一種糖基轉(zhuǎn)移酶及其突變體在合成人參皂苷Rh2中的應用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種糖基轉(zhuǎn)移酶，可以催化原人參二醇糖基化合成稀有人參皂苷Rh2。對于該糖基轉(zhuǎn)移酶進行了改造，得到了其催化效率優(yōu)化的多個突變體。這些突變體用于體外酶法合成稀有人參皂苷Rh2的產(chǎn)率比野生型有明顯提高。并且該糖基轉(zhuǎn)移酶及其突變體可以用于微生物體內(nèi)全合成稀有人參皂苷Rh2。
【專利說明】-種糖基轉(zhuǎn)移酶及其突變體在合成人參皂音Rh2中的應用

【技術領域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物制藥【技術領域】，涉及一種糖基轉(zhuǎn)移酶及其突變體，尤其涉及一種 糖基轉(zhuǎn)移酶及其突變體在轉(zhuǎn)糖基化合成稀有人參皂巧化2中的應用。

【背景技術】
[0002] 人參皂巧作為人參的主要藥用活性物質(zhì)，是一種H聰皂巧，屬于固醇類化合物。具 有血管舒張、抗氧化、抗炎及抗腫瘤等功效。人參皂巧的結(jié)構因糖基側(cè)鏈不同，顯示出的性 質(zhì)和功能也有較大差異。其中研究最多且與腫瘤細胞調(diào)亡相關的有化2與Rg3,它們具有較 高的抗腫瘤活性，且對正常細胞無毒副作用，該類化合物的相關產(chǎn)品已在臨床廣泛使用。因 此，獲得大量、高純度的人參皂巧成為現(xiàn)代藥學的研究熱點。
[0003] 目前，人參皂巧主要從栽培人參中提取，國內(nèi)對從藥用人參原料中提取人參總皂 巧及單體皂巧進行了大量的研究，人參皂巧的提取方法有：水提取法，有機溶劑提取法，蒸 觸法，超聲浸潰法及超臨界C〇2萃取法等。由于人參生長周期長，且提取人參皂巧的工藝流 程復雜，因此生產(chǎn)成本較高。此外人參皂巧化2屬于稀有人參皂巧，在人參中的含量極低， 提取產(chǎn)量受限，主要是通過對提取的總皂巧進行酶法轉(zhuǎn)化，提高其中高藥用活性的稀有人 參皂巧的含量，再經(jīng)過一系列分離純化過程獲得化2單體皂巧，但是仍然受限于人參藥材 載體及其中的皂巧含量。生產(chǎn)工藝復雜，產(chǎn)量低，成本較高，難W實現(xiàn)大規(guī)模生產(chǎn)稀有人參 皂巧的要求。
[0004] 近年來，合成生物學滲透到了天然產(chǎn)物開發(fā)的各個環(huán)節(jié)中，尤其為天然產(chǎn)物的制 造開辟了一條新的有效途徑。例如，Keasling實驗室利用酵母在體內(nèi)合成青嵩素前體青嵩 酸，通過對代謝途徑不斷改造與優(yōu)化使青嵩酸的產(chǎn)量實現(xiàn)了若干數(shù)量級的提高，最終青嵩 酸達到 25g/L 的產(chǎn)量（化Uire, 2006, 440:940-943 ;化Uire, 2013, 496:528-532) !Gregory 研究組利用大腸桿菌首次合成了紫杉醇的前體紫杉二帰（Science, 2010, 330:70-74)。 在微生物中重建藥用次生代謝物的生物合成途徑制備高附加值產(chǎn)品顯示出良好的應 用前景。此外，張學禮研究組在釀酒酵母中構建了人參二醇型皂巧巧元的生物合成 途徑，通過代謝工程及發(fā)酵工程優(yōu)化，原人參二醇的產(chǎn)量達到Ig/L W上（Met油Olic Engineering, 2013, 20:146-156)，該為體外酶法合成或微生物體內(nèi)全合成稀有人參皂巧 奠定了基礎。然而與人參皂巧合成相關的糖基轉(zhuǎn)移酶基因報道較少，糖基轉(zhuǎn)移酶是生物 界廣泛存在的多基因家族蛋白，只在少數(shù)植物中被克隆，通過酶活性方法進行鑒定的則更 少，其中參與H聰皂巧的糖基轉(zhuǎn)移酶僅在裝黎首薦、王不留行等植物中進行了研究。近期， 周志華課題組鑒定了人參中催化原人參二醇合成人參皂巧CK的糖基轉(zhuǎn)移酶基因（Cell Research, 2014:1-4)。目前仍然沒有與稀有人參皂巧化2合成相關的糖基轉(zhuǎn)移酶基因的報 道。
