專利名稱：利用△6-去飽和酶生產(chǎn)γ亞麻酸的制作方法
亞油酸(18∶2)(LA)經(jīng)△6-去飽和酶的作用轉(zhuǎn)變成γ亞麻酸(18∶3)(GLA)。當△6-去飽和酶或者是編碼這種酶的核酸被轉(zhuǎn)入到產(chǎn)LA的細胞中后即可產(chǎn)生GLA。本發(fā)明提供了含有△6-去飽和酶基因的核酸。更具體地說，本發(fā)明的核酸包括△6-去飽和酶基因的啟動子、編碼區(qū)和終止區(qū)。本發(fā)明進一步還涉及含有與異源調(diào)節(jié)順序進行功能性結(jié)合的△6-去飽和酶編碼區(qū)的重組構建體。本發(fā)明的核酸和重組體構建體可用在轉(zhuǎn)基因生物體中生產(chǎn)GLA。
不飽和脂肪酸，如亞油酸(C18△9，12)和α-亞麻酸(C18△9，12，15)是每日食物攝入的必需成分，它不能被脊椎動物自身合成，因為脊椎動物細胞只能在脂肪酸的△9位置引入雙鍵，但不能在△9雙鍵和脂肪酸鏈的甲基末端之間引入另外雙鍵。亞油酸和α-亞麻酸是其它產(chǎn)物的前體，所以它們是必需脂肪酸，并且通常是從植物中獲取。亞油酸可以由哺乳動物轉(zhuǎn)變?yōu)棣?亞麻酸(GLA，C18△6，9，12)，再轉(zhuǎn)變?yōu)榛ㄉ南┧?20∶4)?；ㄉ南┧崾且环N相當重要的脂肪酸，因為它是大多數(shù)前列腺素必不可少的前體。
通過轉(zhuǎn)變?yōu)镚LA和花生四烯酸，亞油酸食品中滿足了食物中的GLA和花生四烯酸的需要。然而，已經(jīng)證明了飽和脂肪酸的消耗和疾病的發(fā)生如高膽固醇血癥、粥樣硬化以及與冠脈疾病易感性相關的化學物質(zhì)紊亂之間的關系。而消耗不飽和脂肪與血膽固醇的降低有關，患粥樣硬化的危險性就減小。GLA飲食的治療性優(yōu)點來自于GLA可作為花生四烯酸的前體，繼而有助于前列腺素的合成。因此，更多的不飽和的GLA而不是亞油酸將益于健康，但是，在任何商業(yè)性生產(chǎn)的谷類植物中實際上都不存在GLA。
亞油酸在△6-去飽和酶的作用下轉(zhuǎn)變?yōu)镚LA?！?-去飽和酶具有約359個氨基酸，有一個膜結(jié)合區(qū)和一個脂肪酸去飽和作用的活化位點。當△6-去飽和酶轉(zhuǎn)入一個本身只產(chǎn)生亞油酸而不產(chǎn)生GLA的細胞中時，該細胞就可以產(chǎn)生GLA。本發(fā)明通過提供△6-去飽和酶的基因編碼，產(chǎn)生含有功能性△6-去飽和酶并產(chǎn)生GLA的轉(zhuǎn)基因生物體。除了產(chǎn)生大量的GLA外，本發(fā)明還提供了新的GLA飲食來源。
本發(fā)明涉及一種被分離的△6-去飽和酶基因，具體地說，這種被分離的基因含有△6-去飽和酶啟動子、編碼區(qū)和終止密碼區(qū)。
本發(fā)明還涉及含有△6-去飽和酶啟動子、編碼區(qū)、終止密碼區(qū)的表達載體。
本發(fā)明還涉及包括△6-去飽和酶編碼區(qū)與外源調(diào)節(jié)區(qū)即非源于△6-去飽和酶基因的單元進行功能性結(jié)合的表達載體。
本發(fā)明還提供含有本發(fā)明載體的細胞和生物體以及這類生物體的子代。
本發(fā)明還提供了被分離的細菌性△6-去飽和酶，進一步還涉及被分離的編碼細菌性△6-去飽和酶的核酸。
本發(fā)明提供了產(chǎn)生增高γ-亞麻酸(GLA)含量的植物的方法，通過用本發(fā)明的分離的核酸轉(zhuǎn)化植物細胞，以及用上述高GLA含量的植物細胞再生植物。
本發(fā)明提供了一種產(chǎn)生耐寒植物的方法。


圖1描繪了集胞藻屬菌(synechocystis)△6-去飽和酶(圖1A)和△12-去飽和酶(圖1B)的推測氨基酸順序的水療法圖。用實線表示推測的膜距區(qū)(membranespanningregions)。用19個氨基酸殘基的窗格大小計算疏水指數(shù)(kyte，etal，1982，J.Molec.Biol.157)。
圖2表示野生型魚腥藻屬細菌(圖2A)和轉(zhuǎn)基因魚腥藻屬細菌(圖2B)的氣液色譜圖。
圖3是帶有重疊區(qū)和亞克隆的粘性質(zhì)粒cSy75、cSy13和cSy7的簡圖。cSy75、cSy75-3.5和cSy7的亞克隆的起始點用帶斜條的框線表示。還末被活化的限制性位點寫在括號內(nèi)。
圖4表示野生型(圖A)和轉(zhuǎn)移基因型煙草(圖B)的氣液色譜圖。
本發(fā)明提供了一種分離的編碼△6-去飽和酶的核酸，為了鑒定編碼△6-去飽和酶的核酸，從能產(chǎn)生GLA的生物體中分離DNA。例如，所說的生物體可以是動物細胞、某些真菌(如被孢霉屬)，某些細菌(例如集胞藻屬)或某些植物(琉璃苣、月見草屬、茶藨子屬植物)?；駾NA的分離可以用本領域普通技術人員已知的各種方法進行，例如用Sambrook等人舉證的方法(MolecularCloningALaboratoryManual，ColdSpringHarbor，NY.1989)。用物理方法或酶消化作用將分離的DNA裂解，然后再通過參考文獻中的(例如Sambrooketal，1989)各種已知方法把裂解片段克隆到合適的載體中，如噬菌體或粘性質(zhì)粒載體。本文特別設計了含有本發(fā)明DNA的表達載體。通過獲得的功能性分析結(jié)果鑒定編碼△6-去飽和酶的DNA。含有裂解的DNA片段的載體通過感染、轉(zhuǎn)結(jié)合和轉(zhuǎn)染等方式轉(zhuǎn)移到產(chǎn)亞油酸但不產(chǎn)GLA的宿主生物體中。本文所說的“轉(zhuǎn)化”通常指的是將外源DNA摻入到宿主細胞中，將重組DNA導入宿主生物體中的方法是本領域普通技術人員已知的。例如可以參考的文獻有Sambrooketal.，1989。這些有機體的GLA的生產(chǎn)(如功能的獲得)諸如氣液色譜圖或其它普通技術人員所熟悉的方法鑒定。
