(yīng)答的刺激是重要的。然而，細(xì) 胞毒性⑶8T細(xì)胞的誘導(dǎo)通常由于難以將抗原遞送至胞漿和遞送至抗原呈遞的MHC I類途徑 而失敗。光化學(xué)內(nèi)化(PCI)改善了分子向胞漿的遞送，并且采用PCI的疫苗接種方法已知。 PCI是使用光敏化劑并結(jié)合可激活該試劑的照射步驟的技術(shù)，并且已知實(shí)現(xiàn)了將共同施用 于細(xì)胞的分子釋放到胞漿。這種技術(shù)允許被細(xì)胞攝取到細(xì)胞器如核內(nèi)體中的分子在照射時(shí) 從這些細(xì)胞器中釋放到胞漿中。PCI提供了一種以不會(huì)導(dǎo)致廣泛細(xì)胞的破壞或細(xì)胞死亡的 方式將不可透過膜(或透過性很差)的分子引入細(xì)胞的胞漿中的機(jī)制。
[0005] 光化學(xué)內(nèi)化(PCI)的基本方法在W096/07432和W000/54802中有所描述，通過引用 將二者并入本文。在這樣的方法中，需要內(nèi)化的分子(其在本發(fā)明中是抗原分子)和光敏化 劑與細(xì)胞接觸。光敏化劑和需要內(nèi)化的分子攝取到細(xì)胞內(nèi)的細(xì)胞膜包繞的亞區(qū)中，即，它們 被內(nèi)吞到細(xì)胞內(nèi)囊泡(例如溶酶體或核內(nèi)體）中。在細(xì)胞暴露于適當(dāng)波長的光時(shí)，所述光敏 化劑被激活，其直接或間接地產(chǎn)生破壞細(xì)胞內(nèi)囊泡的膜的活性物質(zhì)。這使得內(nèi)化的分子被 釋放到胞漿中。
[0006] 已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，按照這樣的方法，大多數(shù)細(xì)胞的功能或活力并沒有受到有害影響。因 此，提出了利用這種稱為"光化學(xué)內(nèi)化"的方法來將包括治療劑在內(nèi)的各種不同的分子輸送 到胞漿，即到細(xì)胞的內(nèi)部。
[0007] W000/54802利用這種常用方法來將傳遞分子呈遞或表達(dá)在細(xì)胞表面上。因此，在 分子運(yùn)輸和釋放到細(xì)胞胞漿中后，它（或該分子的一部分)可以被輸送至細(xì)胞表面，在這里 它可以被呈遞在細(xì)胞外側(cè)，即，細(xì)胞的表面上。這種方法在疫苗接種領(lǐng)域特別有用，其中，疫 苗組分即抗原或免疫原可以被引入到細(xì)胞以呈遞在細(xì)胞的表面上，從而誘導(dǎo)、促進(jìn)或增強(qiáng) 免疫應(yīng)答。
[0008] 雖然疫苗接種已經(jīng)取得了一些值得注意的成功，但仍然需要替代的改進(jìn)疫苗接種 方法。本發(fā)明解決了這一需求。
[0009] 本發(fā)明人驚訝地發(fā)現(xiàn)，有利的是，涉及利用光敏化劑、抗原分子(例如疫苗組分)和 本文限定的TLR配體并以有效活化所述光敏化劑的波長的光進(jìn)行照射的方法產(chǎn)生了改善的 疫苗接種或改善的免疫應(yīng)答。
[0010] 如將在下面的實(shí)施例更詳細(xì)進(jìn)行描述的那樣，已經(jīng)證實(shí)本發(fā)明的方法產(chǎn)生了改進(jìn) 的疫苗接種或改進(jìn)的免疫應(yīng)答，例如，產(chǎn)生數(shù)量增加的抗原特異性T細(xì)胞。例如，圖1表明，與 僅用抗原和光敏化劑治療/照射相比，使用抗原、TLR配體(CpG寡核苷酸或咪唑并喹啉）、光 敏化劑在小鼠體內(nèi)疫苗接種，并用有效激活光敏化劑的波長的照射，導(dǎo)致小鼠血液和脾臟 中抗原特異性T細(xì)胞的百分比顯著增加。在體內(nèi)采用一系列其他TLR配體例如聚（1C)、咪喹 莫特和MPLA的實(shí)施例中，也表現(xiàn)出協(xié)同效應(yīng)。因此，本發(fā)明人已證明，在體內(nèi)使用本發(fā)明方 法中的多種TLR配體也可以實(shí)現(xiàn)免疫應(yīng)答的協(xié)同改進(jìn)。
[0011] 雖然不希望受理論的束縛，但據(jù)信本發(fā)明的方法導(dǎo)致在MHC I類分子的抗原呈遞 提高，使得CD8+T細(xì)胞應(yīng)答增加，因而改善了疫苗接種方法。如下面所討論，本申請一些實(shí)施 例利用〇T-1細(xì)胞的模型系統(tǒng)，該系統(tǒng)用于評估MHC I類呈遞（參見例如De 1 amarre等 J.Exp.Med. 198:111-122，2003)。在該模型系統(tǒng)中，抗原表位SIINFEKL的MHC I類呈遞導(dǎo)致 0T-1T細(xì)胞活化，并且所述活化可通過抗原特異性T細(xì)胞的增殖的增加或者IFNy或IL-2的 產(chǎn)量的增加來測定。本發(fā)明方法的結(jié)果顯示抗原特異性T細(xì)胞的數(shù)量增加，以及由T細(xì)胞產(chǎn) 生的IL-2和IFNy增加，這與增加或改善的抗原呈遞相關(guān)。
[0012] 因此，在本發(fā)明的第一方面，提供了一種在細(xì)胞的表面上表達(dá)抗原分子或其一部 分的方法，所述方法包括使所述細(xì)胞接觸所述抗原分子、光敏化劑、和TLR配體，并用有效活 化所述光敏化劑的波長的光照射所述細(xì)胞，其中，所述抗原分子釋放到所述細(xì)胞的胞漿中， 并且所述抗原分子或其一部分隨后呈遞在所述細(xì)胞表面上。
[0013]優(yōu)選的是，該方法（以及之后描述的方法)僅利用所述方法中的上述三種活性成分 (試劑），并且所述試劑在該方法中以適當(dāng)水平(例如，下述的最小水平)存在，從而可影響本 發(fā)明的效果（即，在增強(qiáng)PCI疫苗接種/抗原呈遞/免疫應(yīng)答刺激中有積極作用）。因此，優(yōu)選 的是所述試劑存在于不具有其他活性成分的緩沖液中。
[0014] 在所述方法中，所述抗原分子和所述光敏化劑以及可選的本文所述的TLR配體各 自被攝取至胞內(nèi)囊泡中；當(dāng)照射細(xì)胞時(shí)，胞內(nèi)囊泡的膜破裂，將抗原分子釋放到所述細(xì)胞的 胞漿中。
[0015] 各種試劑可以相對于彼此被攝取至相同或不同的胞內(nèi)囊泡中。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，由光敏 化劑產(chǎn)生的活性物質(zhì)可延伸到包含該光敏化劑的囊泡外，和/或囊泡可融合從而使囊泡內(nèi) 容物通過與破裂的囊泡融合而釋放。在本文中提到的"攝取"表示所攝取的分子被完全包含 在囊泡內(nèi)。胞內(nèi)囊泡由膜包繞，并且可以是在內(nèi)吞后形成的任何這類囊泡，例如核內(nèi)體或溶 酶體。
[0016] 本文中所用的"破裂的"區(qū)室是指對該區(qū)室的膜的完整性永久或臨時(shí)的破壞，該破 壞足以使其中容有的抗原分子釋放。
[0017] 本文中所用的"光敏化劑"是能夠在所述試劑受適當(dāng)波長和強(qiáng)度的照射后活化而 產(chǎn)生活性物質(zhì)時(shí)，將吸收的光能轉(zhuǎn)化為化學(xué)反應(yīng)的化合物。這些過程的高反應(yīng)性終產(chǎn)物可 產(chǎn)生細(xì)胞毒性和血管毒性。方便的是，所述光敏化劑可以是定位到細(xì)胞內(nèi)區(qū)室、特別是核內(nèi) 體或溶酶體的光敏化劑。
[0018] 光敏化劑可以通過許多機(jī)制直接或間接地發(fā)揮其作用。因此，例如，某些光敏化劑 在通過光活化時(shí)直接變?yōu)橛卸?，而另一些光敏化劑起到產(chǎn)生毒性物種的作用，所述毒性物 種例如為氧化劑，如單線態(tài)氧或其他反應(yīng)性氧物質(zhì)，它們對于如脂質(zhì)、蛋白和核酸等細(xì)胞物 質(zhì)和生物分子破壞性極強(qiáng)。
[0019] 多種所述光敏化劑是本領(lǐng)域中已知的，在文獻(xiàn)(包括W096/07432,通過引用將其并 入本文）中所有描述，并且可用于本發(fā)明的方法。存在許多已知光敏化劑，包括卟啉、酞菁、 紅紫素、二氫卟吩、苯并卟啉、親溶酶體(lysomotropic)弱堿、萘酞菁、陽離子染料和四環(huán)素 或它們的衍生物（Berg等，（1997)，J.Photochemistry and Photobiology ,65,403-409)。其 他光敏化劑包括特沙弗林、脫鎂葉綠酸(pheophorbides)、類卟吩(porphycenes)、菌綠素 (bacteriochlorin)、酮綠素類(ketochlorins)、血卟啉衍生物和5-氨基乙酰丙酸及其衍生 物誘導(dǎo)的內(nèi)源性光敏劑、光卟啉、光敏化劑二聚體或其他偶聯(lián)物。
[0020] 卟啉是最廣泛研究的光敏化劑。其分子結(jié)構(gòu)包括通過次甲基橋連接在一起的四個(gè) 吡咯環(huán)。它們是經(jīng)常能夠形成金屬絡(luò)合物的天然化合物。例如，在氧轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白血紅素的情形 中，鐵原子被引入血紅素B的卟啉核中。
[0021] 二氫卟吩是大的雜環(huán)芳香環(huán)，其核心處由通過四個(gè)次甲基鍵偶聯(lián)的三個(gè)吡咯和一 個(gè)吡咯啉構(gòu)成。因此，不像卟啉，二氫卟吩在很大程度上是芳香性的，但不是在整個(gè)環(huán)呈現(xiàn) 出芳香性。
[0022] 本領(lǐng)域技術(shù)人員可理解哪種光敏化劑適合用于本發(fā)明。特別優(yōu)選的是定位到細(xì)胞 核內(nèi)體或溶酶體的光敏化劑。因此，光敏化劑優(yōu)選是被攝取到溶酶體或核內(nèi)體的內(nèi)區(qū)室中 的試劑。優(yōu)選的是，光敏化劑通過內(nèi)吞攝取到細(xì)胞內(nèi)區(qū)室中。優(yōu)選的光敏化劑是二磺化酞菁 鋁和四磺化酞菁鋁（例如AlPcS 2a)、磺化四苯基卟啉（TPPSn)、磺化四苯基菌綠素（例如 IPBS2a)、尼羅河藍(lán)、二氫卟吩e 6衍生物、尿卟啉I、葉赤素、血卟啉和亞甲基藍(lán)?？捎糜诒景l(fā)明 的其他合適的光敏劑在W003/020309(通過引用將其并入本文）中有所描述，即，磺化間四苯 基二氫卟吩，優(yōu)選TPCS 2a。優(yōu)選的光敏化劑是兩親性光敏化劑(例如二磺化光敏化劑），如兩 親性酞菁、撲啉、二氫卟吩和/或菌綠素，特別包括TPPS 2a(二磺酸四苯基卟啉）、AlPcS2a(二 磺酸酞菁鋁）、TPCS2a(二磺酸四苯基二氫卟吩）和TPBS 2a(二磺酸四苯基菌綠素）、或其藥學(xué) 可接受的鹽。此外，還優(yōu)選親水性光敏化劑，例如TPPS4(四磺酸間四苯基卟啉）。特別優(yōu)選的 光敏化劑是磺化酞菁鋁、磺化四苯基卟啉、磺化四苯基二氫卟吩和磺化四苯基菌綠素，優(yōu)選 TPCS 2a、AlPcS2a、TPPS4和TPBS2a。在本發(fā)明特別優(yōu)選的實(shí)施方式中，光敏化劑是二氫卟吩 TPCS 2a (二磺化四苯基二氫卟吩，例如Amphinex ?)。
[0023] 光敏化劑可與載劑連接，從而提供光敏化劑。因此，在本發(fā)明該實(shí)施方式的優(yōu)選的 方面，所述光敏化劑是光敏化劑和式(I)限定的殼聚糖的綴合物：
[0025]其中，
[0026] n是大于或等于3的整數(shù)；
[0027] R在所述化合物中出現(xiàn)n次，并且
[0028] 所述總的Rn基團(tuán)的0.1 %~99.9% (優(yōu)選0.5%~99.5% )中，各R是選自以下的基 團(tuán)A:
[0030] 其中，各Ri可以相同或不同，選自H、CH3和-(CH2)b-CH 3;a是1、2、3、4或5;并且b是0、 1、2、3、4或5(其中反荷離子可以為例如CD;優(yōu)選的是辦是?并且b是1，
[0031] 和
[0033] 其中，Y為0、S、S02、-NCH3 或，(〇12)<]〇13;0 = 1、2、3、4或5;并且(1=1、2、3、4或5，優(yōu)選 Y是NCH3并且c是1，
[0034] 其中，各R基團(tuán)可以相同或不同，并且
[0035] 所述總的Rn基團(tuán)的0.1 %~99.9% (優(yōu)選0.5%~99.5% )中，各R是選自以下的基 團(tuán)B:
，和
[0037] 其中，
[0038] e是〇、1、2、3、4或 5;并且f是1、2、3、4或 5;優(yōu)選e 和f = l，
[0039] R2是選自以下的基團(tuán) 和
[0041 ] W是選自0、S、NH或N(CH3)的基團(tuán)，優(yōu)選是NH，
[0042] R3是選自以下的基團(tuán)
[0045] V是選自C0、S02、P0、P02H或CH2的基團(tuán)，優(yōu)選的是C0，和
[0046] R4是選自 H、-OH、-0CH3、-CH3、-COCH3、C (CH3) 4、-NH2，-NHCH3、-N (CH3) 2 和-NC0CH3、優(yōu) 選H的基團(tuán)（取代在鄰、間或?qū)ξ唬?，其可以相同或不同，其中，各R基團(tuán)可以相同或不同。 [0047] 殼聚糖聚合物具有至少3個(gè)單元(n = 3)。然而，優(yōu)選n是至少10、20、50、100、500、 1000,例如10至100或10至50。
[0048]在優(yōu)選的實(shí)施方式中，R2選自
[0050]在另一優(yōu)選的實(shí)施方式中，R3選自
[0052] 優(yōu)選的是 R2 或 R3 是 TPPa、TPCalSTPCcl。
[0053] 基團(tuán)A可提供70至95%的總Rn基團(tuán)，基團(tuán)B可提供5至30%的總Rn基團(tuán)。
[0054]在最優(yōu)選的實(shí)施方式中，光敏化劑和殼聚糖的綴合物選自（見圖4中示意圖1-5B的 編號(hào)）：
[0055] 17:B:25% ,A:75%
[0057] 19:B:25% ,A:75%
[0063] 在上述結(jié)構(gòu)中，所給出的A/B%值是指基團(tuán)A或B占 Rn基團(tuán)的比例。星號(hào)表示殼聚糖 聚合物的其余部分。
[0064] 這些化合物可通過利用本領(lǐng)域標(biāo)準(zhǔn)程序的合成方法制備，本領(lǐng)域技術(shù)人員對此熟 悉。例如，編號(hào)17、19、33和37的下述優(yōu)選綴合物的合成如圖4的反應(yīng)示意圖1-5B所示(并且 還見圖4說明）。
[0065] 本文所使用的"抗原"分子是這樣的分子，其中當(dāng)以適當(dāng)方式提呈至免疫系統(tǒng)或免 疫細(xì)胞時(shí)，該分子或其一部分能夠刺激免疫應(yīng)答。因此有利的是，所述抗原分子將成為疫苗 抗原或疫苗組分，如含有多肽的實(shí)體。
[0066] 許多這種抗原或抗原疫苗組分在本領(lǐng)域中是已知的，并包括所有方式的細(xì)菌或病 毒抗原，或者實(shí)際上任何致病菌種(包括原生動(dòng)物或高等生物體）的抗原或抗原組分。雖然 傳統(tǒng)上疫苗的抗原組分已包括整個(gè)生物體(無論是活的、死的還是減毒的），即全細(xì)胞疫苗， 但是除此以外，亞基疫苗（sub-unit vaccine)，即，基于生物體的特定抗原組分(例如蛋白 或肽，甚至碳水化合物)的疫苗已被廣泛研究并報(bào)道在文獻(xiàn)中。任何此類基于"亞基"的疫苗 組分均可以用作根據(jù)本發(fā)明的抗原分子。
[0067] 然而，本發(fā)明特別可用在肽疫苗領(lǐng)域中。因此，根據(jù)本發(fā)明的優(yōu)選抗原分子是肽 (其如本文中所限定，包括長度較短和較長的肽，即，肽、寡肽或多肽，以及蛋白分子或其片 段，例如，5~500、例如10~250、如15~75或8~25個(gè)氨基酸的肽）。
[0068]非常大量的肽疫苗候選物已在文獻(xiàn)中提出，例如在病毒性疾病和感染，如AIDS/ HIV感染或流感、犬細(xì)小病毒、牛白血病病毒、肝炎等的治療中（參見例如Phanuphak等， Asian Pac.J.Allergy.Immunol.1997,15(1),41-8；Naruse,Hokkaido Igaku Zasshil994, 69(4) ,811-20;Casal 等，J.Virol.，1995,69(11)，7274-7;Belyakov等， Proc.Natl.Acad.Sci.USA,1998,95(4)，1709-14;Naruse等，Proc.Natl.Sci.USA,1994 91 (20)，9588-92;Kabeya等，Vaccine 1996, 14(12)，1118_22;Itoh等， Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1986,83(23)9174-8)。類似地，可以使用細(xì)菌肽，事實(shí)上也可以 使用源于其他生物體或物種的肽抗原。
[0069] 除源于病原微生物的抗原之外，肽也已被提出用作針對癌癥或如多發(fā)性硬化癥等 其他疾病的疫苗。例如，突變癌基因肽非常有希望成為在細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞的刺激方面充 當(dāng)抗原的癌癥疫苗（Schirrmacher，Journal of Cancer Research and Clinical Oncology 1995,121,443-451；Curtis Cancer Chemotherapy and Biological Response Modifiers ,1997,17,316-327)。合成肽疫苗用于轉(zhuǎn)移性黑色素瘤的治療也已得到評價(jià) (Rosenberg等，Nat .Med. 1998，4(3)，321-7)。用于多發(fā)性硬化癥的治療的T細(xì)胞受體肽疫苗 描述于Wilson等，J.Neuroimmunol ? 1997,76(1-2)，15-28中。任何此類肽疫苗組分均可以用 作本發(fā)明的抗原分子，事實(shí)上因?yàn)槲墨I(xiàn)中描述或提出作為肽疫苗的任何肽也可以。肽因此 可以是合成的或分離的肽，或者是源于生物體。
[0070] 本發(fā)明優(yōu)選的實(shí)施方式中，抗原是黑色素瘤抗原。"黑色素瘤抗原"可包括一種或 多種不同的抗原。
[0071] 例如，在一方面，黑色素瘤抗原是黑色素瘤蛋白或肽，例如抗原肽或T-細(xì)胞表位， 例如選自gpl〇〇、Melan-A、酪氨酸酶、MAGE-l、MAGE-3和酪氨酸酶相關(guān)蛋白-2(TRP-2)中的一 種或多種或其肽表位。這些和其他合適的黑色素瘤抗原在Renkvist等，Cancer Immunol. Immunother ? 50: 3-15，2001 (及其中的參考文獻(xiàn)）和Hodi，Clin ? Cancer ? Res ? 12: 673-678，2006中有所公開，將它們通過引用并入本文。特別是，gplOO、Melan-2、酪氨酸酶、 MAGE-1、MAGE-3和TRP-2及其肽表位在Renkvi st等（同上）中有所描述。因此，本發(fā)明外延至 gp100 、Melan-2、酪氨酸酶、MAGE-l、MAGE-3或TRP-2,或包括它們經(jīng)公開的肽表位或由這些 肽表位組成的抗原（公開于Renkvist等，同上），或與其具有至少95%序列同一性(利用本領(lǐng) 域一致的標(biāo)準(zhǔn)比較技術(shù)，在相關(guān)比較窗口中）的序列的應(yīng)用。優(yōu)選的實(shí)施方式中，抗原是 TRP-2 和/或 gp 100，優(yōu)選TRP-2。
[0072] 肽抗原，例如長達(dá)至少200個(gè)氨基酸的肽抗原，可獲自進(jìn)行定制肽合成的公司，例 如United BioSystems Inc(前United peptide Corp ?，Herndon，VA，美國）。
[0073] 在替代性優(yōu)選的實(shí)施方式中，抗原分子源自人乳頭瘤病毒(HPV)。乳頭瘤病毒基因 組分為早期區(qū)域(E)和晚期區(qū)域(L)，早期區(qū)域(E)編碼6個(gè)化^244』546和￡7)開放閱讀 框(0RF)，它們在最初感染宿主細(xì)胞后即刻表達(dá);晚期區(qū)域(L)編碼主要衣殼蛋白L1和次要 衣殼蛋白L2。所有病毒0RF編碼在一個(gè)DNA鏈中。
[0074] 在優(yōu)選的實(shí)施方式中，抗原分子包括蛋白或肽、或其片段，即，來自人乳頭瘤病毒 (HPV)的抗原(例如，源自所述病毒），其優(yōu)選是本文所述的早期或晚期蛋白中的一種或其一 部分。因此，HPV抗原可以是一種或多種已知抗原肽或T-細(xì)胞表位，例如選自任何類型HPV的 一種或多種任何已知抗原。HPV類型和抗原的具體情況可見于Ma等，Current Cancer Therapy Reviews 6:81-103,2010〇
[0075] 例如，抗原肽可源自HPV-16和/或HPV-18型HPV或31型或45型HPV。例如，抗原可源 自任何￡1、￡2、￡445、￡6或￡7蛋白或任何11和12蛋白?？乖目稍醋詢裕?16和18的￡2、￡6和 E7蛋白中的一種或多種。在優(yōu)選的實(shí)施方式中，抗原分子包含HPV-16E7序列GQAEPD RAHYMIVTFCCKCDSTLRLCVQSTHVDIR(CD8表位以粗體字表示）。因此，HPV抗原可以是35個(gè) 氨基酸的肽。作為另選，抗原分子可僅為CD8表位RAHYNIVTF，即更短的肽。