[0005] 糖基轉(zhuǎn)移酶基因的缺乏使得稀有人參皂巧化2的異源合成難W實現(xiàn)，因此糖基轉(zhuǎn) 移酶基因的挖掘顯得尤為重要。隨著測序技術的不斷進步，基因數(shù)據(jù)庫資源不斷膨脹，該為 功能酶基因的篩選奠定了良好的基礎。
[0006] 因此，從豐富的基因庫中篩選潛在的可催化原人參二醇糖基化合成稀有人參皂巧 化2的功能基因是獲得相關糖基轉(zhuǎn)移酶基因的有效途徑之一。
[0007] 通過W原人參二醇為底物在體外酶法轉(zhuǎn)化合成或微生物體內(nèi)全合成的方法，可提 高人參皂巧化2的產(chǎn)量。然而該兩種方法都需要獲得可催化原人參二醇合成稀有人參皂巧 化2的糖基轉(zhuǎn)移酶基因，至今仍沒有此功能基因的報道。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0008] 有鑒于現(xiàn)有技術的上述缺陷，本發(fā)明所要解決的技術問題是開發(fā)一種有效的糖基 轉(zhuǎn)移酶，用于體外酶法轉(zhuǎn)化及微生物體內(nèi)全合成法合成稀有人參皂巧化2。
[0009] 為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供了一種糖基轉(zhuǎn)移酶及其突變體，并利用改良的糖基 轉(zhuǎn)移酶實現(xiàn)了人參皂巧化2的體外酶法和微生物體內(nèi)全合成。
[0010] 本發(fā)明人借助基于化合物、化學反應的檢索工具Rxnfinder,結(jié)合PIR、NCBI等數(shù) 據(jù)庫資源，基于底物相似性及催化反應類型等原則，篩選了一些可能催化原人參二醇3位 輕基糖基化反應的糖基轉(zhuǎn)移酶基因。將篩選的基因在大腸桿菌表達系統(tǒng)中進行功能表達， 獲得重組蛋白的粗酶液。經(jīng)實驗證明，其中來源于釀酒酵母Saccharomyces cerevisiae S288C的UGT51糖基轉(zhuǎn)移酶可催化原人參二醇的糖基化反應。獲得的糖基化產(chǎn)物單一，優(yōu)化 后對底物原人參二醇的轉(zhuǎn)化率為61%。
[0011] 第一方面，本發(fā)明提供了一種轉(zhuǎn)糖基合成稀有人參皂巧化2的糖基轉(zhuǎn)移酶及其編 碼的基因，該基因為來源于釀酒酵母Saccharomyces cerevisiae S288c的糖基轉(zhuǎn)移酶基因 UGT51，將該糖基轉(zhuǎn)移酶命名為UGT51蛋白。所述蛋白的基因序列為SEQ N0:1，氨基酸序列 為SEQ N0:2;所述蛋白去除N末端膜結(jié)合區(qū)后獲得的蛋白的基因序列為SEQ N0:3,氨基酸 序列為SEQ NO:4。
[0012] 進一步地，上述糖基轉(zhuǎn)移酶也可W是經(jīng)過取代、缺失或添加一個或多個氨基酸且 與SEQ N0:2或SEQ N0:4所示蛋白具有相同功能的衍生蛋白。
[0013] 第二方面，本發(fā)明提供了 UGT51糖基轉(zhuǎn)移酶的突變體，所述突變體是通過用另一 種氨基酸殘基取代野生型UGT51糖基轉(zhuǎn)移酶的一個或多個位置上的氨基酸殘基而獲得的 糖基轉(zhuǎn)移酶突變體；優(yōu)選的取代位置為由SEQ N0:2表示的UGT51糖基轉(zhuǎn)移酶氨基酸序列的 第801、802、804、812、815、816、849、888、892位或它們的相應位置，突變體催化原人參二醇 糖基化合成人參皂巧化2的活性比野生型顯著提高。
