一種煙草疫霉接種煙草的方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種煙草疫霉接種煙草的方法，包括以下步驟：（1）煙草子葉苗的準備；（2）煙草疫霉游動孢子懸浮液的制備；（3）灌根接種；（4）統(tǒng)計發(fā)病情況，評價抗病結果。本發(fā)明的游動孢子接種子葉苗根部可以嚴格定量，避免了接種量過大而導致同一的品種抗感的表現(xiàn)差異，在抗性鑒定時更準確、有效；在實際操作中，可大批量進行，具有占用空間小、節(jié)約勞動成本、縮短實驗周期的優(yōu)點。因此，本發(fā)明方法適合推廣應用。
【專利說明】-種煙草疫霉接種煙草的方法

【技術領域】
[0001] 本發(fā)明屬于植物抗病鑒定【技術領域】，具體涉及一種煙草疫霉接種煙草的方法。

【背景技術】
[0002] 煙草黑腔病是由煙草疫霉(化乃(9如曲?ra nico化wae)引起的一種±傳病害，是 影響煙草產量和品質的主要病害之一。防治該病害最安全有效的措施是利用抗病品種?？?病品種需要通過抗性鑒定驗證。在品種抗性鑒定中，大田鑒定經常涉及的品種較少，適宜于 規(guī)?？剐澡b定的主要W苗期鑒定為主，應用較多的是GB/T 23224描述的菌谷法接種、菌絲 塊創(chuàng)傷法接種（中國發(fā)明專利化200610048658 ;黃成江等，抗黑腔病烤煙品種資源篩選的 研究初報，云南農業(yè)大學學報，2008, 23(4) : 565-570)。菌谷、菌絲塊創(chuàng)傷法接種需要將待測 定的煙草品種播種培育至成苗、再移栽，時間長達7(T80天，每品種至少10株，在盆栽條件 下占用空間較大。因此，開發(fā)一種能縮短時間、節(jié)省空間的接種方法是非常必要的。


【發(fā)明內容】

[0003] 本發(fā)明的目的在于提供一種煙草疫霉接種煙草的方法。
[0004] 本發(fā)明的目的是該樣實現(xiàn)的，包括煙草子葉苗的準備、煙草疫霉游動抱子息浮液 的制備、灌根接種、統(tǒng)計評價步驟，具體包括： A、 煙草子葉苗的準備；將煙草種子表面消毒后播種于發(fā)芽床上，于相對濕度8(T85%、 光照強度1000?20(K)Lx、溫度25?28°C下培養(yǎng)廣10天后發(fā)芽形成子葉苗備用； B、 煙草疫霉游動抱子息浮液的制備；將煙草疫霉接種至0A培養(yǎng)基平板，于25^28C下 黑暗培養(yǎng)廣10天至菌絲長滿整個平板，取菌絲切成小塊得到菌絲塊，液體培養(yǎng)誘導產生游 動抱子囊、低溫促進游動抱子囊釋放游動抱子用無菌水調節(jié)游動抱子濃度為1〇 4^6個/ml得 到煙草疫霉游動抱子息浮液； C、 灌根接種；取B步驟獲得的煙草疫霉游動抱子息浮液緩慢滴加至發(fā)芽床，讓其滲透 到每株子葉苗的根部； D、 統(tǒng)計發(fā)病情況，評價抗病結果；接種后的子葉苗在相對濕度8(T85%、光照強度 1000?20(K)Lx、溫度25?28°C下繼續(xù)培養(yǎng)3?5天，調查子葉苗的發(fā)病率，按發(fā)病率劃分抗感 性，免疫或高抗發(fā)病率為0,抗病發(fā)病率為0.廣25%，中抗發(fā)病率為25.廣45%，中感發(fā)病率為 45.廣65%，感病發(fā)病率為65.廣80%，高感發(fā)病率為80. 1?100%，其中免疫或高抗、抗病、中抗 的材料即可作為抗源。
[0005] 疫霉疫霉本發(fā)明的游動抱子接種子葉苗根部可W嚴格定量，避免了接種量過大而 導致同一的品種抗感的表現(xiàn)差異，游動抱子既可從根部侵入也可從下胚軸侵入，與田間自 然侵入方式相同，在篩選抗源時更準確、有效；在實際操作中，可大批量進行，在人工氣候箱 /室進行，具有占用空間小、節(jié)約勞動成本、縮短實驗周期等優(yōu)點。
[0006]