[0076] HPV肽抗原可獲自進(jìn)行定制肽合成的公司，例如United BioSystems Inc(前 United peptide Corp ?，Herndon，VA,美國）。
[0077] -旦通過光化學(xué)內(nèi)化法釋放在細(xì)胞胞衆(zhòng)中，抗原分子可以通過細(xì)胞的抗原加工機(jī) 構(gòu)而加工。因此，根據(jù)本發(fā)明表達(dá)或呈遞在細(xì)胞表面上的抗原分子可以是被內(nèi)化(胞吞）的 抗原分子的部分或片段。所呈遞或表達(dá)的抗原分子的"一部分"優(yōu)選包括通過細(xì)胞內(nèi)的抗原 加工機(jī)構(gòu)產(chǎn)生的部分。然而，所述部分也可以通過其他方式(通過適當(dāng)?shù)目乖O(shè)計(jì)實(shí)現(xiàn)，例 如pH敏感的鍵)或通過其他細(xì)胞加工方式產(chǎn)生。通常，所述部分的尺寸足以產(chǎn)生免疫應(yīng)答， 例如在大于5個(gè)、例如大于10或20個(gè)氨基酸的肽的情形中。
[0078] 本發(fā)明增強(qiáng)PCI介導(dǎo)的疫苗接種的試劑是Toll樣受體(TLR)的配體。Toll樣受體是 在先天免疫系統(tǒng)以及消化系統(tǒng)中起關(guān)鍵作用的一類蛋白。TLR和白細(xì)胞介素-1受體形成受 體超家族，命名為白細(xì)胞介素-1受體/Toll樣受體超家族。這個(gè)家族的所有成員具有Toll-IL-1受體結(jié)構(gòu)域(TIR)。白細(xì)胞介素-1受體(IL-1R)家族的成員特征為細(xì)胞外免疫球蛋白樣 域和細(xì)胞內(nèi)Toll/白細(xì)胞介素-IR(TIR)域。具有亞族2TIR域的受體被視為TLR。
[0079] TLR是單一跨膜的非催化性的受體，通常表達(dá)在前哨細(xì)胞如巨噬細(xì)胞和樹突細(xì)胞 中，這些細(xì)胞識(shí)別來自微生物的結(jié)構(gòu)保守分子。一旦這些微生物突破如皮膚或腸道粘膜等 物理屏障，它們就被Toll樣受體識(shí)別，從而激活免疫細(xì)胞反應(yīng)。這些受體識(shí)別如病原相關(guān)分 子等分子，所述分子據(jù)信對病原體的功能至關(guān)重要且難以通過突變改變。它們可包括:細(xì)菌 細(xì)胞表面脂多糖(LPS)、脂蛋白、脂肽和脂阿拉伯甘露糖；蛋白，如來自細(xì)菌鞭毛的鞭毛蛋 白；病毒的雙鏈RNA;或細(xì)菌和病毒DNA的未甲基化CpG島；和在真核DNA的啟動(dòng)子中發(fā)現(xiàn)的 CpG島；以及某些其它RNA和DNA分子。對于大多數(shù)TLR，配體識(shí)別特異性現(xiàn)已通過基因靶向確 立。
[0080] 據(jù)估計(jì)，大多數(shù)哺乳動(dòng)物物種具有10到15種類型的Toll樣受體。人和小鼠中一共 鑒定出13種TLR(簡稱TLR1至TLR13)(小鼠中13種，人中10種）。
[0081] 本發(fā)明涵蓋了 TLR的所有配體。術(shù)語〃配體〃用于表示與生物分子形成復(fù)合物以達(dá) 到生物學(xué)目的的物質(zhì)。在TLR配體的情況中，其為信號(hào)觸發(fā)分子，與靶標(biāo)TLR上的位點(diǎn)結(jié)合。 當(dāng)配體與其同源受體結(jié)合，其改變受體的化學(xué)構(gòu)象。受體蛋白的構(gòu)象狀態(tài)決定其功能狀態(tài)。 [0082]因此，本發(fā)明的TLR配體是結(jié)合至少一種、或一種或多種toll樣受體(TLR)并導(dǎo)致 TLR活化、例如TLR介導(dǎo)的細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)活化的分子。
[0083] TLR信號(hào)傳導(dǎo)分為兩種不同信號(hào)傳導(dǎo)途徑，MyD88依賴的途徑和TRIF依賴的途徑。 本發(fā)明TLR配體激活所述兩種途徑中的一種或兩種。因此，本發(fā)明的配體是結(jié)合一種或多種 TLR并活化TLR的分子，例如通過配體結(jié)合導(dǎo)致受體構(gòu)象改變來激活TLR信號(hào)傳導(dǎo)。
[0084] MyD88依賴性響應(yīng)在TLR受體二聚化時(shí)發(fā)生，并且由除TLR3之外的每種TLR利用。它 的主要作用是活化NFkB和絲裂原活化蛋白激酶。受體中發(fā)生的配體結(jié)合和構(gòu)象變化募集接 頭蛋白MyD88，其是TIR家庭成員。MyD88然后募集IRAK4、IRAK和IRAK2。IRAK激酶然后使蛋白 TRAF6磷酸化并活化，該蛋白進(jìn)而將蛋白TAK1及其本身多泛素化，從而促進(jìn)與IKKP結(jié)合。在 結(jié)合時(shí)，TAK1使IKKP磷酸化，然后IKKP使IKB磷酸化導(dǎo)致其降解，并允許NFKB擴(kuò)散到細(xì)胞核 中，激活轉(zhuǎn)錄，并隨后誘導(dǎo)炎性細(xì)胞因子。
[0085] 另一途徑是TRIF依賴的途徑，其被TLR3和TLR4采用。對于TLR3,雙鏈RNA(或類似 的，見下文)導(dǎo)致受體激活，募集接頭蛋白TRIFJRIF激活激酶TBK1和RIP1，這會(huì)在信號(hào)傳導(dǎo) 通路中產(chǎn)生支路。TRIF/TBK1信號(hào)傳導(dǎo)復(fù)合物將IRF3磷酸化，允許其移位至細(xì)胞核中，并產(chǎn) 生I型干擾素。同時(shí)，RIP1的激活以與MyD88-依賴的途徑相同的方式，導(dǎo)致TAK1的泛素化和 活化和NFkB轉(zhuǎn)錄。
[0086]用于確定TLR信號(hào)傳導(dǎo)的激活的標(biāo)準(zhǔn)方法在本領(lǐng)域中是公知的，例如確定適當(dāng)?shù)?信號(hào)傳導(dǎo)蛋白的磷酸化狀態(tài)。作為另選，可以通過本領(lǐng)域中公知的方法確定配體是否通過 TLR起作用，例如通過基因刪除編碼特定TLR的基因，并確定配體的作用是否被保留。這種方 法可以用于體外和轉(zhuǎn)基因敲除小鼠體內(nèi)，轉(zhuǎn)基因敲除小鼠可商購(TLR2、3和4敲除體可獲自 The Jackson Laboratory，TLR1、2、3、4、5、6、7和9敲除體可獲自 OrientalBioService Inc)。此外，可用的有HEK-Blue?細(xì)胞（Invivogen，San Diego，CA，美國），所述細(xì)胞被設(shè)計(jì)為 通過測定NF-kB/API活化而研究TLR的刺激?？色@得用于TLR2-9和13的這種細(xì)胞。另外，TLR 詰抗劑，例如那些可從Invi vogen獲得的TLR詰抗劑可用于確定TLR的詰抗作用是否抑制推 定配體的作用。因此，確定分子是否是TLR配體、例如特定TLR配體的方法是本領(lǐng)域中公知 的。
[0087] TLR的結(jié)構(gòu)由富含亮氨酸重復(fù)序列（LRR)胞外結(jié)構(gòu)域、螺旋跨膜結(jié)構(gòu)域和細(xì)胞內(nèi) Toll/IL-1受體同源(TIR)信號(hào)傳導(dǎo)結(jié)構(gòu)域構(gòu)成。胞外結(jié)構(gòu)域含有不同數(shù)量的LRR并類似于 彎曲成馬蹄鐵形的螺線管。在兩端存在遮蔽馬蹄鐵體的疏水核心的末端LRR。這些胞外結(jié)構(gòu) 域是高度可變的。它們直接參與識(shí)別多種病原體相關(guān)基序，包括脂多糖、脂肽、胞嘧啶-磷 酸-鳥嘌呤(CpG)DNA、鞭毛蛋白、咪唑并喹啉、和ds/ssRNA。當(dāng)受體活化后，TIR信號(hào)傳導(dǎo)復(fù)合 物在受體和接頭蛋白TIR域之間形成。
[0088]受體TLR7、8和9是具有比其他TLR更長的氨基酸序列的家族。它們定位細(xì)胞內(nèi)并響 應(yīng)于非自身的核酸而發(fā)出信號(hào)。它們也在其LRR14和15之間包含不規(guī)則鏈段。
[0089] TLR受體的序列是已知的，并且可按照例如前文所述評價(jià)本文中所描述配體對受 體的結(jié)合。例如，已知的TLR氨基酸序列示于下表1中。
[0090] 表 1
[0091]
[0092] TLR1是細(xì)胞表面受體，其配體包括脂蛋白和多種三酰脂肽，例如來自細(xì)菌的那些。 TLR1自身不識(shí)別配體，而是以與TLR2形成的復(fù)合物起作用。因此，配體識(shí)別TLR1與TLR2的復(fù) 合物。TLR1識(shí)別與TLR2(作為異源二聚體)組合的肽聚糖和(三?；?脂蛋白。
[0093] 脂蛋白/肽是由與蛋白/肽連接的脂質(zhì)構(gòu)成的分子。細(xì)菌表達(dá)這種分子。三?；?蛋白/肽包括3個(gè)?；?。優(yōu)選的是，用于本發(fā)明的TLR1配體是三酰脂肽。
[0094] TLR1 配體可購自 Invivogen或Enzo Life Sciences(Farmingdale，NY，美國）。例 如，Pam3CSK4(InViV〇gen)是合成的三?；?LP)，其模擬了細(xì)菌LP的?；被?。 [00 95]作為另選，可使用Pam3Cys-Ser_(Lys)4三鹽酸鹽（Enzo Life Sciences)，其是與 TLR2復(fù)合的TLR1的選擇性激動(dòng)劑。
[0096] TLR2是被各種各樣的微生物分子刺激的細(xì)胞表面受體，所述微生物分子代表了革 蘭氏陽性菌和革蘭氏陰性菌以及支原體和酵母的廣泛物種群。TLR2識(shí)別革蘭氏陽性菌的細(xì) 胞壁組分如肽聚糖、脂磷壁酸和脂蛋白、分枝桿菌的脂阿拉伯甘露糖和酵母細(xì)胞壁的酵母 聚糖。
[0097] 優(yōu)選的TLR2配體為脂聚糖，如脂阿拉伯甘露糖和恥垢分枝桿菌的脂甘露聚糖。特 別優(yōu)選的脂聚糖是具有對TLR2特異性的脂多糖(LPS)。這些分子具有通過共價(jià)鍵連接的脂 質(zhì)和多糖，且見于革蘭氏陰性菌的外構(gòu)件中，并充當(dāng)內(nèi)毒素。在優(yōu)選特征中，LPS來自牙齦卟 啉菌。LPS由通過稱為脂質(zhì)A的特定糖脂部分錨定在外細(xì)菌膜中的多糖區(qū)域構(gòu)成。脂質(zhì)A也是 內(nèi)毒素，其引起LPS的免疫刺激活性。
[0099] (Lipid A =脂質(zhì)A;〇-antigen = 〇-抗原；repeat 40units =重復(fù)40個(gè)單元；Core poly saccharide =核心多糖；Di saccharide diphosphate =二磷酉愛二糖；Fatty acids =月旨 肪酸）
[0100] 脂質(zhì)A的最具活性形式含有6個(gè)脂肪?；⒋嬖谟诓≡绨ＯＪ洗竽c桿菌和沙 門氏菌中。
[0101 ]其他優(yōu)選的TLR2配體有:脂磷壁酸，例如，源自諸如枯草桿菌和金黃色葡萄球菌等 不同細(xì)菌屬的脂磷壁酸;肽聚糖，例如源自諸如枯草桿菌、埃希氏大腸桿菌菌株(例如0111: B4或K12)、金黃色葡萄球菌等等細(xì)菌屬的肽聚糖;合成脂蛋白，如合成二?；鞍谆蚝?成三酰基化脂蛋白；和酵母聚糖(例如來自釀酒酵母），其為重復(fù)葡萄糖單元由0-1，3_糖苷 鍵連接的葡聚糖。TLR2配體可商購自Invivogen。
[0102] TLR3見于細(xì)胞區(qū)室中。本發(fā)明優(yōu)選的配體為模擬病毒dsRNA的雙鏈RNA分子，例如 聚腺苷酸-聚尿苷酸(P〇ly(A:U))或聚肌苷酸-聚胞苷酸(Poly(I:C))。特別優(yōu)選Poly(I:C)。
[0103] 雙鏈RNA(dsRNA)是具有互補(bǔ)雙鏈的RNA，與所有細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)的DNA相似。dsRNA形成 某些病毒(雙鏈RNA病毒）的遺傳物質(zhì)。雙鏈RNA如病毒RNA或siRNA可觸發(fā)真核細(xì)胞中的RNA 干擾，以及脊椎動(dòng)物中的干擾素應(yīng)答。
[0104] 在優(yōu)選的特征中，配體是Poly^ChPoly I:C是一條鏈為肌苷酸聚合物、另一條 鏈為胞苷酸聚合物的錯(cuò)配雙鏈RNA。這種分子可通過公知技術(shù)制備。存在各種商購來源，例 如可購自Invivogen的以下物質(zhì)，并形成優(yōu)選的實(shí)施方式：
[0105] -Poly(I:C)(HMW)，具有高分子量，平均尺寸為1.5kb_8kb，和
[0106] -Poly(I:C)(LMW)，具有低分子量，平均尺寸為0.2kb_lkb。
[0107] 高分子量和低分子量形式均是用于本發(fā)明的優(yōu)選形式。
[0108] TLR4也存在于細(xì)胞表面，并具有數(shù)種配體類型，尤其包括脂多糖(LPS)、數(shù)種熱休 克蛋白、纖維蛋白原、硫酸肝素片段、透明質(zhì)酸片段、鎳和各種阿片類藥物。在一個(gè)優(yōu)選方 面，配體是LPS1PS可源自各種細(xì)菌物種，例如埃希氏大腸桿菌0111:B4或K12或沙門氏菌 (通過酚-水混合物提取），在優(yōu)選的特征中，LPS源自埃希氏大腸桿菌或明尼蘇達(dá)沙門氏菌， 例如菌株R595。在另一優(yōu)選的方面，TLR4配體是單磷酰脂A(MPLA)，其可從細(xì)菌(例如明尼蘇 達(dá)沙門氏菌R595)中分離或通過合成制備。通常，TLR4配體可商購自例如Invi vogen。
[0109] TLR5結(jié)合來自革蘭式陽性菌和革蘭氏陰性菌的配體鞭毛蛋白，如枯草桿菌、銅綠 假單胞菌和鼠傷寒沙門氏菌等。鞭毛蛋白是球狀蛋白，將其自身排列為空心圓筒從而形成 細(xì)菌鞭毛中的細(xì)絲。其具有約30,000至60,000道爾頓的質(zhì)量。鞭毛蛋白是細(xì)菌鞭毛的主要 取代物，大量存在于幾乎所有有鞭毛的細(xì)菌中。因此，優(yōu)選的TLR5配體是鞭毛蛋白，優(yōu)選來 自如上所述的細(xì)菌。TLR5配體可商購自例如Invivogen。
[0110] TLR6結(jié)合多種二酰脂肽。如上所述，脂肽存在于細(xì)菌中，并包含與肽連接的脂質(zhì)。 二酰脂肽具有2個(gè)?；?，并形成用于本發(fā)明的優(yōu)選TLR6配體。TLR6配體可商購自Invivogen。 例如，F(xiàn)SL-l(Pam2CGDPKHPKSF)是來自唾液支原體的與MALP-2相似的合成脂蛋白，MALP-2是 源自發(fā)酵支原體的脂肽(LP)。支原體LP(如FSL-1)含有二酰基化的半胱氨酸殘基，而細(xì)菌LP 含有三?；陌腚装彼釟埢SL-1被TLR6與TLR2的組合識(shí)別，而細(xì)菌LP被TLR2和TLR1的 組合識(shí)別。
[0111] TLR7配體包括小的合成化合物咪唑并喹啉、如腺嘌呤和鳥苷類似物（例如洛索立 賓)等堿基類似物和溴匹立明，以及單鏈RNA。
[0112]咪唑并喹啉化合物是雙環(huán)有機(jī)分子，優(yōu)選具有下式，其中辦和此處的基團(tuán)可變。 [0113]優(yōu)選的是，咪唑并喹啉化合物具有式1或其藥學(xué)可接受的鹽：
[0115] 其中，是氨基烷基，其可選地取代有例如羥基，并且R2是烷基，且可選地間插有氧 或氮基團(tuán)；其中，優(yōu)選的是
[0116] 辦是^012-(：(013)2-1?3;
[0117] R2 是-CH2-X-CH2CH3 或氫原子；
[0118] R3是0H或氫原子，并且X是0或NH。
[0119] 上式中，烷基可以為基團(tuán)。
[0120]這些化合物的實(shí)例在本領(lǐng)域中已知，例如雷西莫特(或R848)(l-[4-氨基_2_(乙氧 基甲基)咪唑并[4,5-c]喹啉-1-基]-2-甲基丙-2-醇）、咪喹莫特(3-(2_甲基丙基)-3,5,8_ 三氮雜三環(huán)[7.4.9.0 2'6]十三碳-1(9)，2(6)，4,7，10，12-己烷-7-胺）和嘎德莫特(1?1是1 CH2-C (CH3) 2〇H; R2是-CH2-NH-CH2CH3; 1 - [ 4-氨基-2-(乙基氨基甲基）咪唑并[4，5-C ]喹啉-1 -基]-2-甲基丙-2-醇）（均可獲自InvivoGen(San Diego CA,美國））。在優(yōu)選的實(shí)施方式中， 化合物選自雷西莫特和咪喹莫特。
[0121] 這些化合物的藥學(xué)可接受鹽也涵蓋在本發(fā)明中。合適的鹽包括例如乙酸鹽、溴鹽、 氯鹽、檸檬酸鹽、鹽酸鹽、馬來酸鹽、甲磺酸鹽、硝酸鹽、磷酸鹽、硫酸鹽、酒石酸鹽、油酸鹽、 硬脂酸鹽、甲苯磺酸鹽、鈣鹽、葡甲胺鹽、鉀鹽和鈉鹽。
[0122] 洛索立賓是在N7和C8位衍生化的鳥苷類似物。這種核苷是免疫系統(tǒng)的非常強(qiáng)力的 刺激劑。
[0123] 溴匹立明是具有抗癌和抗病毒性質(zhì)的試驗(yàn)藥物，結(jié)構(gòu)如下所示：
[0125] 單鏈RNA是優(yōu)選的TLR7配體，例如ssPolyU，其中，優(yōu)選的是所述單鏈分子長度為20 至200個(gè)核苷酸。所述分子容易通過合成制備。
[0126] TLR8配體是通常較小的合成化合物或單鏈RNA。優(yōu)選的是所述TLR8配體是上述 ssPolyU 分子。
[0127] TLR9配體包括未甲基化的CpG寡脫氧核苷酸DNAXpG〃寡核苷酸（或CpG 0DN)是所 述配體的實(shí)例，是胞嘧啶三磷酸脫氧核苷酸(〃C〃)與鳥嘌呤三磷酸脫氧核苷酸(〃G〃)結(jié)合形 成的短單鏈合成DNA分子?！╬〃是指連續(xù)核苷酸之間的磷酸二酯鍵，不過某些0DN作為替代具 有經(jīng)修飾的硫代磷酸酯(PS)骨架。如本文所指代，CpG核苷酸稱為CpG基序。CpG基序未被甲 基化。包含CpG基序的序列被認(rèn)為是病原體相關(guān)的分子模式(PAMP)，這是因?yàn)樗鼈兇罅看嬖?于微生物基因組中，但在脊椎動(dòng)物基因組中極少。CpG PAMP被模式識(shí)別受體(PRR)To 11樣受 體9(TLR9)識(shí)別。TLR9識(shí)別特定的將微生物DNA與哺乳動(dòng)物DNA區(qū)分開的非甲基化CpG寡核苷 酸(0DN)序列。
[0128] 已經(jīng)描述了三種主要類型的刺激性0DN:A型、B型和C型。A型CPG 0DN由混合的磷酸 二酯/硫代磷酸酯骨架構(gòu)成，并含有一種或多種CpG基序作為回文序列的一部分。A型CPG 0DN具有位于3'和5'端的poly G尾部(促進(jìn)串聯(lián)體(concatemer)形成的結(jié)構(gòu)基序）j型CPG 0DN通常在一端或兩端含有7至10個(gè)硫代磷酸酯修飾的堿基，抵抗核酸酶的降解，并提高0DN 的穩(wěn)定性。例如，內(nèi)部回文序列長度可以為8至16(優(yōu)選的是10、12或14)個(gè)堿基對并在堿基 順序上有變化，然而，優(yōu)選的模式5'-0 Pu CG Pu:泛CG Py Py-3'，其中，與回文中心（以 ":"標(biāo)示)等距離的堿基Pu、Py互補(bǔ)。在DNA鏈任一末端的poly G尾部的長度可變。
[0129] B型CPG 0DN可具有一種或多種包含CpG基序的6聚體共有序列。人共有序列可包含 序列5'-Pu Py C G Py Pu-3'（小鼠序列可以不同型CPG 0DN具有完全硫代磷酸酯化(PS 修飾)的骨架，通常長度為18至28(例如18-22)個(gè)核苷酸。B型CPG 0DN的實(shí)例是0DN 1826,其 具有序列5 ' -tccatgacgttcctgacgtt-3 '。
[0130] C型CPG 0DN結(jié)合了A型和B型的特征。C型CPG 0DN完全由硫代磷酸酯核苷酸構(gòu)成， 并含有包含一種或多種CpG基序的回文序列。C型CpG 0DN的實(shí)例是0DN 2395,具有序列5'- tcgtcgttttcggcgc: gcgccg-3 '（下劃線為回文序列）。
[0131] 另外，還可以使用含有兩個(gè)回文序列的P型CpG 0DN，從而使它們形成更高級的結(jié) 構(gòu)。
[0132] CpG寡核苷酸可通過本領(lǐng)域已知的標(biāo)準(zhǔn)寡核苷酸合成方法來合成。
[0133] 因此，本發(fā)明的CpG寡核苷酸外延為6個(gè)至50個(gè)堿基(優(yōu)選18個(gè)至27個(gè)、優(yōu)選20個(gè)至 25個(gè)堿基）的單鏈寡核苷酸，，其包含至少一個(gè)CpG基序和各處在所述基序3 '和5 '側(cè)的至少 一個(gè)堿基，其中，所述CpG基序是胞嘧啶和其后以磷酸酯或硫代磷酸酯鍵連接的鳥嘌呤，其 中胞嘧啶的嘧啶環(huán)未被甲基化。在一個(gè)實(shí)施方式中，一個(gè)或多個(gè)基序側(cè)翼是與所述一個(gè)或 多個(gè)基序共同形成回文序列的序列。如本文所用的〃回文序列〃是指正向序列與反向的互補(bǔ) 序列連接，從而使該序列可形成發(fā)夾，例如 CggCgC:gCgCCg(其中，回文的中心以〃：〃標(biāo)示）。 CpG基序可形成序列的中心和/或位于回文序列中的其他部位。優(yōu)選的是，回文序列(包括正 向和反向序列）長度為8至16、優(yōu)選10至12或10至14個(gè)堿基。
[0134] 在另一優(yōu)選的方面，CpG寡核苷酸序列包含回文序列5'_Pu Pu CG Pu:Py CG Py Py-3'（其中，與回文中心（以":"標(biāo)示)等距離的堿基Pu、Py互補(bǔ))和/或一個(gè)或多個(gè)共有序列 5'-Pu Py CG Py Pu-3'?？蛇x地，CpG寡核苷酸可含有長度為3至8個(gè)堿基的位于3'或5'末端 的poly G尾部。
