一種單磷酸阿糖腺苷的制備方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種單磷酸阿糖腺苷的方法，通過先制備共表達(dá)嘌呤核苷磷酸化酶和尿苷磷酸化酶的基因工程菌，再利用該基因工程菌制備單磷酸阿糖腺苷的方法。其特征在于通過分子克隆的方法在基因工程菌中共同表達(dá)嘌呤核苷磷酸化酶和尿苷磷酸化酶，獲得具有高酶比活的阿糖腺苷生物轉(zhuǎn)化菌，應(yīng)用本發(fā)明得到的菌體生產(chǎn)阿糖腺苷，反應(yīng)底物濃度可提高到大于100mM，反應(yīng)轉(zhuǎn)化率超過90％，且反應(yīng)菌體用量少至0.3％(菌體濕重/反應(yīng)體積ml)，反應(yīng)時(shí)間短至6小時(shí)。
【專利說明】一種單磷酸阿糖腺苷的制備方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及采用生物法制備一種生物工程菌，再利用生物工程菌制備單磷酸阿糖 腺苷的方法，屬于生物工程【技術(shù)領(lǐng)域】。

【背景技術(shù)】
[0002] 阿糖腺苷（adenosine Arabinoside,簡(jiǎn)稱araA)是一種天然抗病毒化合物，具有 廣譜的抗病毒活性，臨床使用的單磷酸阿糖腺苷主要用于治療慢性乙型肝炎和其它病毒性 感染如帶狀皰疹、單純皰疹、生殖器皰疹等，此外在手足口病及兒童水痘方面也有一定的療 效。
[0003] 現(xiàn)有技術(shù)中，阿糖腺苷的合成方法包括化學(xué)法合成和生物轉(zhuǎn)化法合成?；瘜W(xué)法工 藝復(fù)雜，反應(yīng)條件苛刻，原料成本高，使用重金屬試劑，污染環(huán)境。生物轉(zhuǎn)化法的基本原理是 阿糖尿苷和磷酸根離子在尿苷磷酸化酶（EC 2. 4. 2. 3)的作用下生成阿糖1-磷酸和相應(yīng)堿 基；阿糖1-磷酸和腺嘌呤在嘌呤核苷磷酸化酶（EC 2. 4. 2. 1)的作用下生成阿糖腺苷和磷 酸根離子。
[0004]

【權(quán)利要求】
1. 一種單磷酸阿糖腺苷的制備方法，其特征在于先制備共表達(dá)嘌呤核苷磷酸化酶和尿 苷磷酸化酶的基因工程菌，再利用此工程菌制備單磷酸阿糖腺苷。
2. -種如權(quán)利要求1所述的共表達(dá)嘌呤核苷磷酸化酶和尿苷磷酸化酶的基因工程菌， 其特征在于： (1) 基因工程菌株可以是大腸桿菌DH5 a、BL21、Jml09 ; (2) 菌株細(xì)胞內(nèi)含有一種表達(dá)質(zhì)粒，所述的表達(dá)質(zhì)粒是下列之一：pETDuet-1, pACYCDuet-1，pCDFDuet-1，pRSFDuet-1，pCOLADuet-1 ; (3) 在表達(dá)質(zhì)粒上克隆了嘌呤核苷磷酸化酶基因和尿苷磷酸化酶基因，形成共表達(dá)體 系； (4) 嘌呤核苷磷酸化酶基因可以是酶EC2. 4. 2. 1中的任意一個(gè)基因；尿苷磷酸化酶基 因可以是酶EC2. 4. 2. 3中的任意一個(gè)基因； (5) 根據(jù)菌株細(xì)胞內(nèi)含有表達(dá)質(zhì)粒的不同，菌株具有下列之一的抗性：氨芐青霉素抗 性，氯霉素抗性，鏈霉素抗性，卡那霉素抗性； (6) 此菌體在發(fā)酵過程中，通過加入誘導(dǎo)劑可誘導(dǎo)菌體大量合成嘌呤核苷磷酸化酶和 尿苷磷酸化酶，所說的誘導(dǎo)劑可以是IPTG或乳糖等。
3. 制備如權(quán)利1所述的共表達(dá)嘌呤核苷磷酸化酶和尿苷磷酸化酶的基因工程菌的方 法如下：利用PCR擴(kuò)增或限制酶克隆或化學(xué)合成技術(shù)克隆大腸桿菌的尿苷磷酸化酶和嘌呤 核苷磷酸化酶，并將這兩種酶克隆到大腸桿菌的表達(dá)質(zhì)粒中相應(yīng)位點(diǎn)，得到可以共同表達(dá) 嘌呤核苷磷酸化酶和尿苷磷酸化酶的表達(dá)載體，再將此表達(dá)載體轉(zhuǎn)入大腸桿菌，即得到所 述的基因工程菌。
4. 如權(quán)利要求3所述的共表達(dá)嘌呤核苷磷酸化酶和尿苷磷酸化酶基因工程菌的制備 方法，其特征在于所述的方法按如下步驟進(jìn)行： (1) 根據(jù)genebank中公布的大腸桿菌嘌呤核苷磷酸化酶的基因序列和尿苷磷酸化酶 的基因序列，分別設(shè)計(jì)并合成引物； (2) 分別PCR擴(kuò)增嘌呤核苷磷酸化酶的基因序列和尿苷磷酸化酶的基因序列； (3) 把嘌呤核苷磷酸化酶的基因序列和尿苷磷酸化酶的基因序列克隆到表達(dá)質(zhì)粒中； (4) 把含有嘌呤核苷磷酸化酶基因和尿苷磷酸化酶基因的表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)入大腸桿菌，即 得所述基因工程菌。
5. 如權(quán)利1-4任一項(xiàng)所述的共表達(dá)嘌呤核苷磷酸化酶和尿苷磷酸化酶的基因工程菌 應(yīng)用于生產(chǎn)單磷酸阿糖腺苷。
6. 如權(quán)利5所述的共表達(dá)嘌呤核苷磷酸化酶和尿苷磷酸化酶的基因工程菌在生產(chǎn)單 磷酸阿糖腺苷中應(yīng)用，其特征在于，具體操作步驟： (1) 將所述的共表達(dá)嘌呤核苷磷酸化酶和尿苷磷酸化酶的基因工程菌在LB液體中培 養(yǎng)至0D600nm = 0. 4-0. 8時(shí)，加入終濃度為0. 4-lmM的IPTG進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)3-5小時(shí)產(chǎn)生和 積累嘌呤核苷磷酸化酶和尿苷磷酸化酶，離心取菌體； (2) 在磷酸鈉溶液pH6. 0-9. 0、濃度5mM-600mM，阿糖尿苷和腺嘌呤的濃度為5-300mM， 反應(yīng)溫度30°C-80°C，菌體用量0.1-10% (菌體濕重g/溶液體積ml)的條件下，反應(yīng)時(shí)間 1-24小時(shí)，分離純化后即得到阿糖腺苷； (3) 將得到的阿糖腺苷經(jīng)惰性氣體保護(hù)在縛酸劑、催化劑的作用下經(jīng)磷酸化后，處理即 得單磷酸阿糖腺苷。
【文檔編號(hào)】C12P19/32GK104372050SQ201410534740
【公開日】2015年2月25日 申請(qǐng)日期:2014年9月30日 優(yōu)先權(quán)日:2014年9月30日
【發(fā)明者】張志生, 黃彩逢, 孫曄 申請(qǐng)人:廣東先強(qiáng)藥業(yè)股份有限公司