[0014] 進一步地，所述的糖基轉(zhuǎn)移酶突變體是通過用另一種氨基酸殘基取代與野生型 UGT51糖基轉(zhuǎn)移酶表現(xiàn)出至少90%同源性的氨基酸序列的糖基轉(zhuǎn)移酶的一個或多個位置 上的氨基酸殘基而獲得的糖基轉(zhuǎn)移酶突變體；優(yōu)選的取代位置為由SEQ NO: 2表示的UGT51 糖基轉(zhuǎn)移酶氨基酸序列的第801、802、804、812、815、816、849、888、892位或它們的相應位 置，突變體催化原人參二醇糖基化合成人參皂巧化2的活性比野生型顯著提高。
[0015] 更進一步地，用于取代原有氨基酸殘基的所述另一種氨基酸殘基優(yōu)選為丙氨酸 (氨基酸縮寫名稱為A)或額氨酸（氨基酸縮寫名稱為V)。
[0016] 在該糖基轉(zhuǎn)移酶的突變點對應的編碼的核巧酸編碼，應理解為本發(fā)明所述的"另 一種氨基酸殘基"所編碼的核巧酸編碼。
[0017] 具體地，本發(fā)明還提供了一些優(yōu)選的糖基轉(zhuǎn)移酶突變體及其編碼的基因，它們的 出發(fā)糖基轉(zhuǎn)移酶的基因序列為序列表中的SEQ NO: 1，出發(fā)氨基酸序列為序列表中的SEQ NO: 2。它們分別是第801位絲氨酸被丙氨酸取代的突變體，第802位亮氨酸被丙氨酸取代的 突變體，第804位額氨酸被丙氨酸取代的突變體，第812位賴氨酸被丙氨酸取代的突變體， 第815位精氨酸被丙氨酸取代的突變體，第816位谷氨酸被丙氨酸取代的突變體，第849位 絲氨酸被丙氨酸取代的突變體，第849位絲氨酸被額氨酸取代的突變體，第888位賴氨酸被 丙氨酸取代的突變體，第892位天冬醜胺被丙氨酸取代的突變體。在序列表中的SEQ N0:4 表示的氨基酸序列的對應位置取代的突變體也包含在內(nèi)。
[0018] 第H方面，本發(fā)明還進一步提供了包含編碼上述糖基轉(zhuǎn)移酶或其突變體基因的重 組載體，W及包含所述重組載體的轉(zhuǎn)化體（例如本發(fā)明所述的微生物）。
[0019] 本發(fā)明所述的重組載體，應理解為現(xiàn)有技術中任意的基因的重組載體，例如各種 質(zhì)粒，即將糖基轉(zhuǎn)移酶突變體的突變基因?qū)肽苁乖撎腔D(zhuǎn)移酶突變體穩(wěn)定表達的DNA載 體質(zhì)粒。
[0020] 而所述的重組載體的轉(zhuǎn)化體，即指重組載體的宿主細胞，例如，本發(fā)明實施例4所 述的微生物E. COli化21的宿主細胞；當然，現(xiàn)有技術常用的宿主細胞的微生物包括革蘭 氏陽性細菌如枯草芽抱桿菌，革蘭氏陰性細菌如大腸桿菌，放線菌如鏈霉菌，酵母如釀酒酵 母，真菌如曲霉菌，它們的細胞均是常用的重組載體的宿主細胞。
[0021] 第四方面，本發(fā)明提供了一種使用糖基轉(zhuǎn)移酶轉(zhuǎn)糖基化體外合成人參皂巧化2的 方法，該方法W原人參二醇和糖基供體UDPG為原料，在糖基轉(zhuǎn)移酶的催化作用下，原人參 二醇的3位輕基發(fā)生糖基化反應，生成稀有人參皂巧化2。
[0022] 優(yōu)選地，所述糖基轉(zhuǎn)移酶為UGT51糖基轉(zhuǎn)移酶或去除N末端膜結(jié)合區(qū)后獲得的糖 基轉(zhuǎn)移酶，或上述第二方面所提供的糖基轉(zhuǎn)移酶突變體。在相同條件下，UGT51糖基轉(zhuǎn)移酶 突變體催化原人參二醇糖基化合成人參皂巧化2的效率比野生型提高35% -50%。
[002引優(yōu)選地，所述糖基供體與原人參二醇的比例為1:1?10:1 (w/w)。
[0024] 優(yōu)選地，所述糖基供體的濃度為0. 5?lOg/l，所述原人參二醇的濃度為0. Ol? Ig/Lo