【專利附圖】

【附圖說明】： 圖1為本發(fā)明方法流程示意圖。

【具體實施方式】
[0007] 下面結合實施例和附圖對本發(fā)明作進一步的說明，但不W任何方式對本發(fā)明加W 限制，基于本發(fā)明教導所作的任何變換或替換，均屬于本發(fā)明的保護范圍。
[0008] 本發(fā)明所述的煙草疫霉接種煙草的方法，包括煙草子葉苗的準備、煙草疫霉游動 抱子息浮液的制備、灌根接種、統(tǒng)計評價步驟，具體包括： A、 煙草子葉苗的準備；將煙草種子表面消毒后播種于發(fā)芽床上，于相對濕度8(T85%、 光照強度1000?20(K)Lx、溫度25?28°C下培養(yǎng)廣10天后發(fā)芽形成子葉苗備用； B、 煙草疫霉游動抱子息浮液的制備；將煙草疫霉接種至0A培養(yǎng)基平板，于25^28C下 黑暗培養(yǎng)廣10天至菌絲長滿整個平板，取菌絲切成小塊得到菌絲塊，液體培養(yǎng)誘導產生游 動抱子囊、低溫促進游動抱子囊釋放游動抱子用無菌水調節(jié)游動抱子濃度為1〇 4^6個/ml得 到煙草疫霉游動抱子息浮液； C、 灌根接種；取B步驟獲得的煙草疫霉游動抱子息浮液緩慢滴加至發(fā)芽床，讓其滲透 到每株子葉苗的根部； D、 統(tǒng)計發(fā)病情況，評價抗病結果；接種后的子葉苗在相對濕度8(T85%、光照強度 1000?20(K)Lx、溫度25?28°C下繼續(xù)培養(yǎng)3?5天，調查子葉苗的發(fā)病率，按發(fā)病率劃分抗感 性，免疫或高抗發(fā)病率為0,抗病發(fā)病率為0.廣25%，中抗發(fā)病率為25.廣45%，中感發(fā)病率為 45.廣65%，感病發(fā)病率為65.廣80%，高感發(fā)病率為80. 1?100%，其中免疫或高抗、抗病、中抗 的材料即可作為抗源。
[0009] A步驟中所述的表面消毒是5(T55°C溫湯浸種擴10分鐘，或1%硫酸銅或0. 1%硝 酸銀溶液浸種1(T15分鐘。
[0010] 所述的發(fā)芽床是由海綿和濾紙做成。
[0011] B步驟中所述的0A培養(yǎng)基配方為：燕麥片30克、自來水1000毫升。
[0012] B步驟中所述的10%V8汁液體培養(yǎng)基配方為；用自來水稀釋V8汁至10%(w/w)、再 加0. 1%的碳酸巧（w/w)。
[0013] B步驟中所述的菌絲塊的大小為2mmX 2mm。
[0014] B步驟中所述的液體培養(yǎng)誘導產生游動抱子囊是將菌絲塊加入到10%V8汁液體培 養(yǎng)基的培養(yǎng)皿中，每皿加菌絲塊2(T40片，繼續(xù)于25^28°C下黑暗培養(yǎng)：T4天，傾去培養(yǎng)液， 用滅菌水沖洗：T5次，每天換加滅菌水廣3次，連續(xù)2^3天誘導游動抱子囊的產生，直至每 平方厘米菌絲塊游動抱子囊在10000個W上時停止誘導。
[0015] B步驟中所述的低溫促進游動抱子囊釋放游動抱子是將產生游動抱子的菌絲塊 5?8C低溫處理20?30min，取出置于室溫15?30min誘導游動抱子囊釋放游動抱子。
[0016] C步驟中所述的煙草疫霉游動抱子息浮液滴加量為1(T15毫升。
[0017] 疫霉疫霉實施例1 ;游動抱子接種子葉苗的實驗步驟及接種量 本實施例用煙草疫霉0號生理小種（中華人民共和國煙草行業(yè)標準YC/T39-1996)為實 驗菌株，用抗病品種RBST和感病品種紅花大金元作為實驗煙草品種。
