一種基因工程木聚糖酶及其制備與應(yīng)用的制作方法【專利摘要】本發(fā)明公開了一種基因工程木聚糖酶，其是木聚糖酶CbX的N末端截去了信號肽后的突變體，同時實現(xiàn)了木聚糖酶基因在異源宿主細胞內(nèi)的高效表達。本發(fā)明進一步對該木聚糖酶進行改造，截去了C端的碳水化合物結(jié)合結(jié)構(gòu)域，并在C末端引入二硫鍵，構(gòu)建的木聚糖酶蛋白突變體的分子量更小，熱穩(wěn)定性提高，比活力也大大提高。通過以上方式，使該木聚糖酶及其突變體更有潛力應(yīng)用于工業(yè)生產(chǎn)。【專利說明】一種基因工程木聚糖酶及其制備與應(yīng)用【
技術(shù)領(lǐng)域：
】[0001]本發(fā)明屬于酶的基因工程領(lǐng)域，涉及一種木聚糖酶，尤其涉及一種高熱穩(wěn)定性的內(nèi)切木聚糖酶以及生產(chǎn)該高熱穩(wěn)定性內(nèi)切木聚糖酶的基因工程菌?！?br>背景技術(shù)：
】[0002]木聚糖酶（Xylanase，EC.3.2.1.8)是木聚糖降解酶系中最關(guān)鍵的酶，常被用于飼料、食品、飲料、制藥、造紙工業(yè)和生物能源等方面（Beg，Q.K.Kapoor，M.Mahajan，LHoondaljG.S(2001)Microbialxylanasesandtheirindustrialapplications:areview.ApplMicrobiolBiotechnol.56(3-4):326-338)。尤其在造紙工業(yè)，木聚糖酶在紙漿的預(yù)漂白、二次纖維的脫墨等過程中，水解凝結(jié)于纖維表面的半纖維素，提高漂白劑在紙漿中的擴散速度，提高漂白效率，減少氯的使用量，從而減少漂白過程對環(huán)境的污染(LiisaViikarijAnneKantelinenjJormaSundquistjMattiLinko(1994)Xylanasesinbleaching:Fromanideatotheindustry.FEMSMicrobiologyReviews.13(2-3):335-350)〇[0003]目前，研究報道的大多數(shù)木聚糖酶的最適溫度都在45-55°C，其穩(wěn)定性都比較差(HakijG.(2003)Developmentsinindustriallyimportantthermostableenzymes:areview.BioresourTechnol.89(I):17-34)。隨著木聚糖酶的不斷開發(fā)和利用，對酶的穩(wěn)定性要求越來越高，而現(xiàn)有的商品化木聚糖酶大多數(shù)是從中溫微生物中獲得的，熱穩(wěn)定性差，在60°C以上很容易喪失催化活性，不能滿足工業(yè)應(yīng)用的需要。尋找性質(zhì)優(yōu)良的木聚糖酶酶源或者通過蛋白質(zhì)工程技術(shù)對現(xiàn)有木聚糖酶進行改造成為當(dāng)今的科研熱點。[0004]熱解纖維素菌CaldicellulosiruptorbesciiDSM6725(以下簡稱C.besciiDSM6725)是一株于1990年在俄國堪察加半島熱泉分離的菌株，該菌株屬于嚴格厭氧菌，最適生長溫度為75°C(Yang，S.J.Kataeva，I.Wiegel，J.Yin，Y.Dam，P.Xu，Y.Westpheling，J.Adams,M.W.(2010)Classificationof'Anaerocellumthermophilum'strainDSM6725asCaldicellulosiruptorbesciisp.nov.IntJSystEvolMicrobiol.60(9):2011-5.)〇C.besciiDSM6725不僅高效利用處理過的生物質(zhì)，如纖維素和木聚糖，也能高效利用未處理的生物質(zhì)（Yang，S.J.Kataeva，I.Hamilton-Brehm，S.D.Engle，N.L.TschaplinskijT.J.DoeppkejC.Davis,M.WestphelingjJ.Adams,M.W.