[0025] 作為本發(fā)明的進一步改進，所述的原人參二醇溶解在非水相中。
[0026] 優(yōu)選地，所述非水相為親水性有機溶劑，所述親水性有機溶劑選自甲醇、二甲基亞 諷（DMSO)、二甲基甲醜胺（DM巧、己二醇二甲離（DME)中的任意一種。
[0027] 優(yōu)選地，所述原人參二醇溶解在所述親水性有機溶劑中后，加入反應體系中的親 水性有機溶劑的最終濃度為5%?20% (v/v)。
[0028] 第五方面，本發(fā)明還提供了一種應用UGT51基因及其突變基因在微生物體內(nèi)合成 人參皂巧化2的方法。該方法W可生產(chǎn)原人參二醇的工程菌為基礎，導入糖基轉(zhuǎn)移酶編碼 基因UGT51或其突變基因的表達盒，得到重組菌。發(fā)酵培養(yǎng)獲得目標產(chǎn)物人參皂巧化2。
[0029] 所述糖基轉(zhuǎn)移酶編碼基因UGT51的表達盒進一步具體包括啟動子PGK1、糖基轉(zhuǎn)移 酶編碼基因UGT51和終止子A的11。
[0030] 所述糖基轉(zhuǎn)移酶編碼基因UGT51突變基因的表達盒進一步具體包括啟動子PGK1、 糖基轉(zhuǎn)移酶編碼基因UGT51突變基因和終止子ADHl。
[0031] 所述微生物，例如，本發(fā)明實施例5所述的釀酒酵母細胞；當然，現(xiàn)有技術常用微 生物生產(chǎn)菌株包括革蘭氏陽性細菌如枯草芽抱桿菌，革蘭氏陰性細菌如大腸桿菌，放線菌 如鏈霉菌，酵母如釀酒酵母，真菌如曲霉菌，它們的細胞均是常用的生產(chǎn)菌株。
[0032] 通過W上技術方案的實現(xiàn)，本發(fā)明達到了如下技術效果：
[0033] 1、利用本發(fā)明所述的糖基轉(zhuǎn)移酶蛋白在體外酶法合成人參皂巧化2,對底物原人 參二醇的轉(zhuǎn)化率可達61% ;其突變體在相同條件下，催化原人參二醇糖基化合成人參皂巧 化2的效率比野生型提高35% -50% ;
[0034] 2、利用本發(fā)明所述的糖基轉(zhuǎn)移酶蛋白及其突變體成功地實現(xiàn)了在微生物體內(nèi)全 合成人參皂巧化2。
[0035] 3、本發(fā)明獲得的UGT51糖基轉(zhuǎn)移酶及其突變體可W用于體外酶法轉(zhuǎn)化合成及微 生物體內(nèi)全合成制備稀有人參皂巧化2,是區(qū)別于現(xiàn)有生產(chǎn)技術的一種新的生產(chǎn)方法，生產(chǎn) 過程簡化、消耗低、產(chǎn)出高。
[0036] W下將結(jié)合附圖對本發(fā)明的構思、【具體實施方式】及產(chǎn)生的技術效果作進一步說 明，W充分地了解本發(fā)明的目的、特征和效果。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0037] 圖1是UGT51糖基轉(zhuǎn)移酶體外催化原人參二醇轉(zhuǎn)糖基反應的TLC圖；
[003引圖2是原人參二醇糖基化產(chǎn)物的質(zhì)譜（M巧譜圖；
[0039] 圖3是原人參二醇糖基化產(chǎn)物的核磁共振Ih-NMR譜圖；
[0040] 圖4是原人參二醇糖基化產(chǎn)物的核磁共振"C-NMR譜圖；
[0041] 圖5是原人參二醇的HPLC譜圖；
[0042] 圖6是原人參二醇及其糖基化產(chǎn)物的HPLC譜圖。

【具體實施方式】
[0043] 下面結(jié)合具體的實施例，并參照數(shù)據(jù)進一步詳細描述本發(fā)明。應理解，該些實施例 只是為了舉例說明本發(fā)明，而非W任何方式限制發(fā)明的范圍。
[0044] 本發(fā)明所述的生物材料的來源的一般性說明：
[0045] 1、引物合成；本發(fā)明中所使用的引物均由南京金斯瑞公司合成制備。