[0018] 具體操作如下： (1)煙草子葉苗的準備；抗病品種RBST和感病品種紅花大金元煙草種子表面消毒 后，10X 10方陣點播于海綿和濾紙做成的培養(yǎng)皿發(fā)芽床上，在相對濕度8(T85%、光照強度 1000?20(K)Lx、溫度25?28°C的人工氣候箱內培養(yǎng)廣10天后發(fā)芽形成子葉苗，備用； (2) 煙草疫霉游動抱子息浮液的制備；將煙草疫霉接種在OA培養(yǎng)基平板，25^28C恒溫 黑暗培養(yǎng)廣10天，袋菌絲長滿整個平板后，將菌絲切成2mmX 2mm的小塊，加入到10%V8汁 培養(yǎng)皿淺盤的液體培養(yǎng)基中，每皿加菌絲塊2(T40片，繼續(xù)培養(yǎng)：T4天，傾去培養(yǎng)液，滅菌水 沖洗：T5次后，每天換加滅菌水廣3次，連續(xù)2^3天誘導游動抱子囊的產生，當每平方厘米 菌絲塊游動抱子囊在10000個W上時，5^8°C低溫處理2(T30分鐘，取出置于室溫15^30分 鐘誘導游動抱子囊釋放游動抱子，用無菌水調節(jié)游動抱子濃度為1〇 4個/mL、1〇5個/mL、1〇6 個/111以共3個濃度梯度煙草疫霉游動抱子息浮液； (3) 灌根接種：將1(T15 mL步驟（2)獲得的游動抱子液用移液槍從發(fā)芽床濾紙的四周 緩慢滴加，盡可能讓游動抱子息浮液滲到每株子葉苗的根部，每濃度接種1皿為1個處理， 重復3次； (4) 接種效果判定：接種后的子葉苗在步驟（1)的條件下繼續(xù)培養(yǎng)：T5天，調查子葉苗 的發(fā)病率。
[0019] 為驗證重復性，共進行了 4個批次的實驗。
[0020] 實驗結果表明，感病品種紅花大金元3天后水浸狀發(fā)病癥狀明顯，3個濃度梯度發(fā) 病率在85. 1?93. 6%之間，而抗病品種RBST在5天后3個濃度梯度發(fā)病率在1. 5?4. 8%之間， 4批次在2抗感品種上發(fā)病率穩(wěn)定在各自的范圍內，說明方法重復性符合實驗要求。3個濃 度可W作為合適的接種量使用，1〇5個/mL是最適宜的接種量。
[0021] 實施例2 ;游動抱子接種子葉苗篩選抗源 本實施例用15個材料，采用0號生理小種，具體步驟如下： (1) 煙草子葉苗的準備；煙草種子表面消毒后，10X10方陣點播于海綿和濾紙做成的 培養(yǎng)皿發(fā)芽床上，在相對濕度8(T85%、光照強度2000LX、溫度28C的人工氣候箱/室內培養(yǎng) 10天后發(fā)芽形成子葉苗，備用； (2) 煙草疫霉游動抱子息浮液的制備；將煙草疫霉接種在0A培養(yǎng)基平板，28C恒溫黑 暗培養(yǎng)10天，待菌絲長滿整個平板后，將菌絲切成2mmX2mm的小塊，加入到10%V8汁培養(yǎng) 皿淺盤的液體培養(yǎng)基中，每皿加菌絲塊40片，繼續(xù)培養(yǎng)3天，傾去培養(yǎng)液，滅菌水沖洗：T5 次后，每天換加滅菌水廣3次，連續(xù)2^3天誘導游動抱子囊的產生，當每平方厘米菌絲塊游 動抱子囊在10000個W上時，5^8°C低溫處理2(T30分鐘，取出置于室溫15^30分鐘誘導游 動抱子囊釋放游動抱子，用無菌水調節(jié)游動抱子濃度為1〇5個/mU即得煙草疫霉游動抱子 息浮液； (3) 灌根接種：將1(T15 mL步驟（2)獲得的游動抱子液用移液槍從發(fā)芽床濾紙的四周 緩慢滴加，盡可能讓游動抱子息浮液滲到每株子葉苗的根部，每品種接種1皿為1個處理， 重復3次； (4) 抗性鑒定結果的判定：接種后的子葉苗在步驟（1)的條件下繼續(xù)培養(yǎng)3-5天， 調查子葉苗的發(fā)病率，取第3、4、5天調查的平均值為該品種發(fā)病率，每重復分別統(tǒng)計， 按發(fā)病率劃分抗感性，免疫或高抗的發(fā)病率為0,抗病的發(fā)病率為0.廣25%，中抗的發(fā)病 率為25. 1?45%，中感的發(fā)病率為45.廣65%，感病的發(fā)病率為65.廣80%，高感的發(fā)病率為 80.廣100%，其中免疫或高抗、抗病、中抗的材料即可作為抗源。
[0022] 實驗結果見表1，實驗結果表明，15個材料中免疫的有2個，抗病的有4個，中抗的 有1個，中感的有4個，感病的有1個，高感的有3個。該些結果與菌谷和菌絲塊接種抗性 鑒定結果完全吻合。
[0023] 表1游動抱子接種子葉苗篩選抗源結果