(2009)Efficientdegradationoflignocellulosicplantbiomass,withoutpretreatment,bythethermophilicanaerobe^AnaeroceIIumthermophilum"DSM6725.ApplEnvironMicrobiol.75(14):4762-9)。C.besciiDSM6725的基因組測序已于2009年完成(Kataeva,I.A.Yang,S.J.Dam,P.Poole,F.L.,2ndYin,Y.Zhou,F.Chou,W.C.XujY.Goodwin,L.Sims,D.R.DetterjJ.C.Hauser,L.J.WestphelingjJ.Adams,M.W.(2009)Genomesequenceoftheanaerobic，thermophilic，andcellulolyticbacterium〃Anaerocellumthermophilum〃DSM6725.JBacteriol.191(11):3760-1),利用糖基水解酶基因搜索，其基因組中包含88個糖類水解基因（Dam，P.Kataeva，I.Yang，S.J.Zhou，F(xiàn).Yin,Y.Chou,ff.Poole,F.L.,2ndffestpheling,J.Hettich,R.Giannone,R.Lewis,D.L.Kelly,R.Gilbert,H.J.Henrissat,B.Xu,Y.Adams,M.ff.(2011)InsightsintoplantbiomassconversionfromthegenomeoftheanaerobicthermophilicbacteriumCaldicellulosiruptorbesciiDSM6725.NucleicAcidsRes.39(8):3240-54)。其中，包含三個木聚糖基因。目前，這些木聚糖酶還沒有被研究和利用。本發(fā)明涉及其中一個木聚糖酶（GeneID:222454987)基因，即CbXynllA(以下簡稱CbX)。由于原始菌株的最適生長溫度高達75°C，預(yù)測該基因編碼的木聚糖酶可能具有良好的熱穩(wěn)定性。[0005]但是利用野生型菌產(chǎn)酶所要求的培養(yǎng)條件苛刻。另外，野生型菌株產(chǎn)酶水平非常低，是細菌的千分之一以下。此外，野生型菌株所產(chǎn)的酶系復(fù)雜，無法直接應(yīng)用，而且目的酶的純化困難。[0006]天然的木聚糖酶的序列、結(jié)構(gòu)和功能都受到自然進化限制，在工業(yè)途徑中應(yīng)用時常常不是處于最佳的功能狀態(tài)。應(yīng)用蛋白質(zhì)工程技術(shù)對天然基因進行改造，可以突破自然進化的限制，獲得針對工業(yè)用途特定設(shè)計的、具有優(yōu)良性質(zhì)的人工酶基因?！?br/>發(fā)明內(nèi)容】[0007]有鑒于現(xiàn)有技術(shù)的上述缺陷，且又由于在實驗中發(fā)現(xiàn)重組菌中天然的木聚糖酶CbX表達量很低，而且很難純化，本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是如何通過基因工程的方法，將目的酶的基因從嗜熱細菌中克隆得到，并通過適當(dāng)?shù)幕虿僮魇蛊涓咝П磉_，同時又能提高其催化效率與熱穩(wěn)定性。[0008]為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供了一種制備基因工程木聚糖酶的方法，包括以下步驟：[0009]1)構(gòu)建目的蛋白基因；[0010]2)構(gòu)建基因工程菌并高效表達目的蛋白；[0011]3)高效純化目的蛋白。[0012]對于步驟1)，所述目的蛋白基因可以為木聚糖酶CbX的全基因，其序列見序列表SEQIDNO:1，其蛋白序列見序列表SEQIDNO:2。本發(fā)明利用SignalP3.0軟件對目的蛋白的氨基酸序列進行分析，木聚糖酶CbX的N末端存在一段含27個氨基酸的信號肽。信號肽的存在可能影響目的蛋白的表達。為此，應(yīng)用分子生物學(xué)工具在CbX上去除了信號肽基因，重新構(gòu)建了不含信號肽的目的蛋白基因，其基因序列為SEQIDNO:3,蛋白序列為SEQIDN0:4。