[0135] 在本發(fā)明的優(yōu)選的實(shí)施方式中，CpG寡核苷酸是18-27個(gè)堿基的C型CPG 0DN，其具 有10-14個(gè)堿基的回文序列和硫代磷酸酯骨架。特別優(yōu)選的是具有下述序列的0DN 2395:
[0136] 5'-tcgtcgttttcggcgc:gcgccg_3'（下劃線為回文序列）。
[0137] 在本發(fā)明的替代性優(yōu)選的實(shí)施方式中，CpG寡核苷酸是具有18-22個(gè)堿基和硫代磷 酸酯骨架的B型CPG 0DN。特別優(yōu)選的是具有下述序列的0DN 1826:
[0138] 57-tccatgacgttcctgacgtt-37 〇
[0139] TLR11和TLR12配體包括抑制蛋白（profilin)，抑制蛋白是參與肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架 的動(dòng)態(tài)翻轉(zhuǎn)和重構(gòu)的肌動(dòng)蛋白結(jié)合蛋白。因此，優(yōu)選的TLR11/12配體是來自弓形蟲的抑制 蛋白，弓形蟲是引起弓形蟲病的專性細(xì)胞內(nèi)寄生原蟲。抑制蛋白可購自例如Enzo Life Sciences。
[0140] TLR13配體包括細(xì)菌核糖體RNA序列"CGGAAAGACC"，包含該核苷酸序列的核酸與該 配體構(gòu)成本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選方面。序列為5 '-GGACGGAAAGACCCCGUGG-3 '的寡核苷酸是TLR13 配體，可購自例如Invivogen。
[0141] 因此，優(yōu)選所述TLR配體是TLR2、3、4、7、8或9配體，優(yōu)選如上所述的配體。在優(yōu)選的 實(shí)施方式中，TLR配體是TLR3配體，優(yōu)選如上所述。在替代性的優(yōu)選實(shí)施方式中，TLR配體是 TLR4配體，優(yōu)選如上所述。在另一替代性的優(yōu)選實(shí)施方式中，TLR配體是TLR7~9配體、或 TLR7配體、或TLR8配體或TLR9配體，優(yōu)選如上所述。
[0142] 此處所用的"表達(dá)"或"呈遞"是指抗原分子或其一部分提呈在所述細(xì)胞表面上，其 使得該分子的一部分暴露于細(xì)胞周圍的環(huán)境并與其互通，優(yōu)選使得可對所呈遞的分子或其 一部分產(chǎn)生免疫應(yīng)答。在"表面"上的表達(dá)可以如此實(shí)現(xiàn)，其中擬表達(dá)的分子與細(xì)胞膜和/或 可存在于該膜中或可致使存在于該膜中的組分接觸。
[0143] 本文中使用的術(shù)語"細(xì)胞"包括所有真核細(xì)胞(包括昆蟲細(xì)胞和真菌細(xì)胞）。因此， 代表性"細(xì)胞"包括所有種類的哺乳動(dòng)物和非哺乳動(dòng)物細(xì)胞、植物細(xì)胞、昆蟲細(xì)胞、真菌細(xì)胞 和原生動(dòng)物。但是，優(yōu)選的是，所述細(xì)胞為哺乳動(dòng)物細(xì)胞，例如來自貓、狗、馬、驢、綿羊、豬、 山羊、牛、小鼠、大鼠、兔、豚鼠的細(xì)胞，但最優(yōu)選的是來自人的細(xì)胞。進(jìn)行本發(fā)明方法、應(yīng)用 等的細(xì)胞可以是能夠在表面上表達(dá)或呈遞被施用或運(yùn)輸?shù)狡浒麧{中的分子的任何細(xì)胞。
[0144] 所述細(xì)胞通常為免疫細(xì)胞，即，參與免疫應(yīng)答的細(xì)胞。然而，其他細(xì)胞也可以將抗 原呈遞至免疫系統(tǒng)，因此這些細(xì)胞也落入本發(fā)明的范圍。本發(fā)明的細(xì)胞因此有利地是下文 所述的抗原呈遞細(xì)胞?？乖蔬f細(xì)胞可參與本文所述的免疫應(yīng)答的任何方面或"臂(arm)"。
[0145] 細(xì)胞毒性細(xì)胞的刺激需要抗原呈遞至將被抗原呈遞細(xì)胞以特定方式刺激的細(xì)胞， 例如MHC I類呈遞(例如，CD8+細(xì)胞毒性T細(xì)胞的激活需要MHC-1抗原呈遞）。產(chǎn)生抗體的細(xì)胞 還可以被抗原呈遞細(xì)胞的抗原呈遞所刺激。
[0146] 抗原還可以被抗原呈遞細(xì)胞通過內(nèi)吞來攝取，并在內(nèi)吞囊泡中降解為肽。這些肽 可結(jié)合核內(nèi)體中的MHC II類分子，并運(yùn)輸至細(xì)胞表面，在那里肽-MHC II類復(fù)合物可被⑶4+ T輔助細(xì)胞識(shí)別，并誘導(dǎo)免疫應(yīng)答。作為另選，胞漿中的蛋白可被降解，例如被蛋白酶體降 解，并通過ATP(與抗原呈遞相關(guān)的轉(zhuǎn)運(yùn)子)運(yùn)輸至內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，在那里肽可結(jié)合MHC I類分子，并 運(yùn)輸至細(xì)胞表面(Yewdell和Bennink, 1992,Adv. Immunol .52:1-123)。如果肽是異源抗原來 源，肽-MHC I類復(fù)合物將被⑶8+細(xì)胞毒性T細(xì)胞(CTL)識(shí)別。CTL可結(jié)合肽-MHC(HLA)I類復(fù)合 物并由此被活化，開始增殖并形成CTL克隆。靶標(biāo)細(xì)胞和細(xì)胞表面上具有相同肽-MHC I類復(fù) 合物的其他靶標(biāo)細(xì)胞可被CTL克隆殺死。如果胞漿中引入了足夠量的抗原，則可以建立對抗 異源抗原的免疫力（Yewdell和Bennink, 1992，同上；Rock, 1996，Immunology Today 17 : 131-137)。這是開發(fā)尤其是癌疫苗的基礎(chǔ)。最大的實(shí)際問題之一是向胞漿中引入足夠量的 抗原(或抗原的部分）。這可通過本發(fā)明來解決。
[0147] 如上所述，一旦通過光化學(xué)內(nèi)化法釋放在細(xì)胞胞漿中，抗原分子可以通過細(xì)胞的 抗原加工機(jī)構(gòu)而加工，并以適當(dāng)方式(例如通過MHC I類)而呈遞在細(xì)胞表面上。該加工可以 涉及抗原的降解，例如蛋白或多肽抗原降解成肽，所述肽然后與用于呈遞的MHC分子復(fù)合。 因此，根據(jù)本發(fā)明表達(dá)或呈遞在細(xì)胞表面上的抗原分子可以是被內(nèi)化(胞吞）的抗原分子的 部分或片段。
[0148] 多種不同的細(xì)胞種類可在其表面上呈遞抗原，例如包括淋巴細(xì)胞(T和B細(xì)胞）、樹 突細(xì)胞、巨噬細(xì)胞等。其他細(xì)胞包括例如癌細(xì)胞，例如黑素瘤細(xì)胞。這些細(xì)胞在本文中稱為" 抗原呈遞細(xì)胞〃。〃專門抗原呈遞細(xì)胞〃是主要參與將抗原遞呈給免疫系統(tǒng)效應(yīng)細(xì)胞的細(xì)胞， 這在本領(lǐng)域中已知并在文獻(xiàn)中有所描述，包括B淋巴細(xì)胞、樹突細(xì)胞、巨噬細(xì)胞。優(yōu)選的是， 細(xì)胞是專門抗原呈遞細(xì)胞。
[0149] 對于由抗原呈遞細(xì)胞向細(xì)胞毒性T-細(xì)胞(CTL)進(jìn)行的抗原呈遞，抗原分子需要進(jìn) 入抗原呈遞細(xì)胞的胞漿(Germain，Cel 1，1994，76，287-299)。
[0150] 在本發(fā)明的例如涉及體外或離體方法的實(shí)施方式中，或作為另選涉及體內(nèi)方法的 實(shí)施方式中，細(xì)胞是樹突細(xì)胞。樹突細(xì)胞為形成哺乳動(dòng)物免疫系統(tǒng)一部分的免疫細(xì)胞。其主 要功能是將抗原材料加工并呈遞在免疫系統(tǒng)的其他細(xì)胞的表面上。一旦被激活，它們迀移 至淋巴結(jié)并在那里與T細(xì)胞和B細(xì)胞相互作用從而引發(fā)適應(yīng)性免疫應(yīng)答。
[0151] 樹突細(xì)胞源自造血骨髓祖細(xì)胞。這些祖細(xì)胞初始轉(zhuǎn)變?yōu)槲闯墒鞓渫患?xì)胞，未成熟 樹突細(xì)胞的特征是高內(nèi)吞活性和低T-細(xì)胞激活潛力。一旦它們接觸到可呈遞的抗原，它們 就被活化成成熟的樹突細(xì)胞，并開始迀移至淋巴結(jié)。未成熟的樹突細(xì)胞吞噬病原體并將其 蛋白降解為小塊，并在成熟時(shí)將那些片段利用MHC分子呈遞在其細(xì)胞表面。
[0152] 樹突細(xì)胞可源自任何合適的樹突細(xì)胞來源，例如如來自皮膚、鼻內(nèi)襯、肺、胃、腸或 血液。本發(fā)明特別優(yōu)選的實(shí)施方式中，樹突細(xì)胞來源于骨髓。
[0153] 樹突細(xì)胞可以從天然來源分離，以用于本發(fā)明的體外方法，或可以在體外產(chǎn)生。樹 突細(xì)胞產(chǎn)生自單核細(xì)胞，即，在體內(nèi)循環(huán)并根據(jù)正確信號(hào)可以分化成樹突細(xì)胞或巨噬細(xì)胞 的白細(xì)胞。單核細(xì)胞轉(zhuǎn)而由骨髓中的干細(xì)胞形成。單核細(xì)胞衍生的樹突細(xì)胞可以從外周血 單個(gè)核細(xì)胞(PBMC)體外生成。將PBMC鋪設(shè)在組織培養(yǎng)瓶中使得單核細(xì)胞粘附。以白細(xì)胞介 素-4(IL-4)和粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子(GM-CSF)處理這些單核細(xì)胞導(dǎo)致在約一周內(nèi) 分化為未成熟樹突細(xì)胞（iDC)。后續(xù)以腫瘤壞死因子(TNF)處理進(jìn)一步將iDC分化為成熟的 樹突細(xì)胞。
[0154] 如本文所用的"接觸"是指使細(xì)胞和光敏化劑和/或抗原分子和/或本文定義的TLR 配體在適合于內(nèi)化到細(xì)胞中的條件下相互物理接觸，例如優(yōu)選的是在37°C在適當(dāng)營養(yǎng)培養(yǎng) 基中，例如25°C至39°C，或在體內(nèi)于體溫（即，36°C至38°C)。
[0155] 細(xì)胞可以連續(xù)或同時(shí)與本文限定的光敏化劑和抗原分子和TLR配體接觸。優(yōu)選并 且方便的是，所述組分與細(xì)胞同時(shí)接觸。光敏化劑和抗原分子(和可選的TLR配體)可被細(xì)胞 攝取到相同或不同的細(xì)胞內(nèi)區(qū)室(例如，它們可以共同轉(zhuǎn)位）。
[0156] 隨后將細(xì)胞暴露于適合波長的光以激活光敏化合物，該光敏化合物進(jìn)而引起細(xì)胞 內(nèi)區(qū)室膜的破裂。
[0157] W0 02/44396(通過引用將其并入本文)描述了一種方法，其中，該方法中步驟的順 序可以安排為例如使光敏化劑接觸細(xì)胞，然后在需要內(nèi)化的分子(此情況中為抗原分子)接 觸細(xì)胞之前以照射進(jìn)行活化。該方法利用了以下事實(shí):將被內(nèi)化的分子在照射時(shí)無需與光 敏化劑存在于同一細(xì)胞亞區(qū)室中。
[0158] 因此在一個(gè)實(shí)施方式中，所述光敏化劑和/或所述抗原分子和/或本文定義的TLR 配體一同地或相互分開地應(yīng)用于細(xì)胞。然后在至少光敏化劑和抗原分子存在于同一細(xì)胞內(nèi) 區(qū)室中時(shí)進(jìn)行照射。這被稱為〃后光（light after)〃法。
[0159] 在替代性實(shí)施方式中，所述方法可通過首先使所述細(xì)胞接觸光敏化劑，然后接觸 抗原分子和/或本文定義的TLR配體來進(jìn)行，照射在光敏化劑被攝取到細(xì)胞內(nèi)區(qū)室中之后、 但在細(xì)胞攝取抗原分子(和可選的TLR配體)進(jìn)入包含所述光敏化劑的細(xì)胞內(nèi)區(qū)室之前（例 如，其在光暴露時(shí)可存在于不同的細(xì)胞內(nèi)區(qū)室)進(jìn)行，優(yōu)選在細(xì)胞攝取抗原分子(和可選的 TLR配體)到任何細(xì)胞內(nèi)區(qū)室之前進(jìn)行，例如在任何細(xì)胞攝取抗原分子(和可選的TLR配體） 之前進(jìn)行。因此，例如可施用光敏化劑，然后進(jìn)行照射，并隨后施用其余試劑。這是所謂的〃 先光(light before)〃法。
[0160] 如本文所用的"內(nèi)化〃是指分子的細(xì)胞內(nèi)遞送，例如胞漿遞送。在此情形中，"內(nèi)化〃 可包括分子從細(xì)胞內(nèi)/膜包繞區(qū)室中釋放到細(xì)胞的胞漿中的步驟。
[0161] 如本文所用的"細(xì)胞攝取"或"轉(zhuǎn)位"是指內(nèi)化的一個(gè)步驟，即，其中細(xì)胞膜外的分 子被攝入到細(xì)胞中從而使其出現(xiàn)在外部排布的細(xì)胞膜之內(nèi)，例如通過內(nèi)吞作用或其它適當(dāng) 的攝入機(jī)制，例如進(jìn)入或結(jié)合細(xì)胞內(nèi)膜所限定出的區(qū)室，例如內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、高爾基體、溶酶體、核 內(nèi)體等。
[0162] 細(xì)胞與各種試劑接觸的步驟可以以任何方便的或期望的方式來進(jìn)行。因此，如果 該接觸步驟在體外進(jìn)行，則細(xì)胞可方便地保持在水性介質(zhì)中，例如適當(dāng)?shù)募?xì)胞培養(yǎng)基中，并 在適當(dāng)?shù)臅r(shí)間點(diǎn)將各種試劑在適當(dāng)?shù)臈l件(例如適當(dāng)?shù)臐舛群瓦m當(dāng)?shù)臅r(shí)長)下簡單地加入 到介質(zhì)中。例如，所述細(xì)胞可在無血清培養(yǎng)基的存在下或含血清培養(yǎng)基的存在下與所述試 劑接觸。
[0163] 下面的評述對分開將各種試劑應(yīng)用于細(xì)胞進(jìn)行討論。不過，如上所述，這些試劑可 以一起、分別、同時(shí)或依次應(yīng)用于細(xì)胞。如本文所述，在本發(fā)明方法中使用的各種試劑可在 體外或體內(nèi)應(yīng)用于細(xì)胞。在體內(nèi)的情形中，如下文更詳細(xì)地描述那樣，應(yīng)用可以通過直接 (即，局部)或間接(即，全身或非局部)施用。
[0164] 光敏化劑以適當(dāng)?shù)臐舛群瓦m當(dāng)?shù)臅r(shí)長接觸細(xì)胞，所述適當(dāng)?shù)臐舛群瓦m當(dāng)?shù)臅r(shí)長是 本領(lǐng)域技術(shù)人員利用常規(guī)技術(shù)容易確定的，并取決于諸如所用的特定光敏化劑和靶標(biāo)細(xì)胞 類型和位置等因素。光敏化劑的濃度利于使得一旦其被攝入到細(xì)胞中（例如進(jìn)入或結(jié)合一 種或多種其細(xì)胞內(nèi)區(qū)室)并被照射激活，則一種或多種細(xì)胞結(jié)構(gòu)就會(huì)被破壞，例如一種或多 種細(xì)胞內(nèi)區(qū)室裂解或破裂。例如，本文所述的光敏化劑可以以例如l〇μg/ml至50μg/ml的濃 度使用。
[0165] 對于體外使用，范圍可以更寬，例如0.0005μg/ml至500μg/ml。對于人體內(nèi)治療，光 敏化劑可以在進(jìn)行全身施用時(shí)以〇 . 〇5mg/kg體重至20mg/kg體重來使用。作為另選， 0.005mg/kg體重至20mg/kg體重的范圍可用于全身施用。更方便的是，光敏化劑可局部施 用，例如通過皮內(nèi)、皮下或腫瘤內(nèi)施用，并且在此情況下，劑量可以是lyg至5000yg，例如10y g 至 2500iig、25iig 至 1000iig、50iig 至 500iig、lOyg 至 300iig 或 lOOlig 至 300iig。優(yōu)選的是，劑量選 自100邱、150辟、200邱和250邱。優(yōu)選的是劑量是75辟至125邱，例如100辟。所提供的劑量是 針對人的平均重量（即，70kg)而言。對于皮內(nèi)注射，光敏化劑的劑量可以溶解于1 OOyl至lml 中，即，濃度可以為lμg/ml至50000μg/ml。在較小的動(dòng)物中，濃度范圍可以不同并可以相應(yīng) 地調(diào)整，不過當(dāng)局部施用時(shí)，對于不同動(dòng)物幾乎不需要改變劑量。
[0166]抗原的使用濃度取決于所用的抗原。方便的是，可在體外使用濃度為0.001 -500y g/ml (例如，20iig/ml ~500iig/ml、20iig/ml ~300iig/ml、20iig/ml ~lOOug/ml、20iig/ml ~50ii g/ml、lOμg/ml~50iig/ml、5μg/ml~50iig/ml、lμg/ml~50iig/ml、0 ? Olμg/ml~50iig/ml或 0.001lig/ml~50μg/ml)的抗原。對于肽抗原，可使用更低濃度，例如0.001iig/ml~500iig/ ml，例如0 ? 00 lμg/ml ~lμg/ml、5μg/ml、25μg/ml、50iig/ml或 100iig/ml。對于蛋白抗原，可使 用更高濃度，例如〇.5μg/ml~500iig/ml。對于體內(nèi)使用，蛋白抗原劑量可以為0.5yg~500ii g，例如l〇yg~l〇〇yg或l〇yg~200iig。對于肽抗原，可米用0? lyg~4000iig、例如0? lyg~2000 噸、0.1噸~1000噸或0.1辟~500辟，例如0.1邱~100邱的體內(nèi)劑量。這些劑量適合于局部 施用?？筛鶕?jù)所研究的試劑被所研究的細(xì)胞攝入的效率以及在細(xì)胞中所需要實(shí)現(xiàn)的最終濃 度來確定適合的濃度。
[0167] 本文定義的TLR配體的濃度也取決于所要施用的具體分子，本領(lǐng)域技術(shù)人員將了 解合適的濃度或劑量。合適的體外和體內(nèi)濃度或劑量的實(shí)例如下表2所示。
[0168] 表2
[0169]
[0170] 因此，例如，可以體外方便地使用lμg/ml~1 OOμg/ml (例如20iig/ml~1 OOμg/ml或 20μg/ml~50μg/ml)的濃度?？梢允褂皿w內(nèi)劑量為10yg~lOOOyg的咪唑并喹啉化合物，例如 小鼠中為2〇yg~lOOyg，人中為l〇yg~10mg。對于局部施用，例如咪喹莫特在人體內(nèi)局部施 用，可使用2 ? 5mg~50mg的劑量，例如lmg/cm2~5mg/cm2，例如2 ? 5mg/cm2。對于雷西莫特，劑 量可以為〇 ? lmg~50mg，例如lmg~5mg，例如lmg/cm2~5mg/cm2。相似的劑量適于嘎德莫特。 對于皮內(nèi)注射咪唑并喹啉化合物，可以使用更小的劑量，例如至少1 〇yg或50yg，例如可使用 10yg~lmg。對于CpG寡核苷酸和其他TLR配體，可使用相似的劑量。Poly(IC)可以以小鼠體 內(nèi)lyg~100yg的劑量和人體內(nèi)lyg~10mg的劑量施用。
[0171] 在大多數(shù)情況下，光敏化劑、抗原分子和如本文所定義的TLR配體一起施用，但是 這可變化。因此，對于各不同組分，設(shè)想了不同的施用時(shí)間或模式或部位(或與細(xì)胞接觸）， 并且本發(fā)明的范圍內(nèi)涵蓋了這些方法。
[0172] 在一個(gè)實(shí)施方式中，將TLR配體，例如CpG寡核苷酸或咪唑并喹啉化合物、LPS或如 本文所定義的P〇ly(IC)分子與抗原分開施用，例如，在不同的制劑中分開施用，例如乳膏或 凝膠，或全身性施用，例如通過口服施用(例如使用雷西莫特時(shí)）。因此，在一個(gè)實(shí)施方式中， 例如CpG寡核苷酸或咪唑并喹啉化合物等TLR配體可在施用抗原和/或光敏化劑前施用，例 如24小時(shí)之前，例如通過局部預(yù)處理施用。在一些情況下，例如Poly (1C)或LPS等TLR配體在 抗原之前、同時(shí)或之后施用。
[0173] TLR配體可與其他試劑分開施用，例如在照明前約2小時(shí)施用。在替代性實(shí)施方式 中，所述試劑可以隨同抗原或與抗原在同一時(shí)間（即，同時(shí)地)施用。
[0174] 便利的是，細(xì)胞與光敏化劑和/或抗原分子和/或本文所定義的TLR配體之間的接 觸15分鐘至24小時(shí)，例如30分鐘至4小時(shí)，優(yōu)選1.5至2.5小時(shí)。作為另選，時(shí)間的范圍可為約 1小時(shí)至約48小時(shí)，例如約2小時(shí)至約40小時(shí)，或約6小時(shí)至約36小時(shí)，例如從12小時(shí)至30小 時(shí)，例如16小時(shí)至20小時(shí)，例如18小時(shí)或約18小時(shí)。
[0175] 在優(yōu)選的實(shí)施方式中，細(xì)胞首先與光敏化劑溫育。在一個(gè)實(shí)施方式中，施用光敏化 劑與抗原分子和/或TLR配體之間的時(shí)間以小時(shí)計(jì)。例如，光敏化劑可在照明前16至20小時(shí) (例如18小時(shí))應(yīng)用，抗原分子和/或TLR配體可在照明前1至3小時(shí)（例如2小時(shí)）應(yīng)用。因此， 施用光敏化劑與抗原分子和/或所述TLR配體之間的時(shí)間可以為15至23小時(shí)。
[0176] 因此，細(xì)胞在與光敏化劑溫育后，與抗原和/或如本文所述的TLR配體溫育。方便的 是，細(xì)胞在接觸光敏劑/抗原后并在照射之前，可以放置在無光敏劑/抗原的培養(yǎng)基中，例如 30分鐘至4小時(shí)，例如從1.5至2.5小時(shí)，這取決于與光敏化劑和抗原分子和TLR配體的溫育 時(shí)機(jī)。
