金精三羧酸合成的復(fù)合物低分子量組分對補(bǔ)體的膜攻擊復(fù)合物和c3轉(zhuǎn)化酶的選擇性抑制作用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]金精三羧酸復(fù)合物的合成
[0002]金精三羧酸復(fù)合物的合成是根據(jù)公布的標(biāo)準(zhǔn)程序進(jìn)行(Cushman和kanamathareddy,1990)。
[0003]1.合成3，3’ - 二氯-5，5’ - 二羧基_4，4’ - 二羥基二苯基甲烷:
[0004]3-氯水楊酸(I克)溶解在甲醇(10毫升)中。加入水(2.5毫升)，在冰鹽(NaCl)浴中燒瓶冷卻至_5°C。歷經(jīng)20分鐘慢慢加入濃硫酸(30毫升)，溫度保持在_5°C。反應(yīng)混合物然后在此溫度下攪拌I小時，同時加入37%甲醛溶液(4毫升)。溫度保持在0°C I小時，然后混合物在室溫放置24小時。反應(yīng)混合物倒入碎冰(150克)，和過濾沉淀，干燥，得到產(chǎn)物，3，3’ -二氯-5，5’ - 二羧基-4，4’ -二羥基二苯基甲烷(產(chǎn)量0.92g，92% )，作為粉末。樣品經(jīng)甲醇重結(jié)晶。
[0005]2.合成3，3’ - 二羧基-4，4’ - 二羥基二苯基甲烷:
[0006]3，3’ - 二氯-5，5’ - 二羧基-4，4’ - 二羥基二苯基甲烷(0.92克)溶解在乙醇(18毫升)和三乙胺(10毫升)中。鈀碳被添加到該溶液中，在氫氣氣氛下攪拌混合物48小時。濾去催化劑，蒸發(fā)溶劑，和水(100毫升)加入到殘留物中。將溶液冷卻，和加入濃鹽酸(5毫升)。將白色沉淀物過濾和干燥，得到產(chǎn)物，3，3’ - 二羧基_4，4’ - 二羥基二苯基甲烷(0.75克，90%)，作為固體。將它從甲醇溶解和再結(jié)晶。在劇烈攪拌下粉末狀的亞硝酸鈉(4克)加入濃硫酸(4毫升)?；衔?，3’- 二羧基-4，4’- 二羥基二苯基甲烷(0.75克)和水楊酸(0.38克)的混合物被攪拌，直到達(dá)到均勻。然后將其倒入硫酸鈉硝酸溶液。在室溫繼續(xù)攪拌額外的18小時?；旌衔锏谷胨楸?100克)，同時攪拌。將暗橙色沉淀過濾和干燥，得到粗產(chǎn)物(0.6克，收率60%)。粉末溶于2%氫氧化銨，用于分析。
[0007]3.3，3’，3’ -三羧基-4，4’，4’ -三羥基三苯基甲醇復(fù)合物(金精三羧酸復(fù)合物):
[0008]在劇烈攪拌下粉末狀的亞硝酸鈉(4克)加入濃硫酸(4毫升)。化合物3，3’- 二羧基-4，4’ - 二羥基二苯基甲烷(0.75克)和水楊酸(0.38克)的混合物被攪拌，直到均勻。然后將其倒入硝酸鈉硫酸溶液。在室溫繼續(xù)攪拌額外的18小時?；旌衔锏谷胨楸?100克)，同時攪拌。將暗橙色沉淀過濾和干燥，得到粗產(chǎn)物(0.6克，收率60%)。粉末溶于2%氫氧化銨，用于分析。
[0009]ATAC的分離和分析