經(jīng)誘導產(chǎn)生GLA的生物體，亦即通過載體的導入而獲得上述功能的生物體被證明為表達了編碼△6-去飽和酶的DNA，再從生物體中回收所說的DNA。回收的DNA可再次裂解，用表達載體進行克隆，并用上述過程進行功能性評估，以便更為精確地弄清楚編碼△6-去飽和酶的DNA。
本發(fā)明的一個例子是從藍藻細菌集胞藻屬菌(PasteurCultureCollection，(PCC)6803，AmericanTypeCultureCollection，(ATCC)27184)中分離隨機的DNA，克隆到粘性質(zhì)粒載體中，并通過轉(zhuǎn)結(jié)合作用導入到GLA缺陷的藍藻細菌魚腥藻屬菌菌株PCC7120，ATCC27893中。用氣相色譜監(jiān)測從魚腥藻屬菌的亞油酸生成GLA，并分離相應的DNA片段。
用本領域普通技術人員已知的方法，例如Sambrook等人(1989)描述的方法對分離的DNA排序。
根據(jù)本發(fā)明，已經(jīng)分離了含有△6-去飽和酶基因的DNA。更具體是說，一段含有△6-去飽和酶基因的3.588kb的DNA已從藍藻細菌集胞藻屬菌中分離出來。測定3.588kbDNA的核苷酸順序并示于SEQIDNO1中。表明有效編碼區(qū)的開放讀碼存在于核苷酸317-1507和核苷酸2002-3081。為了明確負責編碼△6-去飽和酶的核苷酸，把提供△6-去飽和酶活性的3.588kb片段裂解為二個亞片段，其中的每一個亞片段都僅含有一個開放讀碼。片段ORF1含有核苷酸1-1704，片段ORF2含有核苷酸1705-3588。每一個片段都以向前和逆向兩種方向亞克隆到結(jié)合的表達載體中(AM542，Wolk et al，1984 Proc.Natl.Acad.Sci.USA 81，1561)，該載體含有一種藍藻細菌羧化酶啟動子。所得到的構建體[即ORF1(F)，ORF1(R)，ORF2(F)和ORF2(R)]通過標準方法(例如參見Wolk，et al，1984，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 81，1561)結(jié)合到野生型魚腥藻屬菌PCC7120中。在選擇性培養(yǎng)基(含有30ug/ml新霉素的標準無機培養(yǎng)基BG11N，參見Rippka et al，1979，J.Gen Microbiol.111，1)生長二周后，從死亡的非結(jié)合性細胞的棕色背景中被結(jié)合的魚腥藻屬細胞為NeoR綠色菌落。篩選出綠色菌落，并在選擇性液體培養(yǎng)基(含有15ug/ml新霉素的BG11N)中生長。用標準方法(例如Dahmer et al，1989，Journal of American Oil Chemical Society 66，543)從所得的含有向前和逆向定位的ORF1和ORF2構建體的轉(zhuǎn)結(jié)合體中提取脂類，作為對比，同樣也從魚腥藻屬菌和集胞藻屬菌的野生型培養(yǎng)物中提取脂類。通過氣液色譜(GLC)，例如用裝有氫火焰電離檢測器和毛細管柱的Tracor-560氣液色譜分析脂肪酸甲基酯。GLC分析結(jié)果示于表1中。
表1野生型和轉(zhuǎn)基因藍藻細菌中C18脂肪酸來源18:018:118:2γ18:3α18:318:4魚腥藻屬菌(野生型)+++-+-魚腥藻屬菌+ORF1(F)+++-+-魚腥藻屬菌+ORF1(R)+++-+-魚腥藻屬菌+ORF2(F)++++++魚腥藻屬菌+ORF2(R)+++-+-集胞藻屬菌(野生型)++++--如GLC分析所確定的，當含有以向前方向定位的ORF2的構建體通過轉(zhuǎn)結(jié)合，GLA缺陷的魚腥藻屬菌便獲得了生產(chǎn)GLA的功能。帶有以相對于羧化酶啟動子而言相反的方向定位的ORF2或以正或反兩個方向定位的ORF1的構建體的轉(zhuǎn)結(jié)合體未顯示出GLA的生成。這一分析結(jié)果表明，位于1884bp片段中的單個開放讀碼編碼△6-去飽和酶。1884bp片段示于SEQ.IDNO3中。這也分別由示于圖1(A)和(B)中的△6-去飽和酶和△12-去飽和酶[Wadaetal，1990，Nature，347]之間水療法圖完全相似性所證實。
通過上述功能性分析，或通過用分離編碼魚腥藻屬菌△6-去飽和酶的核酸作為雜交探針的核酸雜交技術從其它的產(chǎn)GLA生物體鑒定分離的編碼△6-去飽和酶的核酸。本發(fā)明設想的基因組克隆和cDNA克隆的方法是技術人員已知的。雜交探針可以含有公開于SEQIDNO1中的完整DNA序列或者是限制性片段或是其它的DNA片段，包括寡核苷酸探針，用交叉雜交來克隆同源基因的方法是本領域普通技術人員已知的，例如可見于Sambrook(1989)和Beltzetal，1983，MethodsinEnzymology100，266。