[0177] 使各種試劑與靶細(xì)胞接觸的合適體內(nèi)方法和溫育時(shí)間取決于諸如施用模式和所 用試劑類型等因素。例如，如果所述試劑注入到需要處理/照射的腫瘤、組織或器官中，則注 射點(diǎn)附近的細(xì)胞會(huì)接觸到所述試劑，因此傾向于比遠(yuǎn)離注入點(diǎn)的細(xì)胞速度更快地?cái)z入所述 試劑，遠(yuǎn)離注入點(diǎn)的細(xì)胞可能在更晚的時(shí)間點(diǎn)以更低的濃度接觸所述試劑。便利的是，可以 使用6至24小時(shí)的時(shí)間。
[0178] 另外，通過靜脈注射或口服施用的制劑可能需要一些時(shí)間才能到達(dá)靶細(xì)胞并因此 可能需要更長的施用后時(shí)間（例如幾天），以便使足夠或最佳量的試劑累積在靶細(xì)胞或組織 中。個(gè)體細(xì)胞所需要的體內(nèi)施用時(shí)間可能隨這些參數(shù)以及其他參數(shù)而改變。
[0179]然而，雖然體內(nèi)情況比體外更復(fù)雜，但本發(fā)明的基本概念仍然是相同的，即，分子 與靶細(xì)胞接觸的時(shí)間必須使得在照射發(fā)生前適量的光敏化劑已被靶細(xì)胞攝入以及下述的 任一項(xiàng)：（i)在照射之前或照射期間，抗原分子(和可選的TLR配體)或者已被攝入到細(xì)胞中， 或者將在與靶細(xì)胞充分接觸后被攝入到細(xì)胞中，例如進(jìn)入與光敏化劑相同或不同的細(xì)胞內(nèi) 區(qū)室，或（ii)在照射之后，抗原分子（以及可選的TLR配體)與細(xì)胞接觸一段足以使其被攝入 到細(xì)胞中的時(shí)間。
[0180] 對于本文所述試劑的體內(nèi)施用，可采用本領(lǐng)域常用或標(biāo)準(zhǔn)的任何施用模式，例如 對內(nèi)部和外部身體表面進(jìn)行的注射、輸注、局部施用、經(jīng)皮施用等。對于體內(nèi)使用，本發(fā)明可 以用于含有細(xì)胞的任何組織（需要內(nèi)化的包含光敏化劑的化合物或分子被定位至所述細(xì) 胞），包括體液位置，以及實(shí)體組織?？梢灾委熕薪M織，只要光敏化劑被靶細(xì)胞攝入，并且 可以正確地遞送光即可。優(yōu)選的施用方式是皮內(nèi)、皮下、局部或腫瘤內(nèi)施用或注射。優(yōu)選的 施用通過皮內(nèi)注射進(jìn)行。
[0181] 為了實(shí)現(xiàn)所期望的結(jié)果，例如抗原呈遞、產(chǎn)生免疫應(yīng)答或疫苗接種，所述方法或其 一部分可重復(fù)進(jìn)行，例如可進(jìn)行"重新疫苗接種"。因此，本發(fā)明整體上可在適當(dāng)時(shí)間間隔后 進(jìn)行多次(例如2、3或更多次），或該方法的部分可以重復(fù)，例如，進(jìn)一步施用如本文所定義 的TLR配體或附加的照射步驟。例如，該方法或方法的部分可以在第一次實(shí)施之后的數(shù)天或 數(shù)周之內(nèi)再次進(jìn)行，例如5到60天（例如7、14、15、21、22、42或51天），例如7~20天，優(yōu)選14 天，或例如1周至5周（例如，1、2、3或4周）。所述方法的所有或部分可以在適當(dāng)?shù)臅r(shí)間間隔重 復(fù)多次，所述時(shí)間間隔為例如每兩周或14天。在優(yōu)選的實(shí)施方式中，所述方法重復(fù)至少一 次。在另一實(shí)施方式中，所述方法重復(fù)兩次。
[0182] 在一個(gè)實(shí)施方式中，在第2次或隨后次進(jìn)行所述方法時(shí)，抗原分子與光敏化劑和照 明聯(lián)合施用，即，在第2次或隨后次進(jìn)行所述方法時(shí)不施用TLR配體。
[0183] 在替代性實(shí)施方式中，可以在進(jìn)行本發(fā)明方法之前進(jìn)行本發(fā)明方法的部分。例如， 可以在進(jìn)行本發(fā)明方法之前，將該方法在不存在TLR配體的情況下進(jìn)行一次或多次，例如兩 次。作為另選，該方法可以在進(jìn)行本發(fā)明方法之前在不存在光敏化劑和照明的情況下進(jìn)行 一次或多次，例如兩次?？梢栽谶M(jìn)行本發(fā)明的方法之前數(shù)天(例如7或14天)或數(shù)周(例如1、3 或4周）進(jìn)行本發(fā)明方法的一部分?？梢栽谶M(jìn)行本發(fā)明的方法之前，以上述時(shí)間間隔將該方 法的一部分重復(fù)一次或多次。因此，在優(yōu)選的方面，抗原分子(例如向受試者)施用2次以上 (例如，以上述的時(shí)間間隔），其中，至少所述抗原分子的施用根據(jù)本發(fā)明的方法進(jìn)行。
[0184] "照射"以活化光敏化劑是指如下文中所述直接或間接地施加光。因此，受試者或 細(xì)胞可以例如直接(例如，對體外的單一細(xì)胞)或間接地用光源來照射，所述間接例如是在 體內(nèi)，其時(shí)細(xì)胞處在皮膚表面之下或者處于不是其全部均可被直接照射(即，無其他細(xì)胞遮 蔽）的一層細(xì)胞的形態(tài)?？梢栽谑┯霉饷艋瘎?、抗原分子和文本限定的TLR配體之后約18至 24小時(shí)進(jìn)行對細(xì)胞或受試者的照射。
[0185] 活化光敏化劑的照射步驟可根據(jù)本領(lǐng)域公知的技術(shù)和程序進(jìn)行。所用的光的波長 和強(qiáng)度根據(jù)所使用的光敏化劑選擇。適當(dāng)?shù)娜斯す庠词潜绢I(lǐng)域中公知的，例如，使用藍(lán)色 (400nm~475nm)或紅色（620mn~750nm)波長的光。對于TPCS 2a，例如可以使用的波長為 400nm至500nm、更優(yōu)選400nm至450nm，例如430nm~440nm，進(jìn)而更優(yōu)選約435nm或435nm。在 適當(dāng)?shù)那闆r下，例如卟啉或二氫卟吩等光敏化劑可被綠光激活，例如KillerRed(Evrogen, Moscow,俄羅斯)光敏化劑可被綠光激活。
[0186] 合適的光源是本領(lǐng)域已知的，例如PCI Biotech AS的LuniiSourcc?燈。作為另選， 可以使用基于LED的照明裝置，其具有高達(dá)60mW的可調(diào)節(jié)輸出功率和430nm~435nm的發(fā)射 光譜。對于紅光，合適的照明源是PCI Biotech AS 652nm激光系統(tǒng)SN576003二極管激光器， 不過也可以使用任何合適的紅色光源。
[0187] 本發(fā)明方法中細(xì)胞暴露于光的時(shí)間可變。分子向胞漿中內(nèi)化的效率隨曝光增加而 提高直至達(dá)到最大值，超過該最大值后細(xì)胞損傷且因此細(xì)胞死亡會(huì)增加。
[0188] 照射步驟的優(yōu)選時(shí)長取決于下述因素，例如靶、光敏劑、積聚在靶細(xì)胞或組織中的 光敏劑的量，以及光敏劑的吸收光譜與光源的發(fā)射光譜之間的重疊。通常，照射步驟的時(shí)長 為數(shù)秒至數(shù)分鐘或者高達(dá)數(shù)小時(shí)(甚至達(dá)12小時(shí)）的量級，例如，優(yōu)選至多60分鐘，例如0.25 分鐘或1分鐘~30分鐘，例如0.5分鐘~3分鐘或1分鐘~5分鐘或1分鐘~10分鐘，例如3分鐘 ~7分鐘，并優(yōu)選約3分鐘，例如2.5分鐘~3.5分鐘。也可以采用較短的照射時(shí)間，例如1秒~ 60秒，例如10秒~50秒、20秒~40秒或25秒~35秒。
[0189] 適當(dāng)?shù)墓鈩┝靠梢杂杀绢I(lǐng)域技術(shù)人員選擇，并且將同樣取決于所使用的光敏劑和 在靶細(xì)胞或組織中積聚的光敏劑的量。當(dāng)使用在可見光譜中具有較高消光系數(shù)(例如，在紅 光區(qū)域，或如果使用藍(lán)光則在藍(lán)光區(qū)域，取決于所用的光敏化劑）的光敏劑時(shí)，光劑量通常 較低。例如，當(dāng)采用可調(diào)輸出功率高達(dá)60mW并且發(fā)射光譜為430nm~435nm的基于LED的照明 裝置時(shí)，可以使用通量為〇 ? 〇5mW/cm2~20mW/cm2、例如2 ? 0mW/cm2的0 ? 24J/cm2~7 ? 2J/cm2的 光劑量。作為另選，例如如果采用LumiSource?燈，適合的是通量為0. lmW/cm2~20mW/cm2( Lumis.ource€>:提供13mW/cm 2)的0 . lj/cm2~6J/cm2的光劑量。對于紅光，可以使用通量為 0 ? lmW/cm2~5mW/cm2、例如0 ? 81mW/cm2 的0 ? 03J/cm2~1 J/cm2、例如0 ? 3J/cm2 的光劑量。
[0190] 此外，如果要保持細(xì)胞活力，則需避免生成過高水平的毒性物種，并且可以因此而 調(diào)節(jié)相關(guān)參數(shù)。
[0191] 本發(fā)明方法可能不可避免地由于光化學(xué)治療而導(dǎo)致一些細(xì)胞損傷，即，通過光敏 化劑活化時(shí)產(chǎn)生的有毒物質(zhì)所導(dǎo)致的光動(dòng)力學(xué)治療效應(yīng)。根據(jù)所提出的應(yīng)用，這種細(xì)胞死 亡可能不嚴(yán)重，并可能實(shí)際上對某些應(yīng)用是有利的（例如癌癥治療）。然而，在大部分實(shí)施方 式中，避免了細(xì)胞死亡，從而能由呈遞細(xì)胞產(chǎn)生免疫應(yīng)答。本發(fā)明的方法可修改，從而通過 選擇相對于光敏化劑濃度的光劑量來調(diào)節(jié)存活細(xì)胞的分?jǐn)?shù)或比例。同樣，這類技術(shù)是本領(lǐng) 域公知的。
[0192] 優(yōu)選的是，基本上所有或大部分（例如，至少75 %，更優(yōu)選至少80 %、85 %、90 %或 95%的細(xì)胞)的細(xì)胞沒有被殺死。PCI治療后的體外細(xì)胞活力可以通過本領(lǐng)域已知的標(biāo)準(zhǔn)技 術(shù)如MTS試驗(yàn)測定。一種或多種細(xì)胞類型的體內(nèi)細(xì)胞死亡可以在施用點(diǎn)1厘米范圍（或在一 定的組織深度）內(nèi)進(jìn)行評估，例如通過顯微鏡進(jìn)行評估。由于細(xì)胞死亡可能不會(huì)立即發(fā)生， 所述細(xì)胞死亡％是指在照射數(shù)小時(shí)（例如照射后至多4小時(shí)）內(nèi)保持活力的細(xì)胞百分比，但 優(yōu)選是指照射后4小時(shí)以上的活細(xì)胞％。
[0193] 所述方法可以在體內(nèi)、體外或離體進(jìn)行。優(yōu)選的是，所述方法在體外或離體產(chǎn)生用 于體內(nèi)施用或體內(nèi)方法的細(xì)胞。因此，在優(yōu)選的特征中，所述方法可用于在受試者中產(chǎn)生免 疫應(yīng)答。
[0194] 因此，在另一方面，本發(fā)明提供了在受試者中產(chǎn)生免疫應(yīng)答的方法，所述方法包括 對所述受試者施用抗原分子、光敏化劑和上文限定的TLR配體，并對受試者照射有效活化所 述光敏化劑的波長的光，其中，產(chǎn)生免疫應(yīng)答。
[0195] 可以產(chǎn)生的"免疫應(yīng)答"可以是體液和細(xì)胞介導(dǎo)的免疫，例如刺激抗體的產(chǎn)生，或 刺激細(xì)胞毒性細(xì)胞或殺傷細(xì)胞，這些細(xì)胞可識(shí)別并破壞(或是消除)在其表面上表達(dá)"外來" 抗原的細(xì)胞。術(shù)語"刺激免疫應(yīng)答"因而包括所有種類的免疫應(yīng)答和刺激它們的機(jī)制，并且 涵蓋了對CTL的刺激(其構(gòu)成本發(fā)明一個(gè)優(yōu)選方面）。優(yōu)選的是，所刺激的免疫應(yīng)答是細(xì)胞毒 性CD8T細(xì)胞。免疫應(yīng)答的程度可通過免疫應(yīng)答的標(biāo)志物來評價(jià)，例如分泌的分子如IL-2或 IFNy或抗原特異性T細(xì)胞的產(chǎn)生(例如，如實(shí)施例中所述的評估）。
[0196] 對細(xì)胞毒性細(xì)胞或抗體產(chǎn)生細(xì)胞的刺激需要將抗原呈遞至將以特定方式由抗原 呈遞細(xì)胞所刺激的細(xì)胞，所述方式例如為MHC I類呈遞(例如CD8+細(xì)胞毒性T細(xì)胞的激活需 要MHC-I抗原呈遞）。優(yōu)選的是，免疫應(yīng)答通過MHC-I呈遞刺激。
[0197] 優(yōu)選的是，免疫應(yīng)答用于治療或預(yù)防疾病、病癥或感染，例如癌癥。
[0198] 在一個(gè)實(shí)施方式中，癌癥是黑色素瘤。黑色素瘤是黑色素細(xì)胞的惡性腫瘤，黑色素 細(xì)胞是負(fù)責(zé)產(chǎn)生黑色素(造成膚色的暗色素）的細(xì)胞。這些細(xì)胞主要出現(xiàn)在皮膚中，但也存 在于身體的其他部位，包括腸和眼睛中。黑色素瘤可以在包含黑色素細(xì)胞的身體任何部位 產(chǎn)生。
[0199] 本文所用的"黑色素瘤"包括所有類型的黑色素瘤，例如包括淺表擴(kuò)散性黑色素 瘤、結(jié)節(jié)性黑色素瘤、惡性雀斑樣痣黑色素瘤、纖維組織增生性黑色素瘤、肢端雀斑樣痣黑 色素瘤和無黑色素的黑色素瘤、息肉樣黑色素瘤、具有小痣樣細(xì)胞的黑色素瘤和具有斯皮 茨痣特征的黑色素瘤。
[0200] 雖然大部分黑色素瘤在皮膚上發(fā)生(皮膚惡性黑色素瘤），但黑色素瘤也可在身體 其他地方發(fā)生，例如在內(nèi)部器官中，例如在粘膜中。透明細(xì)胞肉瘤是軟組織的惡性黑色素 瘤。黑色素瘤也可以發(fā)生在眼睛（葡萄膜黑色素瘤）、外陰、陰道或直腸。這些黑色素瘤也包 括在本發(fā)明的范圍內(nèi)。優(yōu)選的是，待治療的黑色素瘤是皮膚黑色素瘤。黑色素瘤也外延至轉(zhuǎn) 移性黑色素瘤，即，源自原發(fā)黑色素瘤但已轉(zhuǎn)移至不同位置從而產(chǎn)生繼發(fā)性腫瘤的細(xì)胞。如 本文所述的黑色素瘤的治療或預(yù)防外延至原發(fā)黑色素瘤和/或從原發(fā)黑色素瘤派生的繼發(fā) 性腫瘤的治療。因此，本發(fā)明還涉及治療轉(zhuǎn)移性黑色素瘤的應(yīng)用。
[0201] 在替代性實(shí)施方式中，癌癥與乳頭瘤病毒相關(guān)或由乳頭瘤病毒引起/由乳頭瘤病 毒誘導(dǎo)，特別是人乳頭瘤病毒(HPV)。如上文所討論，乳頭瘤病毒基因組是分為早期區(qū)(E)和 晚期區(qū)（L)，早期區(qū)（E)編碼被宿主細(xì)胞初始感染后立即表達(dá)的6個(gè)化1』2444546和￡7) 開放閱讀框(ORF)，晚期區(qū)（L)編碼主要衣殼蛋白L1和次要衣殼蛋白L2。所有病毒的ORF編碼 在一條DNA鏈上?？筛鶕?jù)本發(fā)明使用的HPV抗原可與由HPV感染導(dǎo)致的癌癥相關(guān)，可以是如本 文所討論的一種或多種已知的抗原肽或T-細(xì)胞表位。如上文所討論，有數(shù)種類型的HPV，而 本發(fā)明所述的與HPV相關(guān)的癌癥可以與任何類型的HPV相關(guān)或由任何類型的HPV所導(dǎo)致，例 如HPV-16和/或HPV-18,或者HPV-31或HPV-45。根據(jù)本發(fā)明使用的抗原可源自E1、E2、E4、E5、 E6或E7蛋白中的任一種或L1和L2蛋白中的任一種。因此，所述抗原分子可源自HPV-16和 HPV-18的E2、E6和E7中的一種或多種。在優(yōu)選的實(shí)施方式中，抗原分子包含HPV-16的E7序列 GQAEPDRAHYNIVTFCCKCDSTLRLCVQSTHVDIR(CD8表位以粗體字表示）。因此，HPV抗原可以 是35氨基酸肽。作為另選，抗原分子可以僅為CD8表位RAHYNIVTF，即，更短的肽。
[0202]在替代性實(shí)施方式中，所述疾病、病癥或感染是病毒感染，優(yōu)選乳頭瘤病毒感染， 特別是人乳頭瘤病毒(HPV)感染。
[0203]優(yōu)選的是所述方法用于疫苗接種。如本文中所述，"疫苗接種(vaccination)"是使 用抗原(或包含抗原的分子）引起免疫應(yīng)答，該免疫應(yīng)答預(yù)防或治療疾病、病癥或感染的發(fā) 展(或進(jìn)一步發(fā)展），其中，所述疾病、病癥或感染與抗原的異常表達(dá)或存在有關(guān)。優(yōu)選的是， 所述疾病是癌癥，例如黑色素瘤或與乳頭瘤病毒如HPV相關(guān)的癌癥。在一個(gè)實(shí)施方式中，疫 苗接種具有治療性，例如用于治療本文中所討論的癌癥。在替代性實(shí)施方式中，疫苗接種具 有預(yù)防性，例如用于預(yù)防癌癥或在對更早期的癌癥以治療疫苗接種進(jìn)行治療后進(jìn)一步降低 癌癥發(fā)展。在另一實(shí)施方式中，當(dāng)要產(chǎn)生針對感染(例如病毒感染，例如乳頭瘤病毒感染)的 免疫應(yīng)答時(shí)，疫苗接種具有預(yù)防性質(zhì)。
[0204] 在本發(fā)明優(yōu)選的實(shí)施方式中，所述方法例如疫苗接種的受試者是哺乳動(dòng)物，優(yōu)選 貓、狗、馬、驢、綿羊、豬、山羊、牛、小鼠、大鼠、兔或豚鼠，但最優(yōu)選的受試者是人。
[0205] 優(yōu)選的是本文描述的方法實(shí)現(xiàn)協(xié)同效應(yīng)(synergy)，即，與通過(i)在不存在的TLR 配體的情況下用抗原分子進(jìn)行所述方法和（ii)在不存在光敏化劑和照射步驟的情況下用 抗原分子進(jìn)行所述方法而觀察到的加和增強(qiáng)相比，細(xì)胞表面呈遞或免疫應(yīng)答產(chǎn)生的程度增 強(qiáng)，即，觀察到了所述方法之間的協(xié)同效應(yīng)。細(xì)胞表面呈遞或免疫應(yīng)答產(chǎn)生的水平可以通過 適當(dāng)方式評估，例如抗原特異性CD8+細(xì)胞的數(shù)目或免疫應(yīng)答激活的標(biāo)記物（例如IFN y或 IL-2)的水平。
[0206]本文所用的"協(xié)同效應(yīng)"是指相對于簡單加和效應(yīng)的定量提高。
[0207] 本發(fā)明方法中所用的各種試劑可分別、依次或同時(shí)施用給受試者。
[0208] 上述與本發(fā)明在細(xì)胞的表面上表達(dá)抗原分子或其一部分的方法相關(guān)而論述的方 面和特征在適當(dāng)時(shí)也適用于以上產(chǎn)生免疫應(yīng)答的方法。
[0209] 本發(fā)明還提供了將抗原分子引入細(xì)胞的胞漿中的方法，所述方法包括使細(xì)胞接觸 需要引入的抗原分子、光敏化劑和本文定義的TLR配體，并以有效活化所述光敏化劑的波長 的光照射細(xì)胞。一旦被激活，所述細(xì)胞的包含所述化合物的細(xì)胞內(nèi)區(qū)室將這些區(qū)室中所含 的分子釋放到胞漿中。
[0210] 本發(fā)明上述方法可在體外或體內(nèi)使用，例如用于原位治療或用于離體治療，然后 將經(jīng)治療的細(xì)胞施用到身體內(nèi)。
[0211] 本發(fā)明還提供了在表面上表達(dá)抗原分子或其一部分的細(xì)胞，或細(xì)胞群，所述細(xì)胞 通過本文限定的任何方法獲得或可通過其獲得。還提供如下文所述用于預(yù)防或治療的細(xì)胞 或細(xì)胞群。
[0212] 細(xì)胞群可在藥物組合物中提供，所述組合物還包括一種或多種藥學(xué)可接受的稀釋 劑、載劑或賦形劑。
[0213] 本發(fā)明還提供了一種藥物組合物，其包括抗原分子、光敏化劑和本文定義的TLR配 體以及一種或多種藥學(xué)可接受的稀釋劑、載劑或賦形劑。
[0214] 這些組合物(和本發(fā)明的產(chǎn)品）可以以任何方便的方式根據(jù)藥物領(lǐng)域中已知的技 術(shù)和程序進(jìn)行配制，例如利用一種或多種藥學(xué)可接受的稀釋劑、載劑或賦形劑進(jìn)行配制。 "藥學(xué)可接受的"在本文中是指與組合物(或產(chǎn)品）的其它成分相容并且接受者生理上可接 受的成分。組合物的性質(zhì)和載劑或賦形劑材料、劑量等可以在常規(guī)的方式中根據(jù)選擇和期 望的施用途徑、治療目的等選擇。劑量同樣可以在常規(guī)的方式中確定，并可取決于分子(或 組合物或產(chǎn)品的組分）的性質(zhì)、治療目的、患者的年齡、施用模式等。對于光敏化劑而言，也 應(yīng)考慮在照射時(shí)破壞膜的效能/能力。
[0215] 細(xì)胞、例如抗原呈遞細(xì)胞可以在體外制備。在治療方法中，這些細(xì)胞可施用于體內(nèi) 或離體組織，從而出于例如預(yù)防或治療的目的使這些細(xì)胞刺激免疫應(yīng)答。
[0216] 因此，本發(fā)明還提供了如本文所定義的細(xì)胞群(或包含細(xì)胞群的組合物），或抗原 分子、光敏化劑、以及本文定義的TLR配體，其用于預(yù)防或治療或用于刺激免疫應(yīng)答，例如用 于疫苗接種目的，例如在受試者體內(nèi)刺激CTL，優(yōu)選用于治療或預(yù)防所述受試者的疾病、病 癥或感染，特別是用于治療或預(yù)防癌癥，如黑色素瘤或與乳頭瘤病毒（如HPV)相關(guān)聯(lián)的癌 癥。作為另一種方式限定而言，本發(fā)明提供（i)細(xì)胞群、（ii)本文所定義的組合物、或（iii) 抗原分子和/或光敏化劑和/或TLR配體在制備藥物中的應(yīng)用，所述藥物用于刺激受試者免 疫應(yīng)答(例如，刺激CTL)，優(yōu)選用于治療或預(yù)防所述受試者的疾病、病癥或感染，優(yōu)選用于疫 苗接種和/或用于治療或預(yù)防癌癥，如黑色素瘤或乳頭瘤病毒(如HPV)相關(guān)的癌癥，其中，優(yōu) 選的是所述免疫應(yīng)答由本文所定義的方法刺激。