[0046] 2、實驗中所使用的Q5化曲-Fidelity DNA聚合酶及T4 DNA連接酶等購自于 NewEngland Biol油S公司；PrimeSTAR服高保真酶購自化kaRa公司；限制性內(nèi)切酶均購自 于化rmentas公司；使用的DNA膠回收試劑盒及質(zhì)粒小提試劑盒均購自于Axygen公司。
[0047] 實施例1轉(zhuǎn)糖基化原人參二醇合成人參皂巧化2的糖基轉(zhuǎn)移酶的篩選
[0048] 借助基于化合物、化學反應的檢索工具Rxnfinder,結(jié)合PIR、NCBI等數(shù)據(jù)庫資源， 基于底物相似性及催化反應類型等原則，篩選了一些可能催化原人參二醇糖基化的糖基轉(zhuǎn) 移酶基因，分別是來源于釀酒酵母的UGT51，來源于抗生鏈霉菌的OleD W及來源于馬鈴墓 的SGT2。其中來源于釀酒酵母的UGT51克隆獲得，來源于抗生鏈霉菌的OleD及來源于馬 鈴墓的SGT2全基因合成獲得。OleD、SGT2基因ORF全長W Ndel、化Ol酶切位點克隆至 pET28a(+)質(zhì)粒。
[0049] 使用真菌基因組提取試劑盒提取釀酒酵母Saccharomyces cerevisiae S288c 的基因組，使用引物UGT51-F和UGT51-R進行PCR擴增。擴增體系為；Q5 Reaction BuffeH5X)10yL、dNTP(2. 5mM)4yL、基因組模板 0. 5uL、引物（IOyM)各 2. 5uL、Q5 化曲-FidelityDNA聚合酶0. 5 y L、補充雙蒸水至50 y L。擴增條件為98°C預變性30砂； 98 C變性10砂、55 C退火10砂、72 C延伸2分鐘（30個循環(huán)）；72 C延伸2分鐘。
[0050] UGT51-F ：ATGCCCATCACTCAAATCATAT
[0051] UGT51-R ：TTAAATCATCGTCCACCCTTC
[0052] 將PCR擴增產(chǎn)物克隆到祀ASY-Blunt克隆載體（北京全式金生物技術有限公 司）上?？寺◇w系為；PCR產(chǎn)物1 U L、pEASY-Blunt載體1 y L，混勻后室溫反應10分鐘， 熱休克轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5 a感受態(tài)細胞，涂布于含有氨予青霉素的LB平板上，過夜培養(yǎng) 后篩選陽性克隆，測序驗證。測序結(jié)果表明在祀ASY-Blunt載體上插入了正確的目的基 因UGT51 (3597bp)，核巧酸序列為序列表中SEQ ID N0:1，氨基酸序列為序列表中SEQ ID N0:2。
[0053] 設計表達引物時去除蛋白N末端膜結(jié)合區(qū)（1-721個氨基酸），引物如下：
[0054] UGT51-F2: CAAGCATATGTTAATGATTGATGAGAATCCGC (帶 NdeI 酶切位點）
[00 巧]UGT51-R2: CTAGCTCGAGTTAAATCATCGTCCACCCTTCA (帶化〇1 酶切位點）
[0056] 使用Q5 Hi曲-Fidelity DNA聚合酶進行PCR擴增。擴增體系為；Q5 Reaction Buffer 巧 X) 10 y L、dNTP (2. 5mM) 4 y L、基因組模板 0. 5 y L、引物（10 y M)各 2. 5 y L、 Q5Hi曲-Fidelity DNA聚合酶0. 5 y L、補充雙蒸水至50 y L。擴增條件為98°C預變性30砂； 98 C變性10砂、55 C退火10砂、72 C延伸1分鐘（30個循環(huán)）；72 C延伸2分鐘。