[0013]進一步地，通過NCBIBlastp對CbX基因全長序列進行分析，得出該蛋白由兩個結(jié)構(gòu)域構(gòu)成，包括N端的催化結(jié)構(gòu)域（CatalyticDomain,⑶）和C端的碳水化合物結(jié)合結(jié)構(gòu)域（CarbohydrateBindingModule,CBM)，兩個結(jié)構(gòu)域由一段柔性的連接肽（Linker)相連。其中，其催化結(jié)構(gòu)域?qū)儆谔擒账饷?1家族（GHll)，碳水化合物結(jié)合結(jié)構(gòu)域?qū)儆贑BM第36家族（CBM36)。但是，僅僅根據(jù)NCBIBlastp的結(jié)果，很難界定⑶的C-末端和CBM的N-末端，即Linker區(qū)域的起始和終止。為此，我們分別搜集收集了大量關(guān)于GHll和CBM36家族的蛋白質(zhì)序列和結(jié)構(gòu)。通過MEGA軟件進行序列比對，利用Pymol軟件進行結(jié)構(gòu)比對分析，最終確定1-200位的區(qū)域為催化結(jié)構(gòu)域CD(編號是從去除信號肽的蛋白的第一個氨基酸開始），201-212的區(qū)域為Linker，213-330的區(qū)域為CBM。通過DiscoveryStudio3.0軟件進行同源建模，得到CbX的結(jié)構(gòu)模型（如圖2所示）。[0014]我們預(yù)測CBM僅影響木聚糖酶與纖維素的結(jié)合能力，對底物特異性、酶活性中心、米氏常數(shù)和可溶性木聚糖的水解能力無明顯影響。而linker的功能還不清楚，但小分子量的酶蛋白分子在反應(yīng)體系中更易于擴散，應(yīng)該具有更強的應(yīng)用優(yōu)勢。所以，本發(fā)明進一步根據(jù)對CbX的基因序列分析結(jié)果構(gòu)建了截去CBM結(jié)構(gòu)域的突變體基因，從而設(shè)計了CbX的兩個截短突變體，分別是CbX-CDL(基因序列為SEQIDN0:5,蛋白序列為SEQIDN0:6)和CbX-CD(基因序列為SEQIDN0:7,蛋白序列為SEQIDN0:8)。[0015]為了進一步提高木聚糖酶的熱穩(wěn)定性，可以在木聚糖酶C末端引入相互作用，如氫鍵、離子鍵、二硫鍵等。本發(fā)明在CbX-CD的基礎(chǔ)上，利用Disulfidebydesign軟件，對CbX-CD的結(jié)構(gòu)模型進行計算分析，篩選出兩處可以引入二硫鍵的合理位置分別在CbX-CD中引入二硫鍵，構(gòu)建了突變體CbX-⑶Sl(基因序列為SEQIDN0:9,蛋白序列為SEQIDNO:10)和CbX-CDS2(基因序列為SEQIDNO.11，蛋白序列為SEQIDNO:12)。[0016]對于步驟2)，重組基因的載體優(yōu)選為質(zhì)粒pET28a，構(gòu)建的重組質(zhì)粒pET28a-CbXynllA的結(jié)構(gòu)如圖1所示，除此以外也可以將木聚糖酶基因整合在宿主細胞基因組上進行表達。[0017]以上述各天然或重組基因構(gòu)建基因工程菌，使各基因可以在宿主菌中高效表達，所述宿主菌可以為大腸桿菌、酵母菌、芽孢桿菌、絲狀真菌等，優(yōu)選為大腸桿菌。在此基礎(chǔ)上，通過在重組目的蛋白（包括去除信號肽的CbX及其截短突變體和含二硫鍵的截短突變體）的N端引入His-tag，不僅可以保護目的蛋白的N-末端，使得目的蛋白的表達量提高2倍，而且還有利于后續(xù)純化。[0018]對于步驟3)，具體方法為將發(fā)酵后收獲的宿主菌菌體懸液超聲破碎后，放置于55-65°C熱處理20-30分鐘，沉淀大量雜蛋白，此時CbX的純度已達到80%以上，再經(jīng)過一步Ni-NTA親和層析處理后就能得到95%以上純度的目的蛋白。[0019]在本發(fā)明的實施例中，將CbX及其兩個截短突變體CbX-⑶L和CbX-⑶以及含二硫鍵的截短突變體CbX-⑶Sl和CbX-⑶S2的熱穩(wěn)定性進行比較（結(jié)果如表1所示）。包括T_(最適反應(yīng)溫度）、t1/2(-定溫度下，蛋白質(zhì)活性損失一半時所需要的時間）、T5(I(-定時間內(nèi)，蛋白質(zhì)活性損失一半時所需要的溫度）等動力學(xué)穩(wěn)定性參數(shù)以及通過差示熱量掃描儀（differentialscanningcalorimetry,DSC)測定的蛋白質(zhì)解折疊50%時的溫度（Tm)這一熱動力學(xué)穩(wěn)定性參數(shù)。