通過導入編碼△6-去飽和酶DNA而獲得生產(chǎn)GLA功能的轉(zhuǎn)基因生物體也獲得了產(chǎn)十八碳四烯酸(octadecatetraenoicacid)(18∶4△6，9，12，15的功能。十八碳四烯酸(Octadecate-traenoicacid)正常存在于魚油和紫草科的一些植物種中(Craigetal，1964，J.Amer.OilChem.Soc.41，209-211;Grossetal;1976，Can.J.PlantSci.56，659-664)。在本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因生物體中，十八碳四烯酸是在△6-去飽和酶的作用下α-亞麻酸進一步去飽和或是在△15-去飽和酶作用下GLA進一步去飽和而得到的。
由ORF2編碼的359個氨基酸，即編碼△6-去飽和酶的開放讀碼用SEQ.I NO2表示.本發(fā)明進一步設想了編碼SEQ ID NO2的氨基酸的其它核苷酸順序。鑒定例如由遺傳密碼簡并性而產(chǎn)生的這類順序是普通專業(yè)技術人員已知的，而且，通過上述得到的功能性分析，本領域的普通技術人員能確定含有編碼△6-去飽和酶的ORF2的1884bp片段的更次一級片段。
本發(fā)明設計了任何△6-去飽和酶多肽片段以及保留有將LA轉(zhuǎn)變成GLA活性的核酸。
在本發(fā)明的另外一方面，含有1884bp片段的載體或含有△6-去飽和酶基因啟動子、編碼順序和終止區(qū)的更小的片段被轉(zhuǎn)移到一種生物體中，例如藍藻細菌中，在所說的生物體中，△6-去飽和酶啟動子和終止區(qū)是能發(fā)揮功能的。因此，本發(fā)明提供了生產(chǎn)重組的△6-去飽和酶的生物體。另外一方面，本發(fā)明提供了分離的△6-去飽和酶，它能通過標準的蛋白質(zhì)純化技術(例如可參見Ausubeletal，1987，CurrentProtocolsinMolecularBiology，GreenPublishingAssociates，NewYork)從重組生物體中純化出來。
本發(fā)明還提供了含有編碼△6-去飽和酶的DNA的載體。在各種生物體中構建適合的載體指導表達△6-去飽和酶編碼順序是本領域普通技術人員顯而易見的。特別優(yōu)選的是可復制性表達載體，本文所述的可復制性表達載體指的是經(jīng)過處理的用于調(diào)控目的基因即△6-去飽和酶基因表達的DNA或RNA的分子。優(yōu)選的載體是質(zhì)粒、噬菌體、粘性質(zhì)?；虿《尽ＶT如wolketal.(1984)Proc.Natl.Acad.Sci.USA.1561-1565和Bustosetal(1991)J.Bacteriol.174，7525-7533所述的往復性載體證實與本發(fā)明相符。一些文獻(Sambrooketal，(1989);Goeddel，ed.(1990)MethodsinEnzymology185AcademicPress;Perbal1988，APracticalGuidetoMolecularCloning，JohnWileyandSons，Inc.)對能夠插入和表達編碼所說△6-去飽和酶核酸的載體進行了詳細論述。這類載體還含有能有效表達編碼△6-去飽和酶核酸的核酸順序。能夠有效進行基因產(chǎn)物表達的順序單元包括啟動子、增強子成分;上游活化順序、轉(zhuǎn)錄終止信號和多腺苷酸化位點，基本的和組織特異性的啟動子本發(fā)明都考慮到了。為了轉(zhuǎn)化植物細胞，花椰菜花葉病毒(CaMV)35s啟動子和在植物種子突變過程中被調(diào)整過的啟動子都特別值得感興趣。所有這類啟動子和轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)成分的單個體或結(jié)合體用于本發(fā)明的可復制性表達載體，并為本領域普通技術人員所了解。例如Restrepo等人(PlantCell，2，987，1990)描述過CaMV35S啟動子。還設計了經(jīng)遺傳工程處理的和遺傳突變的調(diào)節(jié)順序。
普通的專業(yè)技術人員能夠決定適于在特定宿主細胞中進行表達的載體和調(diào)節(jié)成分。例如，含有來自編碼魚腥藻屬菌的羧化酶基因啟動子的載體可連接到△6-去飽和酶編碼區(qū)，并進一步可連接到來自集胞藻屬菌的終止信號，這些載體在藍藻細菌中適合△6-去飽和酶的表達。本文中的“可連接”(Operablylinked)指的是啟動子和終止子順序有效地發(fā)揮調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄的作用。另一個例子是適于在轉(zhuǎn)基因植物中表達△6-去飽和酶的載體能含有一個衍生于半日花素。napin或glycin種子特異性的啟動子順序，該啟動子可連接到△6-去飽和酶編碼區(qū)，并進一步可行性連接到種子終止信號或nopaline合成酶終止信號。
本發(fā)明特別考慮了將半日花素(helianthinin)調(diào)節(jié)成分作為指導本發(fā)明△6-去飽和酶表達的啟動子成分，調(diào)節(jié)成分在申請?zhí)枮?28、354申請日為1991，4，8的美國末決申請中公開，該申請并入本文作為參考。
對本文公開的核苷酸順序或具有所設計功能的調(diào)節(jié)成分的修飾也包括在本發(fā)明范圍內(nèi)。這類修飾作用包括插入、替代和缺失以及反映遺傳密碼簡并性的特異性替代。