[0217] 所述刺激、治療或預(yù)防優(yōu)選包括對所述受試者施用所述藥物。
[0218] 抗原分子、光敏化劑和TLR配體可組合并存在于所述組合物中。換言之，本發(fā)明提 供了抗原分子和/或光敏化劑和/或本文定義的TLR配體在藥物制備中的應(yīng)用，所述用于刺 激免疫應(yīng)答(例如刺激受試者的CTL)，優(yōu)選用于治療或預(yù)防所述受試者的疾病、病癥或感 染，特別用于疫苗接種目的，其中，所述藥物包括在細(xì)胞表面上表達(dá)抗原分子或其一部分的 細(xì)胞群(所述細(xì)胞可通過本文限定的方法獲得），用于施用給所述受試者。優(yōu)選的是，細(xì)胞群 通過所述方法獲得。細(xì)胞群用于對受試者施用。
[0219] 在替代性實(shí)施方式方式中，本發(fā)明提供了抗原分子、光敏化劑和本文定義的TLR配 體，用于在細(xì)胞的表面上表達(dá)所述抗原分子或其一部分，以刺激受試者的免疫應(yīng)答(例如刺 激CTL)，優(yōu)選用于治療或預(yù)防所述受試者的疾病、病癥或感染，其中，所述應(yīng)用包括本文限 定的方法，優(yōu)選用于制備細(xì)胞群，例如樹突細(xì)胞。這些細(xì)胞隨后可施用于受試者。
[0220] 本發(fā)明還提供了包括抗原分子、光敏化劑和本文定義的TLR配體作為聯(lián)合制劑的 產(chǎn)品，其用于在本文所述的方法中同時(shí)、分別或依次使用以刺激受試者的免疫應(yīng)答(或用于 在細(xì)胞的表面上表達(dá)抗原分子或其一部分，或用于將抗原分子內(nèi)化到細(xì)胞的胞漿中），優(yōu)選 用于治療或預(yù)防受試者的疾病、病癥或感染。
[0221] 本發(fā)明還提供了一種試劑盒，該試劑盒用于在本文所述的方法中刺激受試者免疫 應(yīng)答，優(yōu)選用于治療或預(yù)防受試者的疾病、病癥或感染，例如用于疫苗接種或免疫、或用于 在細(xì)胞的表面上表達(dá)抗原分子或其一部分，或用于將抗原分子內(nèi)化到細(xì)胞的胞漿中，所述 試劑盒包括
[0222] 第一容器，其包含本文定義的光敏化劑；
[0223] 第二容器，其包含本文定義的所述抗原分子;和 [0224]第三容器，其包含本文定義的TLR配體。
[0225] 本發(fā)明的產(chǎn)品和試劑盒是用于實(shí)現(xiàn)本文限定的細(xì)胞表面呈遞(或治療方法）。
[0226] 在另一實(shí)施方式中，本發(fā)明提供了在受試者體內(nèi)產(chǎn)生免疫應(yīng)答(例如刺激CTL)、優(yōu) 選用于治療或預(yù)防所述受試者的疾病、病癥或感染的方法，所述方法包括根據(jù)本文所述方 法制備細(xì)胞群，并隨后將所述細(xì)胞施用于所述受試者。
[0227] 當(dāng)經(jīng)處理的細(xì)胞體內(nèi)施用時(shí)，由所要求保護(hù)的發(fā)明實(shí)現(xiàn)的抗原呈遞可有利地導(dǎo)致 對免疫應(yīng)答的刺激。優(yōu)選的是，產(chǎn)生了免疫應(yīng)答，該免疫應(yīng)答賦予了針對后續(xù)由包括或包含 所述抗原分子或其一部分的實(shí)體進(jìn)行的激發(fā)(challenge)的保護(hù)，因此本發(fā)明可特別作為 疫苗接種方法使用。
[0228] 所述疾病、病癥或感染是可通過產(chǎn)生免疫應(yīng)答進(jìn)行治療或預(yù)防的任何疾病、病癥 或感染，例如通過消除異?；蛲鈦砑?xì)胞來進(jìn)行治療或預(yù)防，所述異?；蛲鈦砑?xì)胞根據(jù)使其 與正常細(xì)胞有所區(qū)別(并被消除）的抗原(或其表達(dá)水平)而被識(shí)別。對所要使用的抗原分子 的選擇決定所要治療的疾病、病癥或感染。基于上述的抗原分子，本文所述的方法、應(yīng)用和 試劑盒等可用于治療或預(yù)防例如感染(例如上文提及的病毒或細(xì)菌感染）、癌癥或多發(fā)性硬 化癥。對所述疾病、病癥或感染的預(yù)防可成為疫苗接種。
[0229] 本文限定的"治療"是指使所要治療的疾病、病癥或感染的一種或多種癥狀與治療 之前相比有所減輕、緩解或消除?！A(yù)防〃是指延遲或阻止疾病、病癥或感染的癥狀的發(fā)作。 預(yù)防可以是絕對的（因此不發(fā)?。?，或可僅對一些個(gè)體或在有限時(shí)間內(nèi)有效。
[0230]對于體內(nèi)施用細(xì)胞，可以使用本領(lǐng)域常用的或標(biāo)準(zhǔn)的任何細(xì)胞群施用模式，例如 通過適當(dāng)途徑注射或輸注。方便的是，細(xì)胞通過淋巴管內(nèi)注射來施用。優(yōu)選的是，每kg受試 者體重施用1 X 104至1 X 108個(gè)細(xì)胞（例如人體中為1.4 X 104/kg至2.8 X 106/kg)。因此，例 如，在人體內(nèi)，可以以〇. 1 X 107至20 X 107細(xì)胞的劑量（即，每劑)施用，例如作為疫苗接種劑 量。必要時(shí)該劑量可在晚些時(shí)候重復(fù)。
[0231] 現(xiàn)在將參考附圖在以下非限制性實(shí)施例中更詳細(xì)描述本發(fā)明：
[0232] 圖1顯示了以抗原卵清蛋白（0VA)和標(biāo)示出的情況下的TPCS2a(PCI)和CpG或R848的 混合物對小鼠進(jìn)行體內(nèi)疫苗接種后血(A)和脾臟(B和C)中的抗原特異性T細(xì)胞％。圖(A)顯 示了疫苗接種7天后血中的抗原特異性CD8+T細(xì)胞％，各圓圈表示一只動(dòng)物。圖（B)顯示疫苗 接種14天后脾臟中的抗原特異性CD8+T細(xì)胞％，各圓圈表示一只動(dòng)物。圖（C)是表示與(B)所 示數(shù)據(jù)相同的柱狀圖。
[0233] 圖2顯示的是來自按圖1圖例所示進(jìn)行接種的小鼠的CD8+脾細(xì)胞在以SIINFEKL抗 原肽進(jìn)行體外刺激后的IFN- y產(chǎn)生程度。通過針對IFN- y的細(xì)胞內(nèi)染色并通過流式細(xì)胞術(shù) 進(jìn)行細(xì)胞分析來完成分析。圖B是表示圖A所示數(shù)據(jù)的柱狀圖。
[0234] _顯示的是來自按圖1圖例所示進(jìn)行接種的小鼠的總脾細(xì)胞在以SIINFEKL抗原 肽進(jìn)行體外刺激后的IFN-y和IL-2產(chǎn)生量。分析通過ELISA完成。圖A和C顯示進(jìn)行和不進(jìn)行 SIINFEKL再刺激的結(jié)果，結(jié)果顯示為不經(jīng)過根據(jù)相應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行校正的來自ELISA測試 的直接讀數(shù)。圖B和D顯示SIINFEKL刺激的樣品的相同數(shù)據(jù)，其中IFN- y和IL-2的濃度根據(jù) 相應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行計(jì)算。
[0235] 里i顯示方案1:合成化合物5的合成路線。試劑和條件：（a)丙酸，回流，1小時(shí) (20%);(13)恥腸2(1.8當(dāng)量），丁卩厶，室溫，3分鐘（67%);(。）511(：12.2112〇，濃11(：1，60°(：，1小時(shí) (88%) ;(d)溴乙酰溴，Et3N，CH2Cl2,室溫，1 小時(shí)（64%); (e)哌嗪，CH2C12,室溫，1 小時(shí) (94%)〇
[0236] 方案2:N-改性殼聚糖衍生物(TPP-CS-TMA&TPP-CS-MP)的合成。此處A-表示第1批 化合物，B-表示第2批化合物。試劑和條件：（a )MeS03H/H20，10 °C~室溫，1小時(shí)，（90 % ); (b) TBDMSC1，咪唑，DMS0，室溫，24小時(shí)（96 % ); (c)溴乙酰溴，Et3N，CH2C12，-20°C，1 小時(shí)（92 % ); (d) 化合物5,即TPP-NH-Pip(0.1 或0.25當(dāng)量）4七北〇1(：13，室溫，2小時(shí)（92%~90%);(6) NMe 3或 1-甲基哌嗪，CHC13，室溫，24小時(shí)；（f)TBAF，NMP，55°C，24小時(shí)或濃HCl/MeOH，室溫，24 小時(shí)。
[0237] 方案3-化合物1、3、20和21的合成方案。反應(yīng)和條件：（a)丙酸，回流，1小時(shí)， (20%) ; (b)NaN02(l .8當(dāng)量），TFA，室溫，3分鐘；（c)SnCl2 ? 2H20,濃HC1，60°C，1小時(shí)， (54 % ); (cU)對甲苯磺酰肼，K2C03，吡啶，回流，24小時(shí)；（d2)鄰氯苯醌，CH 2C12，室溫，（80 % ); (e) 氯乙酰氯，Et3N，CH2C12，室溫，2小時(shí)，原位；（f)哌嗪，CH 2C12，室溫，12小時(shí)，（61 % )?；?物20和21的所有衍生物將含有TPCaj^PCa2異構(gòu)體。但是僅TPCai結(jié)構(gòu)顯示在方案和結(jié)構(gòu)圖 中。
[0238] 方案4-化合物22~28的合成方案。反應(yīng)和條件：（a)乙酰氯，MeOH，回流，24小時(shí)， (87 % ); (b)BF3 ? Et20，CHC13，室溫，對氯苯醌，48小時(shí)，（14 % ); (c) 2N K0H(在MeOH中），THF: 吡啶（10:1)，回流，24小時(shí)（71 % ); (cU)對甲苯磺酰肼，K2C03，吡啶，回流，24小時(shí)；（d2)鄰氯 苯醌，CH2CI2:MeOH(75:25)，室溫，（70 % ); (e)EDCI ? HC1，H0BT，Et3N，N-Boc-哌嗪5，DMF，室 溫，24小時(shí)（54% ); (f )TFA，CH2C12，室溫，1小時(shí)（89% )?；衔?6~28的所有衍生物將含有 TPCcd^PCc2異構(gòu)體。但是僅TPCcd#構(gòu)顯示在方案和結(jié)構(gòu)圖中。
[0239] 方案 5A和 5B:試劑和條件（6A):(a)化合物 21，即，TPC-NH-Pip(0.1 當(dāng)量）、Et3N、 CHC13，室溫，2h(78 % ); (b)NMe3或1-甲基哌嗪，CHC13，室溫，24h。試劑和條件(6b): a)化合物 28, SP，TPC-C0-Pip(0.1 當(dāng)量），Et3N，NMP，75°C，12h(89% ); (b)NMe3或 1-甲基哌嗪，CHC13,室 溫，24h。
[0240] 圖5顯示的是佐劑poly(IC)和CpG的效果。以 10ug 0VA，以 100yg 0VA，以 10yg OVA 和 150yg TPCS2a，以 10yg OVA和50yg 0DN2395 CpG寡核苷酸，以 10yg 0VA、50yg 0DN2395 CpG寡核苷酸和 150yg TPCS2a，以 10yg OVA和50yg Poly(IC)，以lOyg 0VA、50yg Poly(IC)和 150iig TPCS2Jt小鼠進(jìn)行免疫，或不進(jìn)行處理。對接受TPC&j^小鼠進(jìn)行照射。小鼠在第7天 取血，并通過流式細(xì)胞術(shù)分析0VA特異性CD8T細(xì)胞的頻率。在第14天獲得脾細(xì)胞，并以 SIINFEKL肽再刺激，通過干擾素-y ELISA進(jìn)行分析。（A)顯示了實(shí)驗(yàn)組第7天血中的平均值 (總CD8+細(xì)胞中的抗原特異性CD44+細(xì)胞％)(每組5只動(dòng)物，誤差條:平均值的標(biāo)準(zhǔn)誤差）。0) 顯示以SIINFEKL肽再刺激脾細(xì)胞第14天后由干擾素-y (IFN-y )ELISA獲得的結(jié)果。
[0241] _顯示以O(shè)VA和po 1 y (IC)第1次和第2次免疫小鼠后的（總⑶8+細(xì)胞中的抗原特異 性⑶44+細(xì)胞％)平均值。
[0242] &顯示在第2次(第22天)免疫后實(shí)驗(yàn)中各動(dòng)物在第2次免疫后的值(總⑶8+細(xì)胞 中的抗原特異性CD44+細(xì)胞％ )(誤差條是標(biāo)準(zhǔn)誤差）。
[0243] 圖8顯示第2次免疫后TRP-2五聚體染色實(shí)驗(yàn)組的平均值（總⑶8+細(xì)胞中的抗原特 異性⑶44+細(xì)胞％)。
[0244] _顯示了在第1和第2次免疫后利用紅光照射以激活光敏化劑時(shí)實(shí)驗(yàn)組的平均值 (總⑶8+細(xì)胞中的抗原特異性⑶44+細(xì)胞％ )。
[0245] 圖10顯示了第1次(第7天)和第2次（第21天)免疫后實(shí)驗(yàn)組的平均值（總CD8+細(xì)胞 中抗原特異性CD44+細(xì)胞的％ )(誤差條為平均值的標(biāo)準(zhǔn)誤差）。
[0246]圖11顯示了第1次(第7天)和第2次(第21天)免疫實(shí)驗(yàn)組的平均值(總CD8+細(xì)胞中 的抗原特異性⑶44+細(xì)胞％ )。
[0247] 圖12顯示了圖中所示以SIINFEKL肽再刺激或不進(jìn)行再刺激的脾細(xì)胞中平均ELISA 值。
[0248] 圖13顯示了在第1和第2次免疫后實(shí)驗(yàn)組(每組5只動(dòng)物，誤差條是標(biāo)準(zhǔn)偏差）的平 均值(總⑶8+細(xì)胞中的抗原特異性⑶44+細(xì)胞％ )。
[0249] 圖14顯示三次免疫的每一次之后的實(shí)驗(yàn)組的總⑶8+細(xì)胞中的抗原特異性⑶44+細(xì) 胞％。
[0250]圖15顯示3次免疫之后實(shí)驗(yàn)組的總⑶8+細(xì)胞中的抗原特異性⑶44+細(xì)胞％。
[0251]圖16顯示第1和第2次免疫后的實(shí)驗(yàn)組(每組5只動(dòng)物，誤差條是標(biāo)準(zhǔn)偏差）的平均 值(總⑶8+細(xì)胞中的抗原特異性⑶44+細(xì)胞％ )。
[0252]圖17顯示來自三個(gè)實(shí)驗(yàn)組中的典型動(dòng)物在第三次免疫后的流式細(xì)胞術(shù)點(diǎn)狀圖。
[0253] 圖18顯示了3次免疫中每一次之后的平均值(總⑶8+細(xì)胞中的抗原特異性⑶44+細(xì) 胞％)。
[0254] 圖19顯示了在兩次免疫后的實(shí)驗(yàn)組的總CD8+細(xì)胞中的抗原特異性CD44+細(xì)胞％。
[0255] 圖20顯示了在兩次免疫后的實(shí)驗(yàn)組的總CD8+細(xì)胞中的抗原特異性CD44+細(xì)胞％ +/-SEM。 實(shí)施例
[0256] 材料和方法 [0257] 小鼠
[0258] C57BL/6小鼠購自Har 1 an(Horst，荷蘭）。識(shí)別卵清蛋白（0VA)的MHC I類限制表位 0VA257-264的T-細(xì)胞受體轉(zhuǎn)基因0T-I小鼠在蘇黎世大學(xué)設(shè)施中繁殖(原購自Taconic Europe (Ry，丹麥））。所有小鼠保持在專門無病原體(SPF)條件下，所進(jìn)行的程序經(jīng)瑞士獸醫(yī)部門批 準(zhǔn)。在0T-1小鼠中，對T-細(xì)胞受體基因進(jìn)行工程化，從而使這些小鼠中的所有⑶8+T細(xì)胞(稱 為0T-1細(xì)胞)特異性識(shí)別卵清蛋白（0VA)抗原的特定肽表位(SIINFEKL)。
[0259] 免疫程序
[0260] 在第0天，對雌性C57BL/6小鼠在尾靜脈靜脈內(nèi)注射來自Rag2/0T-1小鼠的1.5 X 1 〇6個(gè)脾細(xì)胞。這樣，經(jīng)過接種的小鼠具有如下的CD8T細(xì)胞"背景"：當(dāng)（且僅當(dāng)）其適當(dāng)以MHC I類呈遞在抗原呈遞細(xì)胞時(shí)，其能夠響應(yīng)于來自0VA的SIINFEKL-表位。因此，0T-1細(xì)胞的轉(zhuǎn) 移"擴(kuò)增"經(jīng)接種的小鼠的檢測系統(tǒng)，使得通過測量抗原特異性CD8+T細(xì)胞以及IFN-y和IL-2產(chǎn)生，可以容易地測定體內(nèi)疫苗接種的效果。
[0261] 4小時(shí)后，對動(dòng)物在腹部皮下接種（包含以下規(guī)定成分的2X50iil溶液）。6組動(dòng)物 (每組4只)接種的總劑量為：
[0262] 第1組：25ug TPCS2a(Amphinex)+10iig卵清蛋白（0VA，Grade V，Sigma-Aldrich) 〇
[0263] 第2組：25yg TPCS2a+10yg卵清蛋白+60yg CpG。
[0264] 第3組：25yg TPCS2a+10yg卵清蛋白+100yg R848(雷西莫特）。
[0265] 第4組：10yg卵清蛋白。
[0266] 第5組：lOyg卵清蛋白+60lig CpG。
[0267] 第6組：10yg卵清蛋白+100yg R848(雷西莫特）。
[0268] 所用的CpG寡核苷酸是B型20聚體0DN 1826(由Microsynth(Balgach,瑞士）合成）， 序列為(5Z-TCC ATG ACG TTC CTG ACG TT-3')，具有全硫代磷酸酯(PS修飾)骨架。
[0269] 在第1天，對第1、2和3組的動(dòng)物進(jìn)行麻醉，并利用LumiSource燈(PCI Biotech AS) 以藍(lán)光照射6分鐘。在注射抗原溶液后約18小時(shí)對動(dòng)物進(jìn)行照射，照射的通量率為約13mW/ cm2。第7天，從尾靜脈對小鼠采血，以SIINFEKL五聚體(Pro Immune)以及⑶8和⑶44抗體對血 細(xì)胞染色，以便進(jìn)行流式細(xì)胞術(shù)分析(見以下規(guī)程）。在第14天，將小鼠安樂死，并收集脾臟。 對一份等分試樣的脾細(xì)胞以SIINFEKL肽(EMC Microcollections，Tuebingen，德國）進(jìn)行再 刺激，對細(xì)胞內(nèi)IFN-y表達(dá)進(jìn)行染色，通過流式細(xì)胞術(shù)分析(見下文)進(jìn)行分析。將另一等分 式樣的脾細(xì)胞重懸浮在細(xì)胞培養(yǎng)基中，在不進(jìn)行再刺激的情況下在該培養(yǎng)基中保持過夜 (純粹出于實(shí)踐原因），如上述以SIINFEKL-五聚體染色，通過流式細(xì)胞術(shù)（見下文）進(jìn)行分 析。
[0270] 脾細(xì)胞的SIINFEKL-五聚體
[0271] 對重懸在細(xì)胞培養(yǎng)基中并在不進(jìn)行再刺激的情況下在該培養(yǎng)基中保持過夜(純粹 出于實(shí)踐原因）的細(xì)胞進(jìn)行脾細(xì)胞的SIINFEKL-五聚體染色和流式細(xì)胞術(shù)。
[0272] SIINFEKL-五聚體染色和流式細(xì)胞術(shù)
[0273] 收集5~10滴尾部全血，并加入0.5ml的紅細(xì)胞裂解液(Sigma)。在5~6分鐘后，將 細(xì)胞旋轉(zhuǎn)沉淀，以〇. 5ml PBS洗滌兩次。細(xì)胞沉淀重懸浮在FACS緩沖液(具有0.01 %疊氮化 鈉的2%FCS/roS)中，轉(zhuǎn)移到U形96孔板中，并與FcR封閉抗體（l.Oyl Pharmingen的Anti-CD16/CD32)在冰上溫育10分鐘（lyl+49yl FACS緩沖液）。不經(jīng)過洗滌，加入SIINFEKL-五聚 體-PE(ProImmune; 5ul/樣品），混合并在37°C溫育15分鐘。不經(jīng)過洗滌，加入熒光標(biāo)記的⑶8 或⑶44,達(dá)到1:100的終濃度，并在冰上溫育25至45分鐘。細(xì)胞在100yl FACS緩沖液中洗滌， 并懸浮在l〇〇yl FACS緩沖液中。以FACSCanto對細(xì)胞進(jìn)行分析。
[0274] 脾細(xì)胞離體再刺激
[0275] 通過以下方式分離并制備用于細(xì)胞內(nèi)染色的脾細(xì)胞:將脾壓碎，通過在裂解緩沖 液(Sigma)中攪拌1至2分鐘在2%FCS/roS中分離細(xì)胞，并在2%FCS/roS中洗滌。在24孔板的 每個(gè)孔中加入完全培養(yǎng)基中的lml細(xì)胞懸浮液(500，000細(xì)胞/ml )，并在每個(gè)孔中加入5yg/ ml SIINFEKL，然后在37°C溫育過夜。各孔中加入布雷費(fèi)德菌素A(lμg/ml~2μg/ml)，并在37 °C溫育4小時(shí)。細(xì)胞轉(zhuǎn)移至U形96孔板，在2 % FCS/roS中洗滌，并重懸浮在50yl具有FcR封閉 抗體(Pharmingen的l.Oyl抗-CD16/CD32)的FACS緩沖液中，在冰上溫育10分鐘。不經(jīng)過洗 滌，細(xì)胞與表面抗體⑶8或⑶44冰上溫育20至45分鐘（暗處），以FACS緩沖液洗滌，并通過重 懸在冰上的l〇〇yl多聚甲醛(PFA) (PBS中1 % )中固定10-20分鐘。細(xì)胞以FACS緩沖液洗滌，重 懸浮在100yl NP40(PBS中1 % )中，并冰上溫育3分鐘。在FACS緩沖液中洗滌后，加入熒光標(biāo) 記的干擾素y抗體，并避光在冰上溫育35分鐘。在FACS緩沖液中洗滌和懸浮后，利用Flowjo 8.5.2軟件(Tree Star, Inc.，Ashland,OR)通過FACSCanto對細(xì)胞進(jìn)行分析。