[0057] PCR產(chǎn)物和祀T28a(+)質(zhì)粒分別進行限制性內(nèi)切酶Ndel、化Ol雙酶切反應后，用 DNA膠回收試劑盒回收酶切產(chǎn)物，在T4 DNA連接酶的作用下進行連接反應，連接產(chǎn)物熱休 克轉(zhuǎn)化至大腸桿菌D冊a感受態(tài)細胞，涂布到LB瓊脂平板（含有50 y g/mL卡那霉素），過 夜培養(yǎng)后篩選陽性克隆，測序驗證。測序結(jié)果表明在pET28a(+)載體上正確地插入了目的 基因片段。核巧酸序列為序列表中SEQ ID N0:3,氨基酸序列為序列表中SEQ ID N0:4。
[0058] 篩選基因的重組表達質(zhì)粒熱休克轉(zhuǎn)化至大腸桿菌化21感受態(tài)細胞，進行基因表 達。培養(yǎng)重組菌至OD為0. 6-0. 8時，添加0. 4mM IPTG，在低溫16°C誘導表達16h。4°C， 600化pm離也收集細胞，將細胞重息于破碎緩沖液中，破碎緩沖液組成；含5mMDTT的 Tris-HCl緩沖液巧OmM,pH7. 5)。IL的培養(yǎng)細胞最終重息于100血的破碎緩沖液中。超聲 破碎后，4°C，14000rpm離也，收集上清即獲得粗酶液。
[0059] 誘導表達獲得的重組蛋白粗酶液直接用于體外活性檢測，如下配制反應溶液，總 體積為100 y L ;2mM鳥巧二磯酸葡萄糖（UDPG)、ImM原人參二醇、IOmM氯化鎮(zhèn)（MgCg、20mM Tris-肥1抑7. 5,加入70% (v/v)粗酶液。30°C，180巧m反應12小時。添加同體積的正 下醇終止反應，取上層有機相進行TLC分析。TLC展開劑為氯仿：甲醇=85:15,顯色劑為： 2.5% (w/v)四水合鋼酸饋，1% (w/v)硫酸鋪饋，10% (v/v)硫酸的水溶液。在IlOC加熱 5分鐘顯色。其中只有來源于釀酒酵母的UGT51蛋白可W催化原人參二醇底物生成一個新 的化合物，結(jié)果如圖1所示，其中空白對照的反應體系中未添加UDPG糖基供體。
[0060] 進一步對反應體系進行LC-MS分析，儀器為HPLC 1290-MS 6230 (Agilent)。使 用Agilent公司的C18柱（型號；XDB-C18,4. 6 X 150mm，5 y m)，流動相使用梯度洗脫： 0-20min，45-100 % 己膳；20-25min，100 % 己膳；25-28min，45 % 己膳。柱溫 40°C，流速： 0.4 mL/min?；衔锸褂谜x子模式離子化，離子化方式為電噴霧巧SI)。產(chǎn)物的質(zhì)譜圖 如圖2所示，根據(jù)分子量判斷，該化合物為原人參二醇的單糖基化產(chǎn)物，產(chǎn)物HR-MS ;m/z 623. 4517 [M+田+，元素組成為Cs品208, M+H計算值為623. 4517。
[0061] 實施例2糖基化產(chǎn)物的分離純化及結(jié)構鑒定
[0062] 按實施例1中的比例配制IOOmL的反應液。在3(TC條件下，反應48小時。加入同 體積正下醇終止反應。取上層有機相旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)干燥，用娃膠柱純化，洗脫劑為氯仿：甲醇= 85:15,每5mL等份收集，收集的樣品進行TLC分析（條件同前所述），獲得原人參二醇糖基 化產(chǎn)物部分，純度<90%。
[0063] 進一步利用S巧-Pak tC18柱（Waters)對上述收集部分進行純化，水（A)和己膳 炬）作為洗脫劑，采用梯度洗脫（20% B、40% B、50% B、60% B、65% B、70% B、75% B、80% B、85%B、90%B、100%B)，在70%及75%己膳洗脫時，獲得原人參二醇糖基化產(chǎn)物部分，純 度達到98 %。于4(TC旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)或冷凍干燥得白色粉末，產(chǎn)物進行核磁共振波譜結(jié)構分析及 驗證。產(chǎn)物的H譜及C譜的結(jié)果（圖3、圖4)與文獻報道的人參皂巧化2的圖譜一致，證實 反應產(chǎn)物為人參皂巧化2。