構建這種雜交載體的標準技術是本領域普通技術人員已知的，并可參見文獻，如Sambrooketal，1989或大量可隨處可得的關于重組DNA技術的實驗室手冊。多種設計可用于DNA片段的連接，所做的選擇取決于DNA片段的末端性質(zhì)，根據(jù)本發(fā)明，雜交載體包括便于克隆、表達或加工的其它核苷酸順序成分，例如編碼信號肽的順序，編碼使蛋白質(zhì)在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中滯留所要求的KDEL的順序，或是編碼引導△6-去飽和酶進入葉綠體的轉(zhuǎn)運肽的順序。這些順序是本領域普通專業(yè)人員已知的。例如，VandenBroeck等人(Nature313，358，1985)已描述過比較理想的轉(zhuǎn)運肽。又如，Michaelis等人(Ann.Rev.Microbiol，36，425，1982)公開了原核的和真核的信號順序。
本發(fā)明的另外一個方面是提供了含有編碼本發(fā)明的△6-去飽和酶DNA的生物體而不是藍藻細菌。根據(jù)本發(fā)明的設計，轉(zhuǎn)基因生物體包括細菌、藍藻細菌、真菌、植物和動物。本發(fā)明分離的DNA可以通過現(xiàn)有技術已知的方法，如感染、轉(zhuǎn)染、轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)結(jié)合而導入宿主細胞中。將本發(fā)明的DNA轉(zhuǎn)移到上述生物體中的技術是普遍知曉的，可見于參考文獻中，如Sambrooketal，1989。
已知多種植物轉(zhuǎn)化方法。根據(jù)Horsch等人(Science227，1229，1985)描述的葉花盤轉(zhuǎn)化一再生方法可將△6-去飽和酶基因?qū)氲街参镏小Ｆ渌霓D(zhuǎn)化方法，如原生質(zhì)體培養(yǎng)(Horschetal，1984，Science223，496;DeBlocketal(1984)EMBOJ.2，2143，Bartonetal，(1983)Cell32，(1033)也可以應用，且包括于本發(fā)明的范圍內(nèi)，在一個優(yōu)選的實施方案中，用土壤桿菌衍生的載體轉(zhuǎn)化植物。而且，其它的方法可用來將本發(fā)明的△6-去飽和酶基因插入到植物細胞中。這類可選擇的方法包括biolistic方法(Kleinetal，1987，Nature327，70)、電穿孔、化學誘導DNA攝入以及用病毒或花粉作為載體的應用。
當轉(zhuǎn)化的方法需要時，本發(fā)明的△6-去飽和酶基因可以插入到植物轉(zhuǎn)化載體中，例如Bevan(1984，NucleicAcidsRes.12，8111)描述過的二元載體。植物轉(zhuǎn)化載體可以通過修飾根癌土壤桿菌的天然基因轉(zhuǎn)移系統(tǒng)進行衍生，天然系統(tǒng)包括含有稱作T-DNA的大片段的大Ti(腫瘤誘生性)質(zhì)粒，它可被轉(zhuǎn)移到轉(zhuǎn)化的植物中。Ti質(zhì)粒的另外一個片段Vir區(qū)是負責T-DNA轉(zhuǎn)移的。T-DNA區(qū)是由末端重復區(qū)接界的。在經(jīng)修飾的二元載體中，缺失了腫瘤誘導基因，并利用Vir區(qū)的功能轉(zhuǎn)移由T-DNA邊界順序接界的外源DNA。T區(qū)還含有一個用于抗生素抗性的可選擇性標記和一個作為轉(zhuǎn)移的插入順序的多克隆位點。這種工程菌被稱為“去武裝”根癌土壤桿菌菌株，并且允許由T-區(qū)接界的順序的有效轉(zhuǎn)化到植物的核基因組中。表面無菌的葉花盤與去武裝的含外源DNA的根癌土壤桿菌一起孵育，培養(yǎng)2天，然后轉(zhuǎn)移到含抗生素的培養(yǎng)基中。當培養(yǎng)物在含有合適的抗生素的培養(yǎng)基中生根之后，篩選被轉(zhuǎn)化的嫩芽，再轉(zhuǎn)移到泥土中進行再生。
本發(fā)明的另一方面是提供了含有本發(fā)明分離的DNA的轉(zhuǎn)基因植物或這些植物的子代，單子葉和雙子葉植物都考慮到了。借助上述任何一種植物轉(zhuǎn)化方法分離的編碼△6-去飽和酶的DNA轉(zhuǎn)化植物細胞。被轉(zhuǎn)化的植物細胞通常是在胼胝體培養(yǎng)物或葉花盤中，通過本領域技術人員已知的方法(例如，Horschetal，1985，Science，227，1129)再生成一個完全的轉(zhuǎn)基因植物。在一個優(yōu)選的實施方案中，轉(zhuǎn)基因植物是向日葵、油籽油菜、玉米、煙草、花生或大豆。因為轉(zhuǎn)基因植物的子代遺傳編碼△6-去飽和酶DNA，得自被轉(zhuǎn)化植物的種子或插技常用于保持轉(zhuǎn)基因的植物系。
本發(fā)明進一步提供了生產(chǎn)GLA含量提高了的轉(zhuǎn)基因植物的方法。該方法包括將編碼△6-去飽和酶的DNA導入缺乏GLA或GLA水平較低但含有LA的植物細胞中，和從轉(zhuǎn)基因細胞再生提高了GLA含量的植物。特別考慮了商業(yè)性生產(chǎn)的農(nóng)作物植物作為轉(zhuǎn)基因生物體，它包括但不限于向日葵、大豆、油籽油菜、玉米、花生和煙草。