[0276] 流式細(xì)胞術(shù)
[0277] 通過流式細(xì)胞術(shù)(BD Biosciences的FACSCanto,San Jose,美國）確定0VA特異性T 細(xì)胞的頻率。在流式細(xì)胞術(shù)運(yùn)行之前，利用以各抗體分別染色的珠進(jìn)行補(bǔ)償。在抗體染色之 前，利用紅細(xì)胞裂解液（Sigma)將血紅細(xì)胞裂解。對各樣品記錄10 000個(gè)⑶8+事件，利用 Tree Star，Inc.(Ashland，0R)的Flowjo 8 ? 5 ? 2軟件（http : //www ? flow jo ? com/)計(jì)算 SIINFEKL-五聚體陽性細(xì)胞的百分比。
[0278] ELISA
[0279] 利用Ready-set Go !試劑盒（eBioscience)根據(jù)制造商手冊對相關(guān)分子進(jìn)行 ELISA。
[0280]實(shí)施例1 :TLR配體對OVA體內(nèi)疫苗接種的影響
[0281] 通過上述免疫規(guī)程對小鼠體內(nèi)接種。7天后分離血，14天后分離脾臟。用血分析抗 原特異性CD8+T細(xì)胞，對脾細(xì)胞直接分析抗原特異性CD8+T-細(xì)胞，或在體外再刺激后分析 IFN-y或IL-2的產(chǎn)生。
[0282] 血和脾臟中抗原特異性T細(xì)胞的水平
[0283] 通過流式細(xì)胞術(shù)，利用特異性結(jié)合抗原特異性T-細(xì)胞的熒光標(biāo)記的抗原特異性 "五聚體"測定抗原特異性T細(xì)胞的水平。確定了動(dòng)物體內(nèi)總CD8+T細(xì)胞中的抗原特異性CD8+ T細(xì)胞％ (見免疫規(guī)程中描述的染色和流式細(xì)胞術(shù)分析以及SIINFEKL染色的具體內(nèi)容）。
[0284] 將內(nèi)源T細(xì)胞作為效果的抗原特異性的內(nèi)部對照，這是因?yàn)閷細(xì)胞的一般性刺激 還將影響內(nèi)源T細(xì)胞，而不引起抗原特異性細(xì)胞％的增加。通常，在疫苗接種之前和在疫苗 接種之后的時(shí)間點(diǎn)測定0T-1細(xì)胞％。將僅采用抗原的效果（"常規(guī)疫苗接種"）與抗原+PCI的 效果相比較。
[0285] 以抗原離體刺激后脾細(xì)胞中IFN- y產(chǎn)生的水平(流式細(xì)胞術(shù)）
[0286] 對在疫苗接種的第14天移除的脾臟進(jìn)行脾細(xì)胞分離并以SIINFEKL抗原肽再刺激， 并對IFN-y產(chǎn)生進(jìn)行細(xì)胞內(nèi)染色，以便通過以上規(guī)程中描述的流式細(xì)胞術(shù)分析CD8+T細(xì)胞。
[0287] 以抗原離體刺激后脾細(xì)胞中IFN- y和IL-2產(chǎn)生的水平(ELISA)
[0288]對在疫苗接種的第14天移除的脾臟進(jìn)行脾細(xì)胞分離并以SIINFEKL抗原肽再刺激， 并通過以上規(guī)程中描述的ELISA分析IFN-y和IL-2的產(chǎn)生。
[0289] 莖里
[0290] 血和脾臟中抗原特異性T細(xì)胞的水平
[0291] 結(jié)果如圖1所示?？梢钥吹剑?dāng)在第7天進(jìn)行測試時(shí)，與僅用0VA抗原的情況相比 (A)，PCI引發(fā)了顯著更好的效果。CpG寡核苷酸與僅用0VA抗原的情況相比也改善了疫苗接 種，但沒有PCI程度那么大。單獨(dú)的R848與僅用0VA抗原的情況相比沒有改善疫苗接種，相反 其似乎在一定程度上抑制了疫苗接種的效果。與PCI+0VA的效果相比，將PCI與R848或CpG組 合改善了疫苗接種。這種改善在疫苗接種后14天分析脾細(xì)胞時(shí)更明顯(B和C)。可以看出，在 這一時(shí)刻單獨(dú)的PCI+OVA治療的效果已經(jīng)回到了背景水平，對于未使用PCI的R848/CpG+0VA 組也是如此。然而，在R484或CpG與PCI組合的兩組中，觀察到了明顯更好的效果，對于R848 尤其明顯。
[0292]細(xì)胞以抗原離體刺激后脾臟中IFN- y產(chǎn)生的水平(流式細(xì)胞術(shù)）
[0293] IFN-y和IL-2是以抗原刺激后⑶8+T細(xì)胞產(chǎn)生的細(xì)胞因子。結(jié)果如圖2所示。與圖1 所示結(jié)果相符，圖2顯示了 CpG/R848與PCI組合產(chǎn)生了最好的效果，在測試該參數(shù)時(shí)，CpG+ PCI看似好于R848+PCI。還可以看出，單獨(dú)的抗原(OVA)未得到可檢測的結(jié)果，而0VA+PCI引 起了可觀察到的效果。未采用PCI的CpG/R848+0VA組未獲得效果(CpG)，或僅獲得勉強(qiáng)開檢 測到的效果(1?848)，而組合0￥4+0口6+?(：1和0￥4+1?848+?(：1分別比0￥4+?(：1好約6倍和2.5倍。
[0294] 以抗原離體刺激后脾細(xì)胞中IFN- y產(chǎn)生的水平(ELISA)
[0295] 結(jié)果如圖3所示。圖3A和3C中顯示IFN-y和IL-2的產(chǎn)生均在0VA+CpG/R848+PCI組 中最高，并且該產(chǎn)生依賴于SIINFEKL肽抗原的刺激，表明其為是抗原特異性效果。圖B和D顯 示CpG/R848+0VA+PCI組中的效果顯著好于其他治療組。
[0296] 實(shí)施例2:其他TLR配體對0VA體內(nèi)疫苗接種的影響
[0297] 采用上述方法進(jìn)行體內(nèi)疫苗接種。因此，可進(jìn)行上述方法，其中14組（每組4只動(dòng) 物)接種的總劑量為：
[0298] 第1組：250iig TPCS2a(Amphinex)+10iig卵清蛋白（0VA，Grade V，Sigma-Aldrich) 〇
[0299] 第2組：250yg TPCS2a+10yg卵清蛋白+50yg LPS(牙齦卟啉菌）。
[0300] 第3組：250iig TPCS2a+10yg卵清蛋白+50iig LPS(埃希氏大腸桿菌）。
[0301] 第4組：250yg TPCS2a+10yg卵清蛋白+50yg LPS(明尼蘇達(dá)沙門氏菌）。
[0302] 第5組：250yg TPCS2a+10yg卵清蛋白+100yg MPLA(明尼蘇達(dá)沙門氏菌）。
[0303] 第6組：250lig TPCS2a+10yg卵清蛋白+lmg Poly(I:C)。
[0304] 第7組：250iig TPCS2a+10yg卵清蛋白+lmg ssPolyU。
[0305] 第8組：10yg卵清蛋白。
[0306] 第9組：10yg卵清蛋白+50yg LPS(牙齦卟啉菌）。
[0307] 第10組：10yg卵清蛋白+50yg LPS(埃希氏大腸桿菌）。
[0308] 第11組：l〇yg卵清蛋白+5〇yg LPS(明尼蘇達(dá)沙門氏菌）。
[0309] 第12組：10yg卵清蛋白+100yg MPLA(明尼蘇達(dá)沙門氏菌）。
[0310]第 13組：10iig卵清蛋白+lmg Poly(I:C)。
[0311 ]第 14組：10lig卵清蛋白+lmg ssPolyU。
[0312] Poly( I: C)、LPS、MPLA和ssPolyU均獲自 Invivogen。
[0313] 實(shí)施例3:P〇ly(IC)和CpG對OVA體內(nèi)疫苗接種的影響 [0314]材料和方法
[0315] 動(dòng)物
[0316] C57BL/6小鼠購自Harlan(Horst，荷蘭）DCD8T-細(xì)胞受體轉(zhuǎn)基因0T-1小鼠 (B6? 129S6_Rag2tmlFwa Tg(TcraTcrb)llOOMjb)購自Taconic Europe(Ry，丹麥）或Jackson Laboratories (Bar Harbor，Maine) aOT-lCDST細(xì)胞識(shí)別卵清蛋白的H_2Kb_限制表位 311即￡此((^4，&&257-264)。所有小鼠保持在5??條件下，所進(jìn)行的程序得到瑞士和挪威獸 醫(yī)管理結(jié)構(gòu)的批準(zhǔn)。
[0317] 材料和細(xì)胞
[0318] 雞0VA購自Sigma-Aldrich(Buchs，瑞士），SIINFEKL肽購自EMC Microcollections (Tuebingen，德國），Poly(IC)(高M(jìn)W)和CpG寡核昔酸0DN2395購自 InvivoGen(San Diego，美 國）。光敏化劑二磺酸四苯基二氫卟吩（TPCS2a)購自PCI Bi〇tech(LySaker，挪威hOVA、 TPCS 2JPP〇ly(IC)(如果采用)在PBS中混合，保持避光，在制備后60分鐘內(nèi)施用于小鼠。通過 LumiSource?(PCI Biotech)以照射激活TPCS2a〇
[0319] 小鼠的皮內(nèi)光敏化和免疫
[0320]在免疫前一天，從雌性0T-1小鼠體內(nèi)分離脾臟和淋巴結(jié)，從均化細(xì)胞懸浮液中通 過裂解（Sigma-Aldrich的RBC裂解緩沖液Hybri-Max)移除紅細(xì)胞。剩余的細(xì)胞在PBS中洗 滌，通過70mi尼龍粗濾器過濾，通過靜脈注射將2X10 6個(gè)0T-1細(xì)胞注射給受體雌性C57BL/6 小鼠；SIINFEKL特異性CD8T細(xì)胞的適應(yīng)性轉(zhuǎn)移有助于通過流式細(xì)胞術(shù)檢測免疫應(yīng)答。1天或 8小時(shí)后，通過尾部放血對小鼠采血，將血收集在含有肝素的管中用于分析0VA特異性⑶8T 細(xì)胞的基線頻率。
[0321]然后，將小鼠腹部區(qū)域剃毛，并且使用帶有29G針頭的注射器皮內(nèi)注射疫苗，所述 疫苗由0VA或者由OVA、TPCS2a、Po ly (1C) (50yg)或CpG寡核苷酸(50yg)的混合物組成。疫苗保 持避光，并在制備后60分鐘內(nèi)使用。該疫苗在腹部中線的左側(cè)和右側(cè)分兩次注射施用，每次 SOyhOVA使用劑量為10yg或100yg，并且TPCS 2a劑量為150yg。疫苗注射后18小時(shí)，通過腹膜 內(nèi)注射氯胺酮（25mg/kg體重）和賽拉嗪（425mg/kg)的混合物將小鼠麻醉，并放置在 LumiSource光源上(進(jìn)行照射和光敏化劑TPCS 2a激活）。照射時(shí)間為6分鐘。
[0322] 在之后第7和14天，小鼠經(jīng)尾部放血采血，并通過裂解去除紅細(xì)胞，之后通過流式 細(xì)胞術(shù)分析抗原特異性CD8T細(xì)胞。在實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)(第14天），小鼠處以安樂死，并離體分析脾 細(xì)胞。
[0323]免疫應(yīng)答的分析
[0324] 用抗CD8抗體和H_2Kb/SIINFEKL Pro5五聚體（Proimmune，Oxford，英國）染色細(xì) 胞，以進(jìn)行流式細(xì)胞術(shù)分析，從而監(jiān)測血中OVA特異性CD8+T細(xì)胞的頻率。通過流式細(xì)胞術(shù)檢 測CD44的表達(dá)，來進(jìn)一步分析細(xì)胞的活化狀態(tài)。細(xì)胞使用FACSCanto(BD Biosciences，San ]〇86，美國）進(jìn)行分析，并使用？1〇￥]〇8.5.2軟件(1^66 3七31'，1]1〇.，4811]^11(1，010進(jìn)行分析。
[0325] 對于ELISA分析，以0.005μg/ml的SIINFEKL肽在96孔板中對2X105個(gè)脾細(xì)胞進(jìn)行 再刺激。72小時(shí)后，收集上清液并通過ELISA分析IFN-y (eBioscience-根據(jù)制造商的說明 書進(jìn)行）。
[0326] Poly(IC)和 CpG 實(shí)驗(yàn)
[0327] 按照"材料和方法"部分描述進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，疫苗接種后第7天的小鼠血樣通過所述流 式細(xì)胞術(shù)進(jìn)行分析。第14天的脾細(xì)胞以SIINFEKL肽進(jìn)行再刺激，并通過上述干擾素y ELISA 進(jìn)行分析。所有小鼠接受所述0T-1細(xì)胞。
[0328] 以下試驗(yàn)組包括：
[0329] 1.未治療:小鼠接受0T-1細(xì)胞，但未接種或照射。
[0330] 2.0VA:小鼠以10yg 0VA接種。它們未進(jìn)行照射。
[0331] 3.0VA 100yg:小鼠以100yg 0VA混合物接種。它們未進(jìn)行照射。
[0332] 4.0VA 10yg PCI:小鼠以10yg 0VA+150yg TPCS2a混合物接種。如上所述進(jìn)行照射。
[0333] 5.CpG OVA:小鼠以10yg 0VA+50yg 0DN2395 CpG寡核苷酸混合物接種。它們未進(jìn) 行照射。
[0334] 6.CpG 0VA/PCI:小鼠以 10yg 0VA+50yg 0DN2395 CpG寡核苷酸+150yg TPCS2a混合 物接種。如上所述進(jìn)行照射。
[0335] 7.Poly(IC)0VA:小鼠以10yg 0VA+50yg Poly(IC)混合物接種。它們未進(jìn)行照射。
[0336] 8.Poly(IC)0VA/PCI:小鼠以 10yg 0VA+50yg Poly(IC)+150yg TPCS2a混合物接種。 如上所述進(jìn)行照射。
[0337] 圖5A顯示了實(shí)驗(yàn)組的平均值(總⑶8+細(xì)胞中的抗原特異性⑶44+細(xì)胞％)?？梢钥?出CpG和Poly(IC)佐劑在單獨(dú)使用時(shí)均有僅很一般(CpG)或不明顯(Poly(IC)的效果，并且 PCI在單獨(dú)使用時(shí)明顯比這些佐劑中任一種更有效。然而，當(dāng)PCI與CpG或Poly(IC)組合使用 時(shí)刻觀察到明顯的協(xié)同效果，并且組合PCI+Poly (1C)最突出。
[0338] 圖5B示出了SIINFEKL肽重刺激脾細(xì)胞后，干擾素-y (IFN-y )ELISA的結(jié)果。首先， 可以看出IFN-y的產(chǎn)生完全依賴于重刺激(未刺激的細(xì)胞的條勉強(qiáng)可見），表明這種產(chǎn)生具 有嚴(yán)格的抗原特異性。還可以看出，雖然來自CpG或Poly(IC)組的細(xì)胞實(shí)際上沒有效果（單 獨(dú)0VA也沒有效果），但在所有的PCI治療組中可觀察到再刺激的強(qiáng)效果，再次在PCI+CpG和 PCI+Poly(IC)組中可以觀察到協(xié)同效應(yīng)，后者代表了更好的組合。
[0339] 對于實(shí)施例4至16，采用了以下材料和方法：
[0340] 動(dòng)物
[0341] C57BL/6小鼠購自Harlan(Horst，荷蘭）DCD8T-細(xì)胞受體轉(zhuǎn)基因0T-1小鼠 (B6 ? 129S6_Rag2tmlFwa Tg(TcraTcrb) 1 lOOMjb)購自 Taconic Europe(Ry，丹麥）或購自 Jackson Laboratories(Bar Harbor，Maine) qOT-ICDST細(xì)胞識(shí)別卵清蛋白的H_2Kb_限制表 位511即￡此(0￥4，&&257-264)。所有小鼠保持在5??條件下，所進(jìn)行的程序得到瑞士和挪威 獸醫(yī)管理結(jié)構(gòu)的批準(zhǔn)。
[0342] 材料和細(xì)胞
[0343] 雞0VA購自Sigma-Aldrich(Buchs，瑞士），SIINFEKL肽購自EMC Microcollections (Tuebingen，德國），并且TRP-2 (序列SVYDFFVWL)、gp 100 (序列KVPRNQDWL)和HPV 16 E7 (序 列GQAEPDRAHYNIVTFCCKCDSTLRLCVQSTHVDIR，下劃線為CD8表位）獲自United Peptides (此^1(1〇11，￥4)。？〇17(1〇、0口6寡核苷酸00似395、]\031^-3]\1、咪喹莫特和雷西莫特來自 InvivoGen(San Diego，美國）。光敏化劑二磺酸四苯基二氫卟吩(TPCS2a)購自PCI Biotech (1^881?51'，挪威）。
[0344] SIINFEKL、TRP_2和HPV五聚體購自Proimmune(0xford，英國）（Proimmune肽編碼分 別為093、185和5021〇。
[0345] 帶有獲得性轉(zhuǎn)移的0T-1細(xì)胞的小鼠的皮內(nèi)光敏化和免疫
[0346] 在免疫前一天，從雌性0T-1小鼠體內(nèi)分離脾臟和淋巴結(jié)，從均化細(xì)胞懸浮液中通 過裂解（Sigma-Aldrich的RBC裂解緩沖液Hybri-Max)移除紅細(xì)胞。剩余的細(xì)胞在PBS中洗 滌，通過70mi尼龍粗濾器過濾，通過靜脈注射將2X10 6個(gè)0T-1細(xì)胞注射給受體雌性C57BL/6 小鼠；SIINFEKL特異性CD8T細(xì)胞的適應(yīng)性轉(zhuǎn)移有助于通過流式細(xì)胞術(shù)檢測免疫應(yīng)答。1天或 8小時(shí)后，通過尾部放血對小鼠采血，將血收集在含有肝素的管中用于分析0VA特異性⑶8T 細(xì)胞的基線頻率。
[0347] 對于皮內(nèi)免疫，將小鼠腹部區(qū)域剃毛，并且使用帶有29G針頭的注射器皮內(nèi)注射疫 苗，所述疫苗由0VA或者由OVA、TPCS 2a和不同佐劑的混合物組成。疫苗保持避光，并在制備后 60分鐘內(nèi)使用。該疫苗在腹部中線的左側(cè)和右側(cè)分兩次注射施用，每次50yl。疫苗注射后18 小時(shí)，通過腹膜內(nèi)注射氯胺酮(25mg/kg體重)和賽拉嗪(425mg/kg)的混合物將小鼠麻醉，并 根據(jù)各實(shí)驗(yàn)如以下所述進(jìn)行照射。
[0348] 在第7天，小鼠經(jīng)尾放血采血，并通過裂解去除紅細(xì)胞，之后通過流式細(xì)胞術(shù)分析 抗原特異性CD8+T細(xì)胞。在實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)(第14天），小鼠處以安樂死，并離體分析脾細(xì)胞。
[0349] 正常小鼠的皮內(nèi)光敏化和免疫
[0350] 將小鼠腹部區(qū)域剃毛，并且使用帶有29G針頭的注射器皮內(nèi)注射疫苗，所述疫苗由 0VA蛋白或者不同肽抗原(在各實(shí)驗(yàn)中指明）、TPCS 24P不同的疫苗佐劑組成。疫苗保持避光， 并在制備后60分鐘內(nèi)使用。該疫苗在腹部中線的左側(cè)和右側(cè)分兩次注射施用，每次50iU。抗 原和TPCS 2a&不同劑量使用(在各實(shí)驗(yàn)中指明）。在疫苗注射后的特定時(shí)刻(通常為18小時(shí)， 但在一些實(shí)驗(yàn)中不同），通過腹膜內(nèi)注射氯胺酮(25mg/kg體重)和賽拉嗪(425mg/kg)的混合 物將小鼠麻醉，并根據(jù)各實(shí)驗(yàn)所述進(jìn)行照射。
[0351] 在免疫小鼠后第7天(或者在一些情況下為第6天），小鼠經(jīng)尾放血采血，并通過裂 解去除紅細(xì)胞，之后通過流式細(xì)胞術(shù)分析抗原特異性CD8+T細(xì)胞。在一些實(shí)驗(yàn)中，小鼠在各 實(shí)驗(yàn)所規(guī)定的時(shí)間點(diǎn)接受多次(2或3次)免疫。在這些情況下，在免疫后6或7天取血樣，并通 過如下所述的流式細(xì)胞術(shù)進(jìn)行分析。
[0352] 經(jīng)免疫小鼠的照射
[0353] 在一些實(shí)驗(yàn)中，通過以LumiSource?(PCI Biotech)照射活化TPCS2a。通常，在免疫 后18小時(shí)以LumiSource照射6分鐘，但在一些實(shí)驗(yàn)中有如下所述的改變。在其他實(shí)驗(yàn)中，如 下所述使用基于LED的發(fā)藍(lán)光照射明設(shè)備(PCI Biotech AS)，并且在一些實(shí)驗(yàn)中，采用PCI 652nm激光系統(tǒng)SN 576003二極管激光(PCI Biotech AS)進(jìn)行照射。
[0354] 通過五聚體染色進(jìn)行免疫應(yīng)答分析
[0355] 在以抗CD8和抗CD44抗體以及與所用抗原對應(yīng)的不同的五聚體對細(xì)胞染色后，通 過流式細(xì)胞術(shù)檢測抗原特異性CD8T細(xì)胞的頻率。通過流式細(xì)胞術(shù)測試CD44表達(dá)，從而分析 細(xì)胞的活化狀態(tài)。細(xì)胞使用FACSCanto(BD Biosciences，San Jose,美國）進(jìn)行分析，并使用 FlowJo8.5.2軟件（Tree Star，Inc.，Ashland，0R)進(jìn)行分析。
[0356] 通過ELISA分析免疫應(yīng)答
[0357] 對于ELISA分析，以0.005μg/ml的SIINFEKL肽在96孔板中對2X105個(gè)脾細(xì)胞進(jìn)行 再刺激。72小時(shí)后，收集上清液并通過ELISA分析IFN-y (eBioscience-根據(jù)制造商的說明 書進(jìn)行）。