【權利要求】
1. 一種煙草疫霉接種煙草的方法，其特征在于包括煙草子葉苗的準備、疫霉游動孢子 懸浮液的制備、灌根接種、統(tǒng)計評價步驟，具體包括： A、 煙草子葉苗的準備：將煙草種子表面消毒后播種于發(fā)芽床上，于相對濕度8(T85%、 光照強度100(T2000LX、溫度25?28°C下培養(yǎng)疒10天后發(fā)芽形成子葉苗備用； B、 煙草疫霉游動孢子懸浮液的制備：將煙草疫霉接種至0A培養(yǎng)基平板，于25~28°C下 黑暗培養(yǎng)疒10天至菌絲長滿整個平板，取菌絲切成小塊得到菌絲塊，液體培養(yǎng)誘導產生游 動孢子囊、低溫促進游動孢子囊釋放游動孢子用無菌水調節(jié)游動孢子濃度為1〇4~6個/ml， 得到煙草疫霉游動孢子懸浮液； C、 灌根接種；取B步驟獲得的煙草疫霉游動孢子懸浮液緩慢滴加至發(fā)芽床，讓其滲透 到每株子葉苗的根部； D、 統(tǒng)計發(fā)病情況，評價抗病結果：接種后的子葉苗在相對濕度8(T85%、光照強度 100(T2000LX、溫度25~28°C下繼續(xù)培養(yǎng):T5天，調查子葉苗的發(fā)病率，按發(fā)病率劃分抗感 性，免疫或高抗發(fā)病率為〇,抗病發(fā)病率為〇. 1~25%，中抗發(fā)病率為25. 1~45%，中感發(fā)病率為 45. 1飛5%，感病發(fā)病率為65. 1~80%，高感發(fā)病率為80. 1~100%，其中免疫或高抗、抗病、中抗 的材料即可作為抗源。
2. 根據權利要求1所述的煙草疫霉接種煙草的方法，其特征在于A步驟中所述的表面 消毒是5(T55°C溫湯浸種8~10分鐘，或1%硫酸銅或0. 1%硝酸銀溶液浸種1(T15分鐘。
3. 根據權利要求1所述的煙草疫霉接種煙草的方法，其特征在于所述的發(fā)芽床是由海 綿和濾紙做成。
4. 根據權利要求1所述的煙草疫霉接種煙草的方法，其特征在于B步驟中所述的OA培 養(yǎng)基配方為：燕麥片30克、自來水1000毫升。
5. 根據權利要求1所述的煙草疫霉接種煙草的方法，其特征在于B步驟中所述的 10%V8汁液體培養(yǎng)基配方為：用自來水稀釋V8汁至10%、再加0. 1%的碳酸鈣。
6. 根據權利要求1所述的煙草疫霉接種煙草的方法，其特征在于B步驟中所述的菌絲 塊的大小為2mmX2mm。
7. 根據權利要求1所述的煙草疫霉接種煙草的方法，其特征在于B步驟中所述的液體 培養(yǎng)誘導產生游動孢子囊是將菌絲塊加入到10%V8汁液體培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿中，每皿加菌絲 塊2(T40片，繼續(xù)于25?28°C下黑暗培養(yǎng):T4天，傾去培養(yǎng)液，用滅菌水沖洗:T5次，每天換 加滅菌水1~3次，連續(xù)2~3天誘導游動孢子囊的產生，直至每平方厘米菌絲塊游動孢子囊在 10000個以上時停止誘導。
8. 根據權利要求1所述的煙草疫霉接種煙草的方法，其特征在于B步驟中所述的低溫 促進游動孢子囊釋放游動孢子是將產生游動孢子的菌絲塊5~8°C低溫處理2(T30min，取出 置于室溫15~30min誘導游動孢子囊釋放游動孢子。
9. 根據權利要求1所述的煙草疫霉接種煙草的方法，其特征在于C步驟中所述的煙草 疫霉游動孢子懸浮液滴加量為1(T15毫升。
【文檔編號】A01G7/06GK104396599SQ201410726158
【公開日】2015年3月11日 申請日期:2014年12月4日 優(yōu)先權日:2014年12月4日
【發(fā)明者】方敦煌, 陳學軍, 肖炳光, 童治軍, 楊大海, 吳興富 申請人:云南省煙草農業(yè)科學研究院