本發(fā)明進一步提供了生產(chǎn)含有GLA轉(zhuǎn)基因生物體的方法。該方法包括將編碼△6-去飽和酶DNA導入缺乏GLA或具有低水平GLA但含有LA的生物體中，在另一個實施方案中，該方法包括將含有編碼△12-去飽和酶和△6-去飽和酶DNA的一種或多種表達載體導入缺乏GLA和LA的生物體中。因此，通過表達△12-去飽和酶，在缺乏LA和GLA的生物體中誘導LA的產(chǎn)生，然后因△6-去飽和酶的表達而產(chǎn)生GLA。通過本領域技術人員已知的重組技術方法(Sambrook，etal，1989)和已公開的△12-去飽和酶順序(Wadaetal，1990，Nature347，200-203)可以構建含有編碼△12-去飽和酶或是含有編碼△12-去飽和酶和△6-去飽和酶的DNA的表達載體。
此外，根據(jù)本發(fā)明，已發(fā)現(xiàn)SEQ.IDNO1的核苷酸2002-3081編碼藍藻細菌的△12-去飽和酶，據(jù)此。該順序能用于構建有關本題的表達載體。特別考慮于商業(yè)性生產(chǎn)的農(nóng)作物植物的作為轉(zhuǎn)基因生物體，它包括但不限于向日葵、大豆、油籽菜油、玉米、花生和煙草。
本發(fā)明進一步涉及一種在植物中誘導抗寒力的方法。寒冷敏感性可能產(chǎn)生于細胞膜中脂質(zhì)的相變。膜脂中相變溫度取決于脂肪酸的不飽和度。因此，通過導入△6-去飽和酶使LA轉(zhuǎn)變成GLA以增加不飽和度即可誘生或改善抗寒能力。鑒此，本發(fā)明的方法包括將編碼△6-去飽和酶的DNA導入植物細胞，并從所說的被轉(zhuǎn)化植物細胞再生改善了抗寒力的植物，在一個優(yōu)選的實施方案中，所說的植物是向日葵、大豆、油籽油菜、玉米、花生或煙草。
下面的實施例將進一步說明本發(fā)明。
實施例1菌株和培養(yǎng)條件集胞藻屬菌(PCC 6803，ATCC 27184)、魚腥藻屬菌(PCC 7120，ATCC 27893)和聚胞藻屬菌(Synechococcus)(PCC 7942，ATCC 33912)置BG11N+培養(yǎng)基(Rippka et al，1979，J.Gen.Microbiol.111，1-61)中在白熾燈照明條件下(60μE·m-2·s-1)于30℃行光能自養(yǎng)性生長。選擇粘性質(zhì)粒和質(zhì)粒并使之在Maniatisetal，(1982)[MolecularCloningALaboratoryManual，ColdspringHarborLaboratory，ColdSpring，NewYork]等人所描述的在標準濃度的含抗生素的LB介質(zhì)的大腸桿菌菌株DH5α中生長。
實施例2集胞藻屬菌粘性質(zhì)?；蚪M文庫的構建用Sau3A部分消化得自集胞藻屬菌(PCC6803)的總的基因組DNA，并在蔗糖梯度上進行分離(Ausubeletal，1987，CurrentProtocolsinMolecularBiology，GreenePublishingAssociatesandWileyInterscinec，NewYork).篩選含有30-40kbDNA片段的餾份，并連接到粘性質(zhì)粒載體的脫磷酸BamHI位點PDUCA7(Buikemaetal(1991)J.Bacteriol.173，1879-1885)。如Ausubel等人所述(1987)在體外包裝連接的DNA，并包裝的噬菌體在含有AVal和E-co4711甲基酶輔助質(zhì)粒pRL528(Buikemaetal.1991)的E.Col-iDH5α中繁殖。隨機分離共1152克隆，并單個維持于12個96孔微量滴定板中。
實施例3魚腥藻屬菌獲得表達GLA的功能魚腥藻屬菌(PCC 7120)是一種花絲狀藍藻細菌，缺乏GLA但含有足夠量的生成GLA的前體亞油酸(圖2;表2)。實施例2中所述的集胞藻屬菌粘性質(zhì)粒文庫結(jié)合到魚腥藻屬菌(PCC 7120)中，鑒定生產(chǎn)GLA的轉(zhuǎn)結(jié)合體。在BG11N+液態(tài)介質(zhì)中，魚腥藻屬菌細胞生長至對數(shù)中期，之后在相同介質(zhì)中懸浮至終濃度約2×108細胞/ml。生長于含氨芐青霉素的LB中的E.Coli Rp4(Burkardt et al，1979，J Gen.Microbiol.114.341-348)對數(shù)中期培養(yǎng)物經(jīng)洗滌后重懸于新鮮的LB培養(yǎng)基中。然后將魚腥藻屬菌與RP4混合，并均勻地分散于含有5%LB的BG11N+平板上。粘性質(zhì)?；蚪M文庫經(jīng)平板印影培養(yǎng)到含50μg/ml卡那霉素和17.5μg/ml氯霉素的LB平板上，繼爾將上述培養(yǎng)物切成小片置于含有魚腥藻屬菌和RP4和BG11N+平板上，于30℃孵育24小時后，30μg/ml的新霉素加至平板底層于30℃繼續(xù)孵育直至出現(xiàn)轉(zhuǎn)結(jié)合體。
結(jié)合作用完成后分離單個的轉(zhuǎn)結(jié)合體，并置于含15μg/ml新霉素的2ml BG11N+液體培養(yǎng)基中生長。如下所述，從野生型培養(yǎng)物和含有10個轉(zhuǎn)結(jié)合體庫的培養(yǎng)物中制備脂肪酸甲基酯。通過離心收集野生型和轉(zhuǎn)基因型藍藻細菌培養(yǎng)物。用蒸餾水洗滌二次。按Dahmer等人所述方法(1989，J.Amer.Oil Chem.Soc.66，543-548)從這些培養(yǎng)物中提取脂肪酸甲基酯，并通過氣液色譜(GLC)用裝有氫火焰電離檢測儀和毛細管柱(30m×0.25mm，結(jié)合了FSOT Superox Ⅱ，Alltech AssociateInc.，IL)的Tra-cor-560進行分析。以滯留時間和標樣(得自Sigma化學公司)的共同色譜分析來鑒定脂肪酸。平均脂肪酸組成通過各個C18脂肪酸峰值區(qū)與內(nèi)標區(qū)的比值歸一化確定。