[0358] 實(shí)施例4:正常小鼠中以0VA和Poly (1C)進(jìn)行PCI的效果
[0359] 如以上對正常小鼠疫苗接種所述進(jìn)行該實(shí)驗(yàn)。如以下規(guī)定以200yg 0VA蛋白、150y g TPCS24P50yg poly(IC)的混合物在第0天和第14天免疫動(dòng)物。在免疫后18小時(shí)以 LumiSource照明設(shè)備進(jìn)行6分鐘照射。每次免疫后第7天的血樣以SIINFEKL五聚體、CD8和 CD44抗體染色，并按所述通過流式細(xì)胞術(shù)進(jìn)行分析。包括以下實(shí)驗(yàn)組：
[0360] 1.未治療:小鼠未免疫或照射。
[0361] 2.0VA 200:小鼠以200yg的0VA接種。它們未進(jìn)行照射。
[0362] 3.0VA 200/PCI:小鼠以200yg OVA和150yg TPCS2a混合物接種并進(jìn)行照射。
[0363] 4.0VA 200/poly(IC):小鼠以200yg OVA和50yg poly(IC)混合物接種。它們未進(jìn) 行照射。
[0364] 5.0VA 200/poly(IC):小鼠以200yg 0VA、150yg TPCS24P50yg poly(IC)混合物接 種并進(jìn)行照射。
[0365] 圖6顯示了第1和第2次免疫后實(shí)驗(yàn)組(每組5只動(dòng)物）的平均值(總⑶8+細(xì)胞中的抗 原特異性CD44+細(xì)胞％)?？梢钥闯鎏貏e是在第2次免疫后，與僅采用poly(IC)(第4組)或僅 采用PCI(第3組)相比，PCI和poly(IC)的組合(第5組)得到了明顯更好的免疫。
[0366] 實(shí)施例5:正常小鼠中以311見^此和口〇17(1〇進(jìn)行?(：1的效果
[0367] 如以上對正常小鼠疫苗接種所述進(jìn)行該實(shí)驗(yàn)。如以下規(guī)定以lOOyg SIINFEKL肽、 100yg TPCS24P10yg poly(IC)的混合物在第0天和第15天免疫動(dòng)物。在免疫后18小時(shí)以 LumiSource照明設(shè)備進(jìn)行6分鐘照射。每次免疫后第7天的血樣以SIINFEKL五聚體、CD8和 CD44抗體染色，并按所述通過流式細(xì)胞術(shù)進(jìn)行分析。包括以下實(shí)驗(yàn)組：
[0368] 1.未治療:小鼠未免疫或照射。
[0369] 2.SIIN 100:小鼠以100yg的SIINFEKL肽免疫。它們未進(jìn)行照射。
[0370] 3.SIIN 100/PCI :小鼠以 100yg的SIINFEKL肽和 100yg TPCS2J9混合物免疫并進(jìn)行 照射。
[0371] 4.SIIN 100/poly(IC):小鼠以 100yg的SIINFEKL肽和 10yg poly(IC)的混合物免 疫。它們未進(jìn)行照射。
[0372] 5.SIIN 100/poly(IC)/PCI:小鼠以lOOygde SIINFEKL肽/100yg TPCS2jP10yg的 Poly (1C)混合物免疫并進(jìn)行照射。
[0373] 圖7顯示了第2次免疫后實(shí)驗(yàn)中各動(dòng)物的值，表明通過PCI+Poly(IC)組合(第5組）， 所有動(dòng)物均響應(yīng)于免疫，而在其他組中僅有一只微弱響應(yīng)的動(dòng)物(在SIIN 100/PCI組中）。
[0374] 實(shí)施例6:正常小鼠中黑色素瘤抗原肽和poly(IC)的效果
[0375] 如以上對正常小鼠疫苗接種所述進(jìn)行該實(shí)驗(yàn)。如以下規(guī)定以TRP-2肽和gp-100肽 (各50yg)、100yg TPCS2JP10yg poly(IC)的混合物在第0天和第14天免疫動(dòng)物。在免疫后18 小時(shí)以LumiSource照明設(shè)備進(jìn)行6分鐘照射。每次免疫后第7天的血樣以TRP-2五聚體、CD8 和CD44抗體染色，并按所述通過流式細(xì)胞術(shù)進(jìn)行分析。包括以下實(shí)驗(yàn)組：
[0376] 1.未治療的TRP-2:小鼠未免疫或照射，血樣以TRP-2五聚體染色。
[0377] 2.TRP-2/poly(IC):小鼠以TRP-2和gplOO肽和 10yg poly(IC)的混合物免疫。它們 未進(jìn)行照射。血樣以TRP-2五聚體染色。
[0378] 3.TRP-2/PCI:小鼠以TRP-2和gplOO肽和100yg TPCS2J9混合物免疫并進(jìn)行照射。 血樣以TRP-2五聚體染色。
[0379] 4.TRP-2/poly(IC)/PCI:小鼠以 TRP-2 和 gplOO 肽、100yg TPCS2jP10yg poly(IC) 的混合物免疫并進(jìn)行照射。血樣以TRP-2五聚體染色。
[0380]圖8顯示了第2次免疫后TRP-2五聚體染色實(shí)驗(yàn)組的平均值（總⑶8+細(xì)胞中的抗原 特異性CD44+細(xì)胞％ )?？梢钥闯觯?dāng)TRP-2抗原與單獨(dú)的poly(IC)(第2組）或與單獨(dú)的PCI (第3組)使用時(shí)，在抗原特異性細(xì)胞中沒有觀察到超過未治療動(dòng)物中所觀察到的明顯響應(yīng)。 相比之下，poly(IC)和PCI的組合(第4組)產(chǎn)生了明確的協(xié)同效果，使得抗原特異性⑶8+T細(xì) 胞數(shù)量顯著增加。
[0381] 實(shí)施例7:正常小鼠中提供紅光照射分析以0VA和poly(IC)進(jìn)行的PCI
[0382] 如"材料和方法"中對正常小鼠疫苗接種所述進(jìn)行該實(shí)驗(yàn)。如以下規(guī)定以lOyg或 100yg 0VA蛋白、150yg TPCS24P10或50yg poly(IC)的混合物在第0天和第14天免疫動(dòng)物。 以PCI 652nm激光系統(tǒng)SN576003二極管激光器，通過以0.81mW/cm2光通量遞送的0.3J/cm2的 光劑量進(jìn)行照射（即，照射時(shí)間約6分鐘）。每次免疫后第7天的血樣以SIINFEKL五聚體、CD8 和CD44抗體染色，并按所述通過流式細(xì)胞術(shù)進(jìn)行分析。包括以下實(shí)驗(yàn)組：
[0383] 1.未治療:小鼠未免疫或照射。
[0384] 2.0VA 10:小鼠以10yg的0VA免疫。它們未進(jìn)行照射。
[0385] 3.0VA 100:小鼠以100yg的0VA免疫。它們未進(jìn)行照射。
[0386] 4.0VA 10/紅光PCI:小鼠以10yg 0VA和150yg TPCS2a混合物免疫并進(jìn)行照射。
[0387] 5.0VA 100/紅光PCI:小鼠以100yg 0VA和150yg TPCS2a混合物免疫并進(jìn)行照射。
[0388] 6.0VA 10/紅光 PCI+poly(IC):小鼠以 10yg 0VA、150yg TPCS24P50yg poly(IC) (第1次疫苗接種)或1 〇yg P〇ly(ic)(第2次疫苗接種)混合物免疫，并進(jìn)行照射。
[0389] 7.0VA 100/紅光PCI+poly(IC):小鼠以 100yg 0VA、150yg TPCS2jP50yg poly(IC) (第1次免疫)或1 〇yg P〇ly(ic)(第2次免疫)混合物免疫，并進(jìn)行照射。
[0390] 圖9顯示了第1和第2次免疫后紅光照射以激活光敏化劑的實(shí)驗(yàn)組的平均值(總⑶8 +細(xì)胞中的抗原特異性⑶44+細(xì)胞％)?？梢钥闯觯瑢τ?0yg的0VA抗原，需要poly(IC)和PCI (第6組)的組合來實(shí)現(xiàn)免疫應(yīng)答，單獨(dú)的抗原或抗原與PCI組合(第4組)未獲得免疫效果。對 于100yg的0VA抗原，單獨(dú)的抗原稍有效果(第3組），但poly(IC)+PCI組合(第7組）的效果明 顯更好。
[0391] 實(shí)施例8:正常小鼠中以SIINFEKL和poly (1C)進(jìn)行PCI的分析
[0392] 如以上對正常小鼠疫苗接種所述進(jìn)行該實(shí)驗(yàn)。如以下規(guī)定以50yg SIINFEKL肽、 100yg TPCS24P10yg poly(IC)的混合物在第0天和第14天免疫動(dòng)物。在免疫后18小時(shí)以 LumiSource照明設(shè)備進(jìn)行6分鐘照射。每次免疫后第7天的血樣以SIINFEKL五聚體、CD8和 CD44抗體染色，并按所述通過流式細(xì)胞術(shù)進(jìn)行分析。包括以下實(shí)驗(yàn)組：
[0393] 1.未治療:小鼠未免疫或照射。
[0394] 2.SIIN 50:小鼠以50yg的SIINFEKL肽免疫。它們未進(jìn)行照射。
[0395] 3.SIIN 50/PCI:小鼠以50yg的SIINFEKL肽和100yg TPCS2J9混合物免疫并進(jìn)行照 射。
[0396] 4.SIIN 50/poly(IC):小鼠以 100yg 的 SIINFEKL 肽和 10yg poly(IC)的混合物免 疫。它們未進(jìn)行照射。
[0397] 5.SIIN 50/poly(IC)/PCI:小鼠以50yg的SIINFEKL肽、100yg TPCS24P10yg的Poly (1C)的混合物免疫并進(jìn)行照射。
[0398]圖10顯示了第1次(第7天)和第2次（第21天)免疫后實(shí)驗(yàn)組的平均值（總⑶8+細(xì)胞 中的抗原特異性CD44+細(xì)胞％)(誤差條為平均值的標(biāo)準(zhǔn)誤差）?？梢钥闯?，poly(IC)和PCI的 組合(第5組)產(chǎn)生了強(qiáng)免疫應(yīng)答，而在其它任何組都沒有觀察到應(yīng)答。poly(IC)+PC組合因 此產(chǎn)生了強(qiáng)協(xié)同效果。
[0399] 實(shí)施例9:正常小鼠中以SIINFEKL和poly(IC)進(jìn)行PCI的分析
[0400] 如以上對正常小鼠疫苗接種所述進(jìn)行該實(shí)驗(yàn)。如以下規(guī)定以lOOiig SIINFEKL肽/ 150yg TPCS2JP50yg poly(IC)(后者僅在第1次免疫中使用）的混合物在第0天和第14天免 疫動(dòng)物。在免疫后18小時(shí)以LumiSource照明設(shè)備進(jìn)行6分鐘照射。每次免疫后第7天的血樣 以SIINFEKL五聚體、⑶8和⑶44抗體染色，并按所述通過流式細(xì)胞術(shù)進(jìn)行分析。在第28天，處 死動(dòng)物，收集脾臟并以SIINFEKL肽再刺激脾細(xì)胞并按照方法中所述通過ELISA進(jìn)行分析。包 括以下實(shí)驗(yàn)組：
[0401] 1.未治療:小鼠未免疫或照射。
[0402] 2. 2XSIIN 100:小鼠在兩次免疫中均以100yg的SIINFEKL肽免疫。它們未進(jìn)行照 射。
[0403] 3. 2XSIIN 100/PCI:小鼠在兩次免疫中均以 100yg的SIINFEKL肽和 150yg TPCS2a 免疫，并進(jìn)行照射。
[0404] 4. 1XSIIN 100/poly(IC)/lXSIIN 100:小鼠以 100yg 的 SIINFEKL 肽和 50yg P〇ly(IC)的混合物(第1次免疫)免疫;和100yg的SIINFEKL肽(第2次免疫)免疫。它們未進(jìn)行 照射。
[0405] 5. 1XSIIN 100/poly(IC)/PCI;lXSIIN 100/PCI:小鼠以 100yg 的 SIINFEKL 肽、 150yg TPCS24P50yg poly(IC)的混合物(第 1次免疫)免疫;和 100yg的SIINFEKL肽和 150yg TPCS2j^混合物(第2次免疫)免疫。它們在兩次免疫中均進(jìn)行照射。
[0406]圖11顯示了第1次(第7天)和第2次(第21天)免疫后實(shí)驗(yàn)組的平均值(總⑶8+細(xì)胞 中的抗原特異性⑶44+細(xì)胞％)?？梢钥闯?，poly(IC)和PCI的組合(第5組)給出了非常好的 免疫應(yīng)答，即使該組合僅用于第1次免疫而第2次免疫僅使用PCI時(shí)也是如此。
[0407]圖12顯示如圖中所示以SIINFEKL肽進(jìn)行再刺激或未進(jìn)行再刺激的脾細(xì)胞中的平 均ELISA值?？梢钥闯觯?dāng)?shù)?實(shí)驗(yàn)組(第1次免疫以PCI和poly(IC)組合進(jìn)行;第2次免疫僅以 PCI進(jìn)行）中進(jìn)行的治療引起了再刺激后干擾素-Y產(chǎn)生的顯著提高時(shí)，在任何其它實(shí)驗(yàn)組 中未觀察到此情況。
[0408] 實(shí)施例10 :MPLA或咪喹莫特效果的分析
[0409] 如以上對正常小鼠疫苗接種所述進(jìn)行該實(shí)驗(yàn)。如以下規(guī)定以200yg 0VA蛋白、lOOy g TPCS2a和50yg咪喹莫特或10yg MPLA-SM的混合物在第0天和第14天免疫動(dòng)物。在免疫后 18小時(shí)以LumiSource照明設(shè)備進(jìn)行6分鐘照射。每次免疫后第7天的血樣以SIINFEKL五聚 體、⑶8和⑶44抗體染色，并按所述通過流式細(xì)胞術(shù)進(jìn)行分析。包括以下實(shí)驗(yàn)組：
[0410] 1.未治療:小鼠未免疫或照射。
[0411] 2.0VA 200:小鼠以200yg的0VA免疫。它抹進(jìn)行照射。
[0412] 3.0VA 200/PCI:小鼠以200yg 0VA和100yg TPCS2d^混合物免疫并進(jìn)行照射。
[0413] 4.0VA 200/咪喹莫特:小鼠以200yg 0VA和50yg咪喹莫特的混合物免疫。它們未進(jìn) 行照射。
[0414] 5.0VA 200/咪喹莫特/PCI:小鼠以200yg 0VA、100yg TPCS24P50yg咪喹莫特的混 合物免疫，并進(jìn)行照射。
[0415] 6.0VA 200/MPLA:小鼠以200yg 0VA和10yg MPLA-SM的混合物免疫。它們未進(jìn)行照 射。
[0416] 7.0VA 200/MPLA/PCI:小鼠以200yg 0VA、100yg TPCS24P10yg MPLA-SM的混合物 免疫，并進(jìn)行照射。
[0417] 圖13顯示了第1和第2次免疫后實(shí)驗(yàn)組(每組5只動(dòng)物，誤差條是標(biāo)準(zhǔn)偏差）的平均 值(總⑶8+細(xì)胞中的抗原特異性⑶44+細(xì)胞的％ )?？梢钥闯?，對于咪喹莫特(第5組)和MPLA 佐劑(第7組），當(dāng)均使用0VA蛋白作為抗原時(shí)，與僅使用佐劑實(shí)現(xiàn)的效果(分別為第4組和第6 組)相比與PCI組合引發(fā)了明顯更好的免疫效果。
[0418] 實(shí)施例11:在正常小鼠中以SIINFEKL和poly(IC)進(jìn)行PCI、第3次免疫后的記憶應(yīng) 答
[0419] 如"材料和方法"中對正常小鼠疫苗接種所述進(jìn)行該實(shí)驗(yàn)。如以下規(guī)定以50yg SIINFEKL肽、100yg TPCS2a和10yg ?〇17(1〇的混合物在第0天和第14天免疫動(dòng)物。通過 poly (IC)+PCI治療在第51天以第3次免疫測試免疫記憶的產(chǎn)生。在免疫后18小時(shí)以 LumiSource照明設(shè)備進(jìn)行6分鐘照射。每次免疫后第8天(第1次免疫）、第7天(第2次免疫)或 第6天(第3次免疫）的血樣以SIINFEKL五聚體、CD8和⑶44抗體染色，并按所述通過流式細(xì)胞 術(shù)進(jìn)行分析。包括以下實(shí)驗(yàn)組：
[0420] 1.未治療:小鼠未免疫或照射。
[0421] 2.SIIN50Poly(IC)/Poly(IC)+PCI:在前兩次免疫中，小鼠以50yg的SIINFEKL肽和 l〇yg的P〇ly(IC)免疫。它們未進(jìn)行照射。在第3次免疫中，小鼠以50yg的SIINFEKL肽、100yg 的TPCS 2JP1 Oyg的po 1 y (IC)免疫。小鼠進(jìn)行照射。
[0422] 3.SIIN50Poly(IC)+PCI/SIIN 50PCI:在前兩次免疫中，小鼠以50yg的SIINFEKL 肽、l〇〇yg的TPCSdPlOyg的poly(IC)免疫。在第3次免疫中，小鼠以50yg的SIINFEKL肽和100 yg的TPCS 2a免疫。小鼠在三次免疫中均接受照射。
[0423] 圖14顯示了三次免疫中每一次后實(shí)驗(yàn)組的值（總⑶8+細(xì)胞中的抗原特異性⑶44+ 細(xì)胞％)?？梢钥闯?，P〇ly(IC)和PCI的組合引發(fā)了非常強(qiáng)的免疫應(yīng)答，由第3次免疫導(dǎo)致應(yīng) 答顯著增加，即使僅以PCI進(jìn)行第3次免疫時(shí)也是如此(第3組）。相反，當(dāng)在前兩次免疫中僅 采用poly(IC)時(shí)，實(shí)際上沒有免疫應(yīng)答，并且以poly(IC)+PCI進(jìn)行第3次免疫未將免疫增強(qiáng) 至任何有效程度。將圖11和圖12中所示結(jié)果一同考慮，所示結(jié)果表明對于肽抗原，poly(IC) 和PCI的組合是必需的，并且足以引發(fā)免疫應(yīng)答，但該免疫應(yīng)答后續(xù)可僅以PCI進(jìn)行增強(qiáng)。反 過來，單獨(dú)的poly(IC)不能引發(fā)免疫應(yīng)答，即使在以poly(IC)進(jìn)行兩次免疫后也不能引發(fā) 免疫應(yīng)答，并且未觀察到免疫應(yīng)答，以p〇ly(IC)+PCI進(jìn)行第3次疫苗接種嘗試增強(qiáng)該應(yīng)答沒 有成功，表明單獨(dú)的poly(IC)完全不能引發(fā)免疫應(yīng)答。數(shù)據(jù)還顯示以poly(IC)+PCI組合產(chǎn) 生的免疫應(yīng)答是持久的，這是因?yàn)槠淇杀辉诘?次免疫后的第37天給予的第3次免疫大大增 強(qiáng)。
[0424] 實(shí)施例12:正常小鼠中以HPV肽抗原和poly (1C)進(jìn)行PCI的效果
[0425] 如"材料和方法"中對正常小鼠疫苗接種所述進(jìn)行該實(shí)驗(yàn)。如以下規(guī)定以50yg HPV 或SIINFEKL肽抗原、100yg TPCS2JP10yg poly(IC)的混合物在第0天和第14天免疫動(dòng)物。動(dòng) 物如以下規(guī)定在第7、14和51天接受3次免疫。在免疫后18小時(shí)以LumiSource照明設(shè)備進(jìn)行6 分鐘照射。各次免疫后第8天(第1次免疫）、第7天(第2次免疫)或第6天(第3次免疫）的血樣 以HPV或SIINFEKL五聚體、⑶8和⑶44抗體染色，并按所述通過流式細(xì)胞術(shù)進(jìn)行分析。包括以 下實(shí)驗(yàn)組：
[0426] 1.未治療SIIN:小鼠未被免疫或照射。血樣以SIINFEKL五聚體染色。
[0427] 2.未治療HPV:小鼠未被免疫或照射。血樣以HPV五聚體染色。
[0428] 3.SIIN50Poly(IC)/Poly(IC)+PCI:在前兩次免疫中，小鼠以50yg的SIINFEKL肽和 l〇yg的P〇ly(IC)免疫。它們未進(jìn)行照射。在第3次免疫中，小鼠以50yg的SIINFEKL肽、100yg 的TPCS 2JP1 Oyg的po 1 y (IC)免疫。小鼠進(jìn)行照射。
[0429] 4. HPV 50:小鼠在所有三次免疫中均以50yg的HPV肽免疫。小鼠未被照射。
[0430] 5.HPV 50/PCI/HPV 50poly(IC)+PCI(第3次）：在前兩次免疫中，小鼠以50yg的HPV 肽和100yg的TPCS2a免疫。在第3次免疫中，小鼠以50yg的HPV肽、100yg的TPCS 24P10yg的 P〇 ly (1C)免疫。小鼠在所有三次免疫中均照射。
[0431] 6.HPV 50/Poly(IC)/HPV 50poly(IC)+PCI(第3次）：在前兩次免疫中，小鼠以50yg 的HPV肽和10yg的poly(IC)免疫。它們未進(jìn)行照射。在第3次免疫中，小鼠以50yg的HPV肽、 100y g的TPCS2JP1 Oyg的po 1 y (IC)免疫。小鼠進(jìn)行照射。
[0432] 圖15顯示了三次免疫后實(shí)驗(yàn)組的（總⑶8+細(xì)胞中的抗原特異性⑶44+細(xì)胞％ )?？?以看出，在第6組中，引起了HPV特異性免疫應(yīng)答，其量級與在相同免疫條件下以SIINFEKL肽 (第3組)取得的免疫應(yīng)答相同。這表明PCI和p 〇ly(IC)組合還可有效引起針對病毒和癌癥相 關(guān)HPV E7抗原的免疫應(yīng)答，并且PCI+Poly(1C)引起了針對長的肽抗原(35個(gè)氨基酸)的免疫 應(yīng)答，這可能需要其以MHC I類呈遞之前細(xì)胞內(nèi)攝入和蛋白水解加工。與此相反的是 SIINFEKL和黑色素瘤肽抗原，它們可不經(jīng)過加工就呈遞。
[0433] 實(shí)施例13:照射時(shí)機(jī)的影響