[0010]從合成，或從西格瑪奧德里奇(Sigma-Aldrich)商業(yè)購買的金精三羧酸,或來自GFS化學(xué)品公司(GFS Chemicals Inc.)(哥倫布，0H)的招試劑(Aluminon)得到的粉末被分為高、低分子量組分。在一個典型的實驗中，五克物質(zhì)溶解在0.2%氫氧化銨(45毫升)和在空氣壓力下(70-75磅，5.3千克/平方厘米，持續(xù)6小時)強(qiáng)制通過IkDa過濾器(plac04310,微孔,Ballerica,MA)。通過冷凍干燥使過濾的物質(zhì)重結(jié)晶。濾液(I毫升4.5毫克)然后裝上尺寸排阻色譜柱(S^hadex LH-20填料在60%乙醇中，GE醫(yī)療，皮斯卡塔韋，新澤西(GE healthcare, Piscataway, NJ))。收集三種不同的洗脫液懼分。在Waters ZQ裝置上通過質(zhì)譜分析三種餾分，以及起始混合物，所述Waters ZQ裝置配有ESCI離子源和Waters Alliance四極探測器。所有樣品均暴露于正、負(fù)模式電噴霧電離，以及大氣壓化學(xué)電離。掃描范圍為m/z 0-1100和m/z 500-1500。三種分子被檢測為422，572，858MW。這些分子量分別對應(yīng)于ATA，AQA,和AM’如圖3所示。沒有檢測到其他小于1.5kDa的衍生物。分離和通過質(zhì)量光譜學(xué)分析成分。來自三個來源的結(jié)果幾乎是相同的。低分子量成分只占了總的12-16%。它們都含有分子量422，572，和858的三種分子。
[0011]低分子量產(chǎn)物作為膜攻擊復(fù)合物和C3轉(zhuǎn)化酶的選擇性抑制劑的評價
[0012]為了評價金精三羧酸復(fù)合物(即ATA加AQA加AHA)的低分子量的產(chǎn)物阻斷經(jīng)典補(bǔ)體途徑的強(qiáng)度，應(yīng)用標(biāo)準(zhǔn)的CH50測定。通過采用兔抗綿羊紅細(xì)胞抗體孵育過夜致敏綿羊紅細(xì)胞。然后含有和不含不同量的低分子量金精三羧酸餾分(ATAC)的稀釋的血清與致敏的紅細(xì)胞在37°C孵育I小時。孵育物以5000rpm離心lOmin。從被補(bǔ)體攻擊破壞的紅細(xì)胞釋放到血清中的血紅蛋白，是通過讀取在405nm處的光密度(OD)而測定的。作為陽性對照，用水100%溶解紅細(xì)胞，作為陰性對照，無血清加入到孵育物。
[0013]結(jié)果如圖3所示。這些成分中的每一個幾乎以相同程度抑制人類補(bǔ)體介導(dǎo)的紅細(xì)胞溶血。ATA 的 IC50值為 544nM, AQA 的 IC 50值為 576nM，AHA 的 IC 50值為 559nM 和 ATAC 的IC5tl值為580nM。大鼠血清ATAC的IC 5(|為268nM。這些數(shù)據(jù)證明了低分子量金精三羧酸衍生物抑制補(bǔ)體激活是在納摩爾范圍，包括嚙齒類動物以及人類的血清。
[0014]為了確定在補(bǔ)體級聯(lián)的哪個階段發(fā)生阻斷，變化CH50測定。不測量溶血，而是運行蛋白質(zhì)印跡分析，以確定哪個血清補(bǔ)體蛋白被消耗并轉(zhuǎn)化為在敏感膜上的活化的補(bǔ)體產(chǎn)物。補(bǔ)體蛋白質(zhì)僅僅在阻斷階段被消耗和轉(zhuǎn)換。在阻斷之外的階段，它們在血清中保持不變，但它們的活化的產(chǎn)物出現(xiàn)在細(xì)胞膜。結(jié)果如圖4所示。人血清稀釋16倍。然后用ATA，AQA，AHA或ATAC將其處理30分鐘。然后加入相同體積的抗體綴合的綿羊紅細(xì)胞。將所得混合物在37°C孵育I小時。然后用裂解緩沖液處理它們，之后用加載緩沖液處理它們，以用于蛋白質(zhì)印跡。來自每個樣品的等量的蛋白質(zhì)加載到凝膠上，和用10%的SDS分離。SDS后，將蛋白轉(zhuǎn)移到PVDF膜。然后對膜采用以下進(jìn)行處理:采用不同的一抗，之后采用標(biāo)記的二體，使用成熟的技術(shù)(李(Lee)等人，2011)。利用的抗體的列表，如表I所示。通過使用增強(qiáng)的化學(xué)發(fā)光系統(tǒng)和曝光照相膠片而可視化由抗體識別的譜帶。對于采用不同的抗體探測相同的膜，采用剝離液處理膜(李等人，2011)，然后與之前一樣采用不同的一抗處理。