有代表性的GLC圖譜示于圖2中，還顯示了C18脂肪酸甲基酯。通過與已知的脂肪酸甲基酯標準物的洗脫時間進行比較鑒別出各個峰，并用氣相色譜質(zhì)譜光譜測定法進行證實。圖2(A)描述了野生型魚腥藻屬菌脂肪酸的GLC分析。箭頭表示GLA的遷移時間。圖2(B)是帶有pAM542+1.8F的魚腥藻屬菌轉(zhuǎn)結(jié)合體脂肪酸的GLC圖譜。證明了2個產(chǎn)GLA庫(從代表250個轉(zhuǎn)結(jié)合體的25個庫中)能產(chǎn)生GLA。對每個GLA陽性庫的單個轉(zhuǎn)結(jié)合體進行產(chǎn)GLA的分析，兩個來自不同庫的獨立的轉(zhuǎn)結(jié)合體AS13和AS75被鑒定為能表達很高水平的GLA并分別含有粘性質(zhì)粒cSy13和cSy75(圖3)。粘性質(zhì)粒在約7.5kb長度的區(qū)域重疊。cSy75的一個3.5kbNheI片段再克隆入載體pDUCA7中，并轉(zhuǎn)移到魚腥藻屬菌中從而獲得GLA表達功能(圖2)。
cSy75-3.5的3.5kbNheI片段的兩個NheI/HindⅢ亞片段(1.8和1.7kb)被亞克隆到“pBLUESCRIPT”中(Stratagene)(圖3)用于測序。按照Maniatis等人(1982)和Ausubel等人(1987)所述的方法進行標準的分子生物學技術操作。通過用AdvaneedDNATechnologiesLaboratory(BiologyDepartment，TexasA&MUniversity)合成特殊的低聚核苷酸引物用“SEQUENASE”(UnitedStatesBiochemical)進行pBS1.8的雙鏈雙脫氧測序(Sangeretal.1977，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，74，5463-5467)。用Devereux等人(1984，NucleicAcidsRes.12.387-395)描述的GCG(MadisonWI)軟件進行DNA序列分析。
兩個NheⅠ/HindⅢ片段都以相對于藍藻細菌羧化酶啟動子的向前和逆向兩個方向轉(zhuǎn)移到結(jié)合性表達載體AM542中，再經(jīng)結(jié)合作用導入魚腥藻屬菌。含有向前方向定位的1.8kb片段(AM542-1.8F)的轉(zhuǎn)結(jié)合體產(chǎn)生大量的GLA和十八碳四烯酸，(圖2，表2)。含有其它構建體(無論是逆向定位的1.8kb片段還是向前和逆向定位的1.7kb片段)的轉(zhuǎn)結(jié)合體不能產(chǎn)生可檢測水平的GLA(表2)。
圖2將從野生型魚腥藻屬菌中提取的C18脂肪酸圖譜(圖2A)與含有向前方向定位的cSy75-3.5的1.8kb片段的轉(zhuǎn)基因魚腥藻屬菌提取物中的C18脂肪酸圖譜(圖2B)進行了比較。得自AM542-1.8F的脂肪酸甲基酯的GLC分析顯示了一個與可靠的GLA標準物滯留時間一致的峰。經(jīng)氣相色譜質(zhì)譜光譜測定法進行的有關該峰的分析證實，它的質(zhì)譜裂解方式與GLA參照樣品的相同。改變了多不飽和脂肪酸含量的轉(zhuǎn)基因魚腥藻屬菌在生長速度和形態(tài)學方面與野生型魚腥藻屬菌相似。
表2野生型和轉(zhuǎn)基因藍藻細菌中C18脂肪酸的比較脂肪酸菌株18:018:118:218:3(α)18:3(γ)18:4野生型集胞藻屬菌(PCC 6803)13.64.554.5-27.3-魚腥藻屬菌(PCC 7120)2.924.837.135.2--聚胞藻屬(藍藻)(PCC 7942)20.679.4----魚腥藻屬菌轉(zhuǎn)結(jié)合體cSy753.824.422.39.127.912.5cSy75-3.54.327.618.13.240.46.4pAM542-1.8F4.213.912.119.125.425.4pAM542-1.8R7.723.138.430.8--pAM542-1.7F2.827.836.133.3--pAM542-1.7R2.825.442.329.6--聚胞藻屬菌轉(zhuǎn)結(jié)合體pAM85427.872.2----pAM854-△124.043.246.0---pAM854-△618.281.8----pAM854-△6和△1242.725.319.5-16.5-18∶0，硬脂酸;18∶1，油酸;18∶2，亞油酸;18∶3(α)，α-亞麻酸，18∶3(γ)，γ-亞麻酸;18∶4，十八碳四烯酸。
實施例4用△6和△12去飽和酶基因轉(zhuǎn)化聚胞藻屬用根據(jù)公開的集胞藻屬菌△12-去飽和酶基因順序(Wada et al，1990，Nature，347，200-203)合成的寡核苷酸篩選集胞藻屬菌基因組文庫，分離到含有△12-去飽和酶基因的第三種粘性質(zhì)粒cSy7。得自含有△12去飽和酶基因的這種粘性質(zhì)粒的1.7kb AvaI片段被鑒定并用作探測器測定cSy13，測定表明cSy13不僅含有△6-去飽和酶基因，而且含有△12-去飽和酶基因(圖3)。基因組的Southern吸印分析進一步表明?！?和△12去飽和酶基因兩者在集胞藻屬菌基因組中是唯一的，所以兩種涉及C18脂肪酸去飽和作用的功能性基因緊密連接在集胞藻屬菌基因組中。