[0020]最適溫度比較：CbX為75?77°C;CbX-CDL為82?85°C;CbX-CDSl和CbX-CDS2為80?82°C;CbX-CD為77?80°C。與CbX比較，CbX-CD的最適溫度有一定的提高，CbX-CDL，CbX-CDSl和CbX-CDS2的最適溫度明顯提高。[0021]從圖7的70°C時的熱穩(wěn)定性可以看出，CbX-⑶L和CbX-⑶的熱穩(wěn)定性明顯高于CbX。CbX保溫2h只剩50%左右的活力；CbX-⑶保溫24h后還具有80%左右的活力；CbX-CDL的穩(wěn)定性最好，保溫24h后還有高于85%的活力；CbX-CDSl和CbX-CDS2的熱穩(wěn)定性與CbX-⑶L相當(dāng)，相對于CbX-⑶有一定的提高。[0022]T5Q(3Q)的比較結(jié)果顯示，CbX為?82°C;CbX-CDL為89.3°C;CbX-CD為88.7°C;CbX-CDSl和CbX-CDS2的T5Q(XI)均為90°C左右，都高于CbX大約8°C。[0023]該結(jié)果與DSC所檢測的Tm結(jié)果一致（圖8)，CbX有兩個結(jié)構(gòu)域，故Tml=91.56°C，Im2=74.16°C;CbX-CDL為92.88°C;CbX-CD為93.18°C;CbX-CDSl和CbX-CDS2的Im相對于CbX-CD提高了(λ5-1°C。[0024]由于CbX，CbX-CDL，CbX-CD，CbX-CDSl和CbX-CDS2分子量存在差異，將比活力定義為每μmol木聚糖酶所含的酶活力（U/μmol)。表1的數(shù)據(jù)顯示，CbX-⑶L的比活力最高，高于CbX-CD，說明linker的存在有助于提高酶的活力，推測因為CbX-⑶L的最適溫度和熱穩(wěn)定性的提高。CbX比活力反而最低，可能CBM的存在不利于酶的催化水解。CbX-⑶Sl和CbX-⑶S2相對于CbX-⑶活力略有提高，二硫鍵的引入并沒有破壞CbX-⑶原有的催化活性。從CbX，CbX-CDL，CbX-CD，CbX-CDSl和CbX-CDS2的比較可以看出，C末端對酶的熱穩(wěn)定性有較大影響，穩(wěn)定該區(qū)域可能提高酶的熱穩(wěn)定性。[0025]通過以上技術(shù)方案的實現(xiàn)，本發(fā)明具有以下優(yōu)點：[0026](1)在極端嗜熱菌中獲得新型內(nèi)切木聚糖酶，比常規(guī)的中溫菌中獲得的內(nèi)切木聚糖酶具有更強的熱穩(wěn)定性與高溫催化活性。[0027](2)通過對編碼木聚糖酶的基因片段去除信號肽和引入N末端組氨酸尾，可以在異源宿主細胞如大腸桿菌內(nèi)進行木聚糖酶基因的高效表達。[0028](3)目的蛋白木聚糖酶的表達水平高，且純化方便。[0029](4)構(gòu)建的木聚糖酶蛋白突變體的分子量更小，熱穩(wěn)定性提高，比活力也大大提商。[0030]以上優(yōu)點使得木聚糖酶及其截短突變體更有潛力應(yīng)用于食品、造紙、飼料等行業(yè)的工業(yè)生產(chǎn)中。[0031]以下將結(jié)合附圖對本發(fā)明的構(gòu)思、【具體實施方式】及產(chǎn)生的技術(shù)效果作進一步說明，以充分地了解本發(fā)明的目的、特征和效果?！緦＠綀D】【附圖說明】[0032]圖1是重組質(zhì)粒pET28a_CbXynllA的構(gòu)建圖；[0033]圖2是CbX的結(jié)構(gòu)模型；[0034]圖3是CbX的酶學(xué)性質(zhì)表征：最適溫度曲線；[0035]圖4是CbX的酶學(xué)性質(zhì)表征：熱穩(wěn)定性曲線；[0036]圖5是CbX的酶學(xué)性質(zhì)表征：最適pH曲線；[0037]圖6是CbX的酶學(xué)性質(zhì)表征：pH穩(wěn)定性散點圖；[0038]圖7是CbX及其截短突變體和含二硫鍵的截短突變體的70°C熱穩(wěn)定性比較圖；[0039]圖8是CbX及其截短突變體和含二硫鍵的截短突變體的DSC曲線比較圖?！