[0015]典型的結(jié)果如圖4a所示。左泳道僅加載血清，和顯示，Clq，C3，C4和C5譜帶很容易檢測到。相鄰泳道說明加入致敏的紅細(xì)胞的影響，所述致敏的紅細(xì)胞然后被補(bǔ)體攻擊溶血。天然的血清蛋白被消耗，并且被并入紅細(xì)胞膜。Clq不被代謝，但由于其從Cl復(fù)合物的解離，譜帶加強(qiáng)。不再檢測到天然的C3，因為它已裂解，和C3b片段已共價連接到膜。檢測到降解產(chǎn)物C3d。C4不再被檢測到，因為它同樣被裂解，和C4b片段附著于細(xì)胞膜，和代謝為降解產(chǎn)物C4d。該片段也被檢測到。C5被裂解，檢測到C5a產(chǎn)物的譜帶。最后，檢測到C5b-9膜攻擊復(fù)合物，其形成在紅細(xì)胞膜上，引起它的溶血。
[0016]接下來膜顯示，在ATAC的存在下血清加致敏的紅細(xì)胞的孵化影響。對于調(diào)理步驟的相同的譜帶進(jìn)行檢測，但紅細(xì)胞不溶血，和未檢測到膜攻擊復(fù)合物。
[0017]為了確定膜攻擊復(fù)合物的組裝被阻斷的階段，進(jìn)行額外的分析。除了在被處理以用于蛋白質(zhì)印跡分析前紅細(xì)胞從殘留血清中分離和洗滌，孵育與之前一樣。采用C6，C7，C8和C9的抗體對印跡進(jìn)行探測。結(jié)果是顯示在圖中，圖4b針對ATAC，圖4c針對ATA，圖4d針對AQA和圖4e針對AHA。每個成分結(jié)果是相同的。單獨的人血清泳道I顯示，C6，C7，C8和C9在未經(jīng)處理的血清中容易檢測到。泳道2表明，在被補(bǔ)體攻擊溶血的無保護(hù)紅細(xì)胞中，這些抗體僅僅檢測C5b-9，完全形成的膜攻擊復(fù)合物。泳道3，其中的細(xì)胞是受ATAC保護(hù)，表明膜攻擊復(fù)合物不完全形成而在C8階段被停止。C6抗體檢測C5b6，C5b67，和C5b678。C7抗體檢測C5b67，和C5b678，而C8抗體檢測到C5b678。這些數(shù)據(jù)表明，在C9附著C5b678的階段ATAC停止形成膜攻擊復(fù)合物。由于C9(n)被需要用于創(chuàng)建膜破壞孔，這一阻斷是高度特異于防止C9附著。
[0018]為了確定ATAC對旁路途徑的影響，進(jìn)行了實驗，其中采用Cl抑制劑(1.8微克/ml)或采用C4b抗體(11000倍稀釋)阻斷經(jīng)典途徑。在這些實驗中，人血清(15倍稀釋)與Cl抑制劑和ATA(5微米，泳道3)，或ATA與備解素(lmicrogm/ml,泳道4)或因子D (0.lmicrogm/ml,泳道5)孵育Ih,之后加入調(diào)理的酵母聚糖(lmicrogm/ml)?；旌衔镌?7°C孵育I小時，以5000rpm離心lOmin。采用漢克平衡鹽溶液(HBSS)洗兩次顆粒，將其采用樣品加載緩沖液處理以用于SDS-PAGE和免疫印跡法。50mM Tris-HCl (pH 6.8)，
0.1% SDS，0.1%溴酚藍(lán)和10%甘油構(gòu)成緩沖液。為了保存形成的分子復(fù)合物，之后采用SD