單細胞藍藻細菌聚胞藻屬菌(PCC7942)缺乏亞油酸和GLA(3)。△12和△6去飽和酶基因被單個和一起克隆穿梭載體pAM854(Bustosetal，1991，J.Bacteriol.174，7525-7533)中，該載體含有將外源DNA整合到聚胞藻屬菌基因組中所需的順序(Goldenetal，1987，MethodsinEnzymol.153，215-231)。用這些基因構建體轉(zhuǎn)化聚胞藻屬菌并篩選菌落。從轉(zhuǎn)基因聚胞藻屬菌中提取脂肪酸甲基酯，并用GLC進行分析。
表2說明，野生型聚胞藻屬菌中的主要脂肪酸是硬脂酸(18∶0)和油酸(18∶1)。用pAM854-△12轉(zhuǎn)化的聚胞藻屬菌表達了除主要脂肪酸以外的亞油酸(18∶2)。帶有pAM854-△6和△12轉(zhuǎn)化體生產(chǎn)亞油酸和GLA(表1)。這些結(jié)果表明，含有△12和△6-去飽和酶基因的聚胞藻屬菌已經(jīng)獲得了在C18脂肪酸的△12位置上引進第二個雙鏈和在△6位置上引進第3個雙鍵的能力。但是，觀察表明，在含pAM854-△6的轉(zhuǎn)化體中，脂肪酸組成并沒有變化，這表明，在由△12去飽和酶合成的酶作用物缺乏的情況下，△6去飽和酶不活潑。該實驗進一步證明1.8kbNheI/HindⅢ片段(圖3)含有集胞藻屬菌△6-去飽和酶基因的編碼區(qū)和啟動子區(qū)。改變了多不飽和脂肪酸含量的轉(zhuǎn)基因聚胞藻屬菌在生長速度和形態(tài)學方面與野生型菌株相似。
實施例5△6-去飽和酶的核苷酸順序測定了包括功能性△6-去飽和酶基因的cSy75-3.5的1.8kb片段的核苷酸順序。一個編碼359個氨基酸多肽的開放讀碼被鑒定(圖4)。由Kyte-Doolittle(Kyteetal.，J.Mol.Biol.157.105-132水療分析鑒定疏水氨基酸的兩個區(qū)可代表轉(zhuǎn)換膜區(qū)(transmembranedomains)(圖1A)，并且△6-去飽和酶基因與△12-去飽和酶基因(圖1B，Wadaetal.)和△9去飽和酶基因(Thiedeetal.)J.BiolChem.261，13230-13235)的水療圖相似。
但是，集胞藻屬菌的△6-去飽和酶和△12-去飽和酶之間的順序相似性在核苷酸水平小于40%，在氨基酸水平約小于18%。
實施例6藍藻細菌的△6-去飽和酶轉(zhuǎn)移到煙草中將藍藻細菌的△6-去飽和酶基因轉(zhuǎn)移到植物表達載體中，再通過土壤桿菌介導的基因轉(zhuǎn)移技術轉(zhuǎn)移到煙草中。為了保證被轉(zhuǎn)移的去飽和酶在葉及發(fā)育的種子中合適地表達及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和葉綠素中去飽和基因產(chǎn)物的確定。安裝帶有集胞藻屬菌去飽和酶開放讀碼(ORF)的各種表達盒。這些盒的成分包括(ⅰ)35S啟動子或衍生于向日葵半日花素基因的種子特異性啟動子，它分別啟動△6-去飽和酶基因在所有植物組織中表達或僅在發(fā)育的種子中表達;(ⅱ)一種推測的信號肽，它來自胡蘿卜延伸蛋白基因或向日葵半日花素基因，引導新合成的△6-去飽和酶進入ER;(ⅲ)位于△6-去飽和酶ORF羧基末端的ER腔滯留信號順序(KDEL);(ⅳ)引導△6-去飽和酶進入葉綠體的理想轉(zhuǎn)運肽。35S啟動子是Restrepo等人(1990)所述質(zhì)粒pRTL2衍生物。VandeBroeck等人(1985)描述了理想的轉(zhuǎn)移肽順序。Chen等人(1985，EMBOJ.9，2145)描述了胡蘿卜延伸蛋白信號肽。
生產(chǎn)含有嵌合藍藻細菌性去飽和酶基因的轉(zhuǎn)基因煙草植物，所說的嵌合體由融合到內(nèi)質(zhì)網(wǎng)滯留順序(KDEL)中的集胞藻屬菌△6-去飽和酶基因和由CaMv35S啟動子啟動的延伸蛋白信號肽組成。轉(zhuǎn)基因煙草基因組DNA的PCR擴增反應表明△6去飽和酶基因已被摻入到煙草基因組中，從這些轉(zhuǎn)基因煙草植物葉中提取脂肪酸甲基酯，并用氣液色譜(GLC)進行分析。這些轉(zhuǎn)基因煙草集聚了大量的GLA(圖4)。圖4表示通過GLC確定的脂肪酸甲基酯。與已知的脂肪酸甲基酯標準品的洗脫時間進行比較鑒定出各個峰。因此，涉及脂肪酸代謝的藍藻細菌的基因可用于生產(chǎn)改變了脂肪酸組成的轉(zhuǎn)基因植物。
序列表(1)概況(i)申請人:Thomas,Terry L.
Reddy,Avutu S.
Nuccio,MichaelFreyssinet,Georges L.
(ii)發(fā)明名稱:利用△6-去飽和酶生產(chǎn)γ亞麻酸(iii)順序數(shù)目:3(iv)通信地址:
(A)地址:Scully,Scott,Murphy&Presser(B)街道:400 Garden City Plaza(C)城市:Garden市(D)州:紐約(E)國家:美國(F)郵政編碼:11530(V)計算機可讀形式:
(A)介質(zhì)類型:Floppy盤(B)計算機:IBM PC可容性(C)操作系統(tǒng):PC-DOS/MS-DOS(D)軟件:Patent In Release #1. OVersion#1.25(Vi)目前的申請資料:
(A)申請?zhí)?待定(B)申請日:1992.1.8(C)分類(Viii)代理人情況
(A)姓名:McNulty,Willian E.