揪唧w實施方式】[0040]以下結(jié)合具體實施例，對本發(fā)明進行進一步闡述。[0041]實施例1、C.besciiDSM6725菌株的培養(yǎng)和保存[0042]按照DSMZ的配方，配置厭氧培養(yǎng)基（anaerocellummedium)，分裝于厭氧試管中，每管5ml，培養(yǎng)基封閉后用真空泵將試管中的空氣抽干，并充入一定量的氮氣和二氧化碳的混合氣體（80%N2和20%CO2),在厭氧箱中用培養(yǎng)基Iml溶解購買于DSMZ的CaldicellulosiruptorbesciiDSM6725,按照1%的接菌量接種于5ml試管中，混勻，75°C靜置培養(yǎng)數(shù)天，直至細菌開始生長起來。然后轉(zhuǎn)移至裝有IOOml培養(yǎng)基的錐形瓶中75°C培養(yǎng)數(shù)天，-80°C保存菌體。[0043]實施例2、基因組DNA的提取[0044]取5ml小試管培養(yǎng)的C.besciiDSM6725,用北京普博欣生物技術(shù)有限責(zé)任公司的細菌基因組DNA小量提取試劑盒（BacteriaGenomicMiniPreparationKit)提取細菌的基因組，所得基因組DNA溶液放4°C冰箱備用。[0045]實施例3、目的基因的克隆[0046]以GenBank報道的C.besciiDSM6725CbX(GeneID:222454987)基因序列（即SEQIDNO:1)為模板，用PrimerPremier5.0設(shè)計兩條特異性引物，通過PCR技術(shù)獲得目的基因。引物如下：[0047]Pl:5'-TGCGCCATGGATATGAGGTTTAAAAAGT-3'(下劃線標(biāo)注的為NcoI的酶切位點）[0048]P2:5'-AGCGTGAAGCTTTCATTGTATTAACAAAT-3'(下劃線標(biāo)注的為HindIII的酶切位點）[0049]將目的基因與載體進行NcoI和HindIII雙酶切處理，體系如下：[0050]【權(quán)利要求】1.一種基因工程木聚糖酶，其特征在于，其基因序列為SEQIDN0:3,蛋白序列為SEQIDN0:4。2.-種基因工程木聚糖酶，其特征在于，其是CbX酶截去了C端的碳水化合物結(jié)合結(jié)構(gòu)域之后的突變體。3.如權(quán)利要求2所述的基因工程木聚糖酶，其特征在于，其基因序列為SEQIDNO:5，蛋白序列為SEQIDN0:6;或基因序列為SEQIDN0:7,蛋白序列為SEQIDN0:8。4.一種基因工程木聚糖酶，其特征在于，其是CbX酶截去了C端的碳水化合物結(jié)合結(jié)構(gòu)域之后，又在C末端引入相互作用的突變體。5.如權(quán)利要求4所述的基因工程木聚糖酶，其特征在于，所述引入的相互作用為二硫鍵。6.如權(quán)利要求5所述的基因工程木聚糖酶，其特征在于，其基因序列為SEQIDN0:9，蛋白序列為SEQIDNO:10;或基因序列為SEQIDNO:11，蛋白序列為SEQIDNO:12。7.-種制備基因工程木聚糖酶的方法，其特征在于，包括以下步驟：1)構(gòu)建目的蛋白基因；2)構(gòu)建基因工程菌并表達目的蛋白；3)純化目的蛋白；其中，步驟1)中的目的蛋白基因為SEQIDNO:1、SEQIDN0:3、SEQIDN0:5、SEQIDN0:7、SEQIDN0:9或SEQIDN0:11。8.如權(quán)利要求7所述的方法，其特征在于，步驟2)在構(gòu)建基因工程菌時，在重組目的蛋白的N端引入His-tag。9.如權(quán)利要求7所述的方法，其特征在于，步驟3)的具體方法為將發(fā)酵后收獲的宿主菌菌體懸液超聲破碎后，放置于55-65°C熱處理20-30分鐘，沉淀大量雜蛋白，再經(jīng)過一步Ni-NTA親和層析處理后得到目的蛋白。10.如權(quán)利要求1-6所述的基因工程木聚糖酶在工業(yè)生產(chǎn)中的應(yīng)用?！疚臋n編號】C12N9/42GK104313000SQ201410534600【公開日】2015年1月28日申請日期:2014年10月11日優(yōu)先權(quán)日:2014年10月11日【發(fā)明者】楊廣宇,馮雁,安嬌,于瑤,王慧楠,張少博申請人:上海交通大學(xué)