[0434] 如以上對正常小鼠疫苗接種所述進(jìn)行該實(shí)驗(yàn)。如以下規(guī)定以200yg 0VA蛋白、150y g TPCS^PlOyg的poly(IC)在第0天和第14天免疫動(dòng)物。在所有組中，TPCS2a在照射之前18 小時(shí)注射，而0VA抗原和poly (1C)或者在照射之前18小時(shí)與TPCS2Jg合注射，或者在照射前2 小時(shí)單獨(dú)注射。以L u m i S 〇 u r c e照明設(shè)備進(jìn)行6分鐘照射。每次免疫后第7天的血樣以 SIINFEKL五聚體、CD8和⑶44抗體染色，并按所述通過流式細(xì)胞術(shù)進(jìn)行分析。包括以下實(shí)驗(yàn) 組：
[0435] 1.未治療:小鼠未免疫或照射。
[0436] 2.0VA 200:小鼠以200yg的0VA免疫。它們并未接受TPCS2a并且未進(jìn)行照射。
[0437] 3.0VA 200 PCI(2h):小鼠在照射前18小時(shí)注射TPCS2a，并在照射前2小時(shí)以200yg 的OVA免疫。
[0438] 4.0VA 200 PCiaSh):小鼠在照射前 18小時(shí)以TPCSdPOVA免疫。
[0439] 5.0VA 200 PCI P(IC)(2h):小鼠在照射前18小時(shí)注射TPCS2a，并在照射前2小時(shí)以 200yg的0VA+10yg Poly(IC)免疫。
[0440] 圖16顯示了第1和第2次免疫后實(shí)驗(yàn)組(每組5只動(dòng)物，誤差條是標(biāo)準(zhǔn)偏差）的平均 值（總CD8+細(xì)胞中抗原特異性CD44+細(xì)胞的％ )，可以看出，當(dāng)僅在照射前2小時(shí)施用抗原+ poly(IC)時(shí)，免疫應(yīng)答被poly(IC)+PCI組合增強(qiáng)。
[0441 ] 實(shí)施例14:正常小鼠中以SIINFEKL肽和poly(IC)進(jìn)行PCI的效果(通過三次免疫比 較PCI+poly(1C)和poly(1C))
[0442]如以上材料和方法中對正常小鼠疫苗接種所述進(jìn)行該實(shí)驗(yàn)。如以下規(guī)定以50yg SIINFEKL肽和100yg TPCS2a和10yg poly(IC)的混合物在第0天、第14天和第42天免疫動(dòng) 物。在免疫后18小時(shí)以Lumi Source照明設(shè)備進(jìn)行6分鐘照射。每次免疫后第7天的血樣以 SIINFEKL五聚體、CD8和⑶44抗體染色，并按所述通過流式細(xì)胞術(shù)進(jìn)行分析。包括以下實(shí)驗(yàn) 組：
[0443] 1.未治療SIIN:鼠未免疫或照射，血樣以SIIN五聚體染色。
[0444] 2.SIIN/poly(IC):小鼠以50yg SIINFEKL肽和 10yg poly(IC)的化合物免疫三次。 它們未進(jìn)行照射。
[0445] 3.SIIN/poly(IC)/PCI:小鼠以50yg SIINFEKL肽、100yg TPCS2jP10yg poly(IC) 的混合物免疫并進(jìn)行照射。
[0446]圖17顯示了三個(gè)實(shí)驗(yàn)組中典型動(dòng)物第3次免疫后的流式細(xì)胞術(shù)點(diǎn)狀圖，清楚表明 由poly(IC)+PCI組合引起了非常強(qiáng)的應(yīng)答。
[0447] 圖18顯示了3次免疫中每一次后的平均值（總⑶8+細(xì)胞中抗原特異性⑶44+細(xì)胞 的％)。可以看出，PCI+Poly(IC)組合引發(fā)了非常強(qiáng)的免疫應(yīng)答，導(dǎo)致第3次免疫后的血樣中 有約30%的抗原特異性CD8T細(xì)胞。相比之下，僅以抗原和poly(IC)佐劑進(jìn)行3次免疫只產(chǎn)生 了非常小的效果(第3次免疫后0.28%陽性細(xì)胞）。
[0448] 實(shí)施例15:正常小鼠中以HPV長肽抗原和poly (1C)進(jìn)行PCI的效果
[0449] 如以上對正常小鼠疫苗接種所述進(jìn)行該實(shí)驗(yàn)。H P V 1 6 E 7序列 GQAEPDRAHYNIVTFCCKCDSTLRLCVQSTHVDIR用作"長"肽抗原。以550yg HPV長肽抗原、100yg TPC&JPlOyg p〇ly(IC)(以下規(guī)定的p(IC))的混合物在第0天和第14天免疫動(dòng)物。如以下規(guī) 定在第7和14天對動(dòng)物進(jìn)行2次免疫。在免疫后18小時(shí)以LumiSource照明設(shè)備進(jìn)行6分鐘照 射。每次免疫后第6天的血樣以HPV五聚體、CD8和⑶44抗體染色，并按所述通過流式細(xì)胞術(shù) 進(jìn)行分析。包括以下實(shí)驗(yàn)組：
[0450] 1.2 X HPV:小鼠以50yg HPV長肽免疫兩次。小鼠未進(jìn)行光照。
[0451 ] 2.2XHPV+p(IC):小鼠以50yg HPV長肽和10yg poly(IC)的混合物免疫兩次。小鼠 未進(jìn)行光照。
[0452] 3.2XHPV+p(IC)+PCI:小鼠以50yg HPV長肽、10yg poly(IC)和 100yg TPCS2j^g 合物免疫兩次。小鼠在兩次免疫中均進(jìn)行照射。
[0453] 4.1:冊￥+口（1〇+卩(：1.2:冊￥+?(：1:小鼠以50噸冊￥長肽、10辟口〇17(1〇和100辟 TPCS 2a的混合物免疫(第1次免疫），并以50yg HPV長肽和100yg TPCS2a的混合物免疫(第2次 免疫）。小鼠在兩次免疫中均進(jìn)行照射。
[0454] 5.1:HPV+PCI.2:HPV+p(IC)+PCI:小鼠以50yg HPV長肽和 100yg TPCS2j^g合物免 疫(第1次免疫），并以50yg HPV長肽、10yg poly(IC)和100yg TPCS2a的混合物免疫(第2次免 疫）。小鼠在兩次免疫中均進(jìn)行照射。
[0455] 圖19顯示了兩次免疫后實(shí)驗(yàn)組的（總⑶8+細(xì)胞中的抗原特異性⑶44+細(xì)胞％)。可 以看出，與未采用PCI的實(shí)驗(yàn)組(第1和2組)相比，在第3組中（以PCI+p(IC)組合免疫兩次）弓丨 發(fā)了強(qiáng)HPV特異性免疫應(yīng)答，而在第4和5組中（以PCI+p(IC)組合免疫一次，以僅PCI免疫一 次)觀察到了較弱但仍顯著的免疫應(yīng)答。這表明PCI和poly(IC)組合可有效引起針對病毒和 癌癥相關(guān)HPV E7抗原的免疫應(yīng)答，并且以該組合進(jìn)行兩次免疫更有效:一次該組合免疫，結(jié) 合一次僅以PCI進(jìn)行的免疫。還表明對于HPV長肽抗原，當(dāng)不與PCI組合使用時(shí)，p(IC)佐劑無 效。
[0456] 實(shí)施例16:正常小鼠中以HPV短肽抗原和poly (1C)進(jìn)行PCI的效果
[0457] 如以上對正常小鼠疫苗接種所述進(jìn)行該實(shí)驗(yàn)。HPV 16 E7 CD8表位RAHYNIVTF用作 "短"肽抗原。以50yg HPV短肽抗原、100yg TPCSdPlOyg poly(IC)(以下規(guī)定的p(IC))的混 合物在第〇天和第13天免疫動(dòng)物。如以下規(guī)定在第7和13天對動(dòng)物進(jìn)行2次免疫。在免疫后18 小時(shí)以LumiSource照明設(shè)備進(jìn)行6分鐘照射。每次免疫后第6天的血樣以HPV五聚體、CD8和 CD44抗體染色，并按所述通過流式細(xì)胞術(shù)進(jìn)行分析。包括以下實(shí)驗(yàn)組：
[0458] 1.未治療:小鼠未免疫后照射。
[0459] 2. 2XHPV短:小鼠以50ygHPV短肽免疫兩次。小鼠未進(jìn)行光照。
[0460] 3. 2XHPV短+p(IC):小鼠以50yg HPV短肽和10yg poly(IC)的混合物免疫兩次。 小鼠未進(jìn)行光照。
[0461 ] 4. 2XHPV短+PCI:小鼠以50yg HPV短肽、10yg poly(IC)和 100yg TPCS2j9混合物 免疫兩次。小鼠在兩次免疫中均進(jìn)行照射。
[0462] 5. 2XHPV短+p(IC)+PCI:小鼠以50yg HPV短肽、10yg poly(IC)和 100yg TPCS2j9 混合物免疫兩次。小鼠在兩次免疫中均進(jìn)行照射。
[0463] 6. 1:HPV 短+p(IC)+PCI.2:HPV 短+PCI:小鼠以 50yg HPV 短肽、10yg poly(IC)和 100yg TPCS2a的混合物免疫（第1次免疫），并且以50yg HPV短肽和100yg TPCS2a的混合物免 疫(第2次免疫）。小鼠在兩次免疫中均進(jìn)行照射。
[0464] 圖20顯示了兩次免疫后實(shí)驗(yàn)組的（總⑶8+細(xì)胞中的抗原特異性⑶44+細(xì)胞％+/-SEM)〇
[0465] 可以看出，在以p(IC)+PCI組合免疫的兩組(第5和6組）中引發(fā)了顯著免疫應(yīng)答，在 將該組合用于兩次免疫的第5組中實(shí)現(xiàn)了更好的效果。相比之下，在僅采用p(IC)或僅采用 PCI進(jìn)行兩次免疫的組中，未觀察到免疫應(yīng)答(與未治療組(第1組)和僅以抗原免疫的動(dòng)物 (第2組)相比）。這表明PCI和poly(IC)組合可有效引起針對病毒和癌癥相關(guān)HPV E7抗原（當(dāng) 其作為短肽遞送時(shí)）的免疫應(yīng)答，并且與單獨(dú)的P(IC)或單獨(dú)的PCI相比，以p(IC)+PCI組合 進(jìn)行兩次免疫產(chǎn)生了強(qiáng)協(xié)同效果。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種在細(xì)胞的表面上表達(dá)抗原分子或其一部分的方法，所述方法包括使所述細(xì)胞接 觸所述抗原分子、光敏化劑、和TLR配體，并用有效活化所述光敏化劑的波長的照射所述細(xì) 胞，其中，所述抗原分子被釋放到所述細(xì)胞的胞漿中，且所述抗原分子或其一部分隨后呈遞 在所述細(xì)胞的表面上。2. 如權(quán)利要求1所述的方法，其中，所述TLR配體是TLR1配體，優(yōu)選三酰脂肽。3. 如權(quán)利要求1所述的方法，其中，所述TLR配體是TLR2配體，優(yōu)選脂聚糖，優(yōu)選脂多糖， 優(yōu)選來自牙齦卟啉單胞菌。4. 如權(quán)利要求1所述的方法，其中，所述TLR配體是TLR3配體，優(yōu)選雙鏈RNA分子，優(yōu)選 Poly(I:C)〇5. 如權(quán)利要求1所述的方法，其中，所述TLR配體是TLR4配體，優(yōu)選脂多糖、例如來自埃 希氏大腸桿菌或明尼蘇達(dá)沙門氏菌的脂多糖，或單磷酰脂A(MPLA)、例如來自明尼蘇達(dá)沙門 氏菌的MPLA;優(yōu)選MPLA。6. 如權(quán)利要求1所述的方法，其中，所述TLR配體是TLR5配體，優(yōu)選鞭毛蛋白。7. 如權(quán)利要求1所述的方法，其中，所述TLR配體是TLR6配體，優(yōu)選二酰脂肽。8. 如權(quán)利要求1所述的方法，其中，所述TLR配體是TLR7配體，優(yōu)選式（1)的咪唑并喹啉 化合物或其藥學(xué)可接受的鹽，其中，R:是氨基烷基，且心可選地取代有例如羥基，并且R2是烷基，且R2可選地間插有氧 或氮基團(tuán)，其中，優(yōu)選的是 Ri 是 N-CH2-C(CH3)2-R3; R2 是-ch2-x-ch2ch3 或氫原子； R3是0H或氫原子，并且 X是0或NH。9. 如權(quán)利要求8所述的方法，其中，所述咪挫并喹啉化合物選自雷西莫特、咪喹莫特和 嘎德莫特或其藥學(xué)可接受的鹽。10. 如權(quán)利要求8所述的方法，其中，所述TLR7配體是單鏈RNA分子，優(yōu)選ssPolyU，優(yōu)選 長度為20至200個(gè)核苷酸。11. 如權(quán)利要求1所述的方法，其中，所述TLR配體是TLR8配體，優(yōu)選ssPolyU分子。12. 如權(quán)利要求1所述的方法，其中，所述TLR配體是TLR9配體，優(yōu)選CpG寡核苷酸，CpG寡 核苷酸是6個(gè)至50個(gè)堿基的單鏈寡核苷酸，其包括至少一個(gè)CpG基序和各處于所述基序的3' 和5'側(cè)的至少一個(gè)堿基。13. 如權(quán)利要求12所述的方法，其中，所述CpG寡核苷酸包含長度為8至16個(gè)堿基的回文 序列。14. 如權(quán)利要求12所述的方法，其中，所述CpG寡核苷酸具有以下序列： 5'-tcgtcgttttcggcgcgcgccg-S'或57-tccatgacgttcctgacgtt_3〇15. 如權(quán)利要求1所述的方法，其中，所述TLR配體是TLR11配體或TLR12配體，優(yōu)選抑制 蛋白。16. 如權(quán)利要求1所述的方法，其中，所述TLR配體是TLR13配體，優(yōu)選長度為5至30個(gè)核 苷酸的RNA分子，其中，優(yōu)選的是RNA分子包括序列CGGAAAGACC。17. 如權(quán)利要求1至16中任一項(xiàng)所述的方法，其中，所述抗原分子是能夠刺激免疫應(yīng)答 的分子，優(yōu)選疫苗抗原或疫苗組分。18. 如權(quán)利要求17所述的方法，其中，所述抗原呈遞引起對免疫應(yīng)答的刺激。19. 如權(quán)利要求1至18中任一項(xiàng)所述的方法，其中，所述方法在體外或離體進(jìn)行。20. 如權(quán)利要求1至19中任一項(xiàng)所述的方法，其中，所述光敏化劑選自TPCS2a、AlPcS2a、 TPPS4 和 TPBS2a、優(yōu)選 TPCS2a。21. 如權(quán)利要求1至20中任一項(xiàng)所述的方法，其中，所述抗原分子是肽，優(yōu)選黑色素瘤肽 或人乳頭瘤病毒(HPV)肽。22. 如權(quán)利要求1至21中任一項(xiàng)所述的方法，其中，所述細(xì)胞是抗原呈遞細(xì)胞，優(yōu)選樹突 細(xì)胞。23. 如權(quán)利要求1至22中任一項(xiàng)所述的方法，其中，所述細(xì)胞同時(shí)、分別或依次地接觸所 述抗原分子、光敏化劑和TLR配體。24. -種在受試者中產(chǎn)生免疫應(yīng)答的方法，所述方法包括對所述受試者施用權(quán)利要求 1、17或21所述的抗原分子、權(quán)利要求1或20所述的光敏化劑、和權(quán)利要求1至16中任一項(xiàng)所 述的TLR配體，并用有效活化所述光敏化劑的波長的照射所述受試者，其中，產(chǎn)生了免疫應(yīng) 答。25. 如權(quán)利要求24所述的方法，其中，所述方法是疫苗接種方法。26. 如權(quán)利要求24或25所述的方法，所述方法用于治療或預(yù)防疾病、病癥或感染，優(yōu)選 癌癥，優(yōu)選黑色素瘤或與乳頭瘤病毒相關(guān)的癌癥。27. 如權(quán)利要求24至26中任一項(xiàng)所述的方法，其中，所述受試者是哺乳動(dòng)物，優(yōu)選貓、 狗、馬、驢、綿羊、豬、山羊、牛、小鼠、大鼠、兔或豚鼠，最優(yōu)選的是受試者是人。28. 如權(quán)利要求24至27中任一項(xiàng)所述的方法，其中，所述抗原分子、光敏化劑和TLR配體 同時(shí)、分別或依次地施用于所述受試者。29. -種藥物組合物，其包括權(quán)利要求1、17或21所述的抗原分子、權(quán)利要求1或20所述 的光敏化劑、和權(quán)利要求1至16中任一項(xiàng)所述的TLR配體，以及一種或多種藥學(xué)可接受的稀 釋劑、載劑或賦形劑。30. -種在表面上表達(dá)抗原分子或其一部分的細(xì)胞或細(xì)胞群，所述細(xì)胞可通過權(quán)利要 求1至23中任一項(xiàng)所述的方法獲得，其中，優(yōu)選的是所述細(xì)胞是樹突細(xì)胞。31. -種藥物組合物，其包括權(quán)利要求30所述的細(xì)胞或細(xì)胞群，以及一種或多種藥學(xué)可 接受的稀釋劑、載劑或賦形劑。32. 用于預(yù)防或治療應(yīng)用的權(quán)利要求30所述的細(xì)胞或細(xì)胞群、或權(quán)利要求29或31所述 的組合物。33. 用于刺激受試者體內(nèi)免疫應(yīng)答的權(quán)利要求30所述的細(xì)胞或細(xì)胞群、或權(quán)利要求29 或31所述的組合物，優(yōu)選用于治療或預(yù)防所述受試者的疾病、病癥或感染，優(yōu)選用于疫苗接 種和/或用于治療或預(yù)防癌癥。34. 權(quán)利要求30所述的細(xì)胞群、或權(quán)利要求29或31所述的組合物在制備藥物中的應(yīng)用， 所述藥物用于刺激受試者體內(nèi)免疫應(yīng)答，優(yōu)選用于治療或預(yù)防所述受試者的疾病、病癥或 感染，優(yōu)選用于疫苗接種和/或用于治療或預(yù)防癌癥。35. 如權(quán)利要求34所述的應(yīng)用，其中，所述刺激、治療或預(yù)防包括施用所述藥物給所述 受試者。36. 用于預(yù)防或治療應(yīng)用的權(quán)利要求1、17或21所述的抗原分子、權(quán)利要求1或20所述的 光敏化劑、和權(quán)利要求1至16中任一項(xiàng)所述的TLR配體。37. 用于權(quán)利要求36所述應(yīng)用的抗原分子、光敏化劑和TLR配體，其用于刺激受試者體 內(nèi)免疫應(yīng)答，優(yōu)選用于治療或預(yù)防所述受試者的疾病、病癥或感染，優(yōu)選用于疫苗接種和/ 或用于治療或預(yù)防癌癥，其中，優(yōu)選的是所述應(yīng)用包括權(quán)利要求1至28中任一項(xiàng)所述的方 法。38. 用于權(quán)利要求36或37所述應(yīng)用的抗原分子、光敏化劑和權(quán)利要求1至16中任一項(xiàng)所 述的TLR配體，其中，所述應(yīng)用包括權(quán)利要求1至23中任一項(xiàng)所述的方法以制備細(xì)胞群，其 中，優(yōu)選的是所述細(xì)胞是樹突細(xì)胞。39. 用于權(quán)利要求38所述應(yīng)用的抗原分子、光敏化劑和試劑，其中，所述細(xì)胞群將施用 給所述受試者。40. 權(quán)利要求1、17或21所述的抗原分子、和/或權(quán)利要求1或20所述的光敏化劑、和/或 權(quán)利要求1至16中任一項(xiàng)所述的TLR配體在制備藥物中的應(yīng)用，所述藥物用于刺激受試者體 內(nèi)免疫應(yīng)答，優(yōu)選用于治療或預(yù)防所述受試者的疾病、病癥或感染，優(yōu)選用于疫苗接種和/ 或用于治療或預(yù)防癌癥，其中，優(yōu)選的是所述免疫應(yīng)答通過權(quán)利要求24至28中任一項(xiàng)所述 的方法來刺激。41. 如權(quán)利要求40所述的應(yīng)用，其中，所述藥物包括能通過權(quán)利要求1至23中任一項(xiàng)所 述的方法獲得的在所述細(xì)胞的表面上表達(dá)抗原分子或其一部分的細(xì)胞群，用于施用給所述 受試者。42. 如權(quán)利要求41所述的應(yīng)用，其中，將所述抗原分子和/或光敏化劑和/或TLR配體用 于權(quán)利要求1至23中任一項(xiàng)所述的方法中，以獲得用于制備所述藥物的所述細(xì)胞群。43. -種產(chǎn)品，其包括權(quán)利要求1、17或21所述的抗原分子、權(quán)利要求1或20所述的光敏 化劑、和權(quán)利要求1至16中任一項(xiàng)所述的TLR配體作為組合制劑，以同時(shí)、分別或依次使用來 刺激受試者體內(nèi)免疫應(yīng)答，優(yōu)選用于治療或預(yù)防所述受試者的疾病、病癥或感染，優(yōu)選用于 疫苗接種和/或用于治療或預(yù)防癌癥，或用于根據(jù)權(quán)利要求1至28中任一項(xiàng)所述的方法在細(xì) 胞的表面上表達(dá)抗原分子或其一部分。44. 一種試劑盒，其用于刺激受試者體內(nèi)免疫應(yīng)答，優(yōu)選用于治療或預(yù)防所述受試者的 疾病、病癥或感染，優(yōu)選用于疫苗接種和/或用于治療或預(yù)防癌癥，或用于根據(jù)權(quán)利要求1至 28中任一項(xiàng)所述的方法在細(xì)胞的表面上表達(dá)抗原分子或其一部分，所述試劑盒包括： 第一容器，其包含權(quán)利要求1或20所述的光敏化劑； 第二容器，其包含權(quán)利要求1、17或21所述的所述抗原分子;和 第三容器，其包含權(quán)利要求1至16中任一項(xiàng)所述的TLR配體。45. -種用于在受試者體內(nèi)產(chǎn)生免疫應(yīng)答、優(yōu)選治療或預(yù)防所述受試者的疾病、病癥或 感染、優(yōu)選用于疫苗接種和/或用于治療或預(yù)防癌癥的方法，所述方法包括根據(jù)權(quán)利要求1 至23中任一項(xiàng)所述的方法制備細(xì)胞群，并隨后將所述細(xì)胞施用給所述受試者。
【文檔編號(hào)】C12N5/0784GK105873585SQ201480057929
【公開日】2016年8月17日
【申請日】2014年8月28日
【發(fā)明人】A·霍格賽特, P·約翰森
【申請人】Pci生物技術(shù)公司