(B)登記號:22,606(C)參考/標記號:8383Z(ix)電信信息:
(A)電話:(516)742-4343(B)傳真:(516)742-4366(C)電傳:230 901 SANS UR(2)SEQ.ID NO:1(i)順序特征:
(A)長度:3588bp(B)類型:核酸(C)鏈股數(shù):雙(D)拓撲學:線性(ii)分子類型:DNA(基因組的)(ix)性質(zhì):
(A)名稱/關鍵:CDS(B)定位:2002..3081(xi)順序描述:SEQ ID NO:1:
(2)SEQ ID NO:2(i)順序特征:
(A)長度:359個氨基酸(B)類型:氨基酸(D)拓撲學:線性(ii)分子類型:蛋白質(zhì)(xi)順序描述:SEQ ID NO:2
Glu Ala Met Gly Lys Ala Ser355(2)SEQ ID NO:3:
(i)順序特征:
(A)長度:1884bp(B)類型:核酸(C)鏈股數(shù):雙(D)拓撲學:線性(ii)分子類型:DNA(基因組的)(xi)順序描述:SEQ ID NO:權利要求
1.一種分離的編碼細菌性△6-去飽和酶的核酸。
2.權利要求1的核酸，含有SEQ.ID NO3的核苷酸。
3.一種分離的編碼被權利要求1的核酸編碼的氨基酸順序的核酸。
4.權利要求1-3的任何一種分離的核酸，所說的核酸包含于載體中。
5.權利要求4的分離的核酸適當?shù)嘏c一啟動子和/或終端信號連接能影響所說的分離的核酸的基因產(chǎn)物表達。
6.權利要求5的分離的核酸，其中所說的啟動子是△6-去飽和酶啟動子、魚腥藻屬菌羧化酶啟動子，半日花素啟動子、Glycin啟動子，napin啟動子或半日花素組織特異性啟動子。
7.權利要求5的分離的核酸，其中所說的終止信號是集胞藻屬菌終止信號、nopaline合成酶終止信號或種子終止信號。
8.權利要求1-7中任何一種分離的核酸，其中所說的分離的核酸是包含在一種轉(zhuǎn)基因的生物體中。
9.權利要求8中的分離的核酸，其中所說的轉(zhuǎn)基因生物體是細菌、真菌、植物細胞或動物。
10.一種從利要求9的轉(zhuǎn)基因植物細胞再生的植物或所說植物的子代。
11.權利要求10的植物，其中所說的植物是向日葵、大豆、玉米、煙草、花生或油籽油菜植物。
12.一種生產(chǎn)提高了γ-亞麻酸(GLA)含量的植物的方法，它包括(a)用權利要求1-7的任何一種分離的核酸轉(zhuǎn)化植物細胞;(b)所說的植物細胞再生提高了GLA含量的植物。
13.權利要求12的方法，其中所說的植物是向日葵、大豆、玉米、煙草、花生或油籽油菜植物。
14.一種誘導γ-GLA產(chǎn)生的方法，包括用權利要求1-7中任何一種分離的核酸轉(zhuǎn)化所說的生物體。
15.一種在GLA和亞油酸(LA)缺陷或GLA和LA缺乏的生物體中誘導γ-GLA產(chǎn)生的方法，它包括用分離的編碼細菌性△6-去飽和酶的核酸和分離的編碼△12-去飽和酶的核酸轉(zhuǎn)化所說的生物體。
16.一種在GLA和LA缺陷或缺乏的生物體中誘導γ-GLA產(chǎn)生的方法，它包括用至少一種含有分離的編碼細菌性△6-去飽和酶的核酸和分離的編碼△12-去飽和酶的核酸的表達載體轉(zhuǎn)化所說的生物體。
17.權利要求或15或16的任何一種方法，其中所說的分離的編碼△6-去飽和酶的核酸包括SEQ.ID NO1的317-1507核苷酸。
18.一種在γ亞麻酸缺陷或缺乏的生物體中誘發(fā)十八碳四烯酸產(chǎn)生的方法，包括用權利要求1-7中任何一種分離的核酸轉(zhuǎn)化所說的生物體。
19.權利要求18的方法，其中所說的生物體是細菌、真菌、植物或動物。
20.應用權利要求1-7中的任何一種分離的核酸生產(chǎn)一種提高了抗寒力的植物的方法，它包括(a)用權利要求1-7中的任何一種分離的核酸轉(zhuǎn)化植物細胞;(b)從所說的轉(zhuǎn)化了的植物細胞中再生提高了抗寒力的所說植物。
21.權利要求20的方法，其中所說的植物是向日葵、大豆、玉米、煙草、花生或油籽油菜植物。
22.分離的細菌性△6-去飽和酶。
23.權利要求22的分離的細菌性△6-去飽和酶，它具有SEQ ID NO2氨基酸順序。
全文摘要
亞油酸在△6-去飽和酶作用下轉(zhuǎn)變成γ-亞麻酸。本發(fā)明涉及一種分離的含有△6-去飽和酶基因的核酸，更具體地說，分離的核酸含有△6-去飽和酶基因的啟動子、編碼區(qū)和終止區(qū)。本發(fā)明提供包括與異源調(diào)節(jié)順序功能性結(jié)合的△6-去飽和酶編碼區(qū)的重組體構建體。本發(fā)明的核酸和重組體構建體對在轉(zhuǎn)基因生物體中GLA的生產(chǎn)有用。
文檔編號C12N1/21GK1072722SQ9211308
公開日1993年6月2日 申請日期1992年10月10日 優(yōu)先權日1991年10月10日
發(fā)明者T·托馬斯, A·S·雷迪, M·努西奧, G·弗雷西內(nèi) 申請人:羅納-布朗克農(nóng)業(yè)化學公司