[0064] 實施例3 UGT糖基轉(zhuǎn)移酶野生型體外酶法轉(zhuǎn)化合成人參皂巧化2 [00巧]方案一
[0066] 按照實施例1得到UGT51糖基轉(zhuǎn)移酶粗酶液。
[0067] W二甲基亞諷（DMSO)、原人參二醇、尿巧二磯酸葡萄糖（UDPG)、Tris-HCl緩沖配 制反應溶液，反應溶液中有機溶劑DMSO的比例為10% (v/v)，原人參二醇0. 5g/L，Tris-肥1 緩沖的摩爾濃度為50mmol/L，抑為7. 5，UDPG與原人參二醇之比為10:l(w/w)。按70% (v/ V)比例添加UGT51糖基轉(zhuǎn)移酶粗酶液于反應液中，3(TC，18化pm,反應48小時。
[0068] 添加同體積正下醇終止反應，萃取的有機相真空干燥后加甲醇溶解，進行HPLC檢 測分析與定量，結(jié)果如圖5和圖6所示，圖5為原人參二醇的HPLC譜圖（反應體系中未添加 UDPG糖基供體），圖6為反應體系的分析結(jié)果。使用Agilent公司的C18柱（型號；XDB-C18， 4.6X150mm，5ym)，流動相使用梯度洗脫；0-14min，45-100%己膳；14-18min，100%己膳； 18-20111111，45%己膳。柱溫401：，流速；1血/111111，檢測波長203皿。
[0069] HPLC鑒定獲知原人參二醇糖基化反應的轉(zhuǎn)化率為61 %。
[0070] 方案二
[0071] 按照實施例1得到UGT51糖基轉(zhuǎn)移酶粗酶液。
[0072] W二甲基亞諷（DMSO)、原人參二醇、尿巧二磯酸葡萄糖（UDPG)、Tris-HCl緩沖配 制反應溶液，反應溶液中有機溶劑DMSO的比例為5% (v/v)，原人參二醇0. 5g/L，Tris-HCl 緩沖的摩爾濃度為50mmol/L，抑為7. 5，UDPG與原人參二醇之比為5:1 (w/w)。按70% (v/ V)比例添加UGT51糖基轉(zhuǎn)移酶粗酶液于反應液中，3(TC，180巧m，反應48小時。
[0073] 添加同體積正下醇終止反應，萃取的有機相真空干燥后加甲醇溶解，進行HPLC 檢測分析與定量。檢測方法同方案一，HPLC鑒定獲知原人參二醇糖基化反應的轉(zhuǎn)化率為 53%。
[0074] 方案 H
[00巧]按照實施例1得到UGT51糖基轉(zhuǎn)移酶粗酶液。
[0076] W二甲基亞諷（DMSO)、原人參二醇、尿巧二磯酸葡萄糖扣DPG)、Tris-HCl緩沖配 制反應溶液，反應溶液中有機溶劑DMSO的比例為20% (v/v)，原人參二醇Ig/L，Tris-肥1 緩沖的摩爾濃度為50mmol/L，抑為7. 5，UDPG與原人參二醇之比為1:1 (w/w)。按70% (v/ V)比例添加UGT51糖基轉(zhuǎn)移酶粗酶液于反應液中，3(TC，18化pm,反應48小時。
[0077] 添加同體積正下醇終止反應，萃取的有機相真空干燥后加甲醇溶解，進行HPLC 檢測分析與定量。檢測方法同方案一，HPLC鑒定獲知原人參二醇糖基化反應的轉(zhuǎn)化率為 36%。
[007引方案四
[0079] 按照實施例1得到UGT51糖基轉(zhuǎn)移酶粗酶液。
[0080] W二甲基甲醜胺（DMF)、原人參二醇、尿巧二磯酸葡萄糖扣DPG)、Tris-HCl緩沖配 制反應溶液，反應溶液中有機溶劑DMF的比例為5 % (v/v)，原人參二醇0. 5g/l，Tris-HCl 緩沖的摩爾濃度為50mmol/L，抑為7. 5，UDPG與原人參二醇之比為10:l(w/w)。按70% (v/ V)比例添加UGT51糖基轉(zhuǎn)移酶粗酶液于反應液中，3(TC，18化pm,反應48小時。
[0081] 添加同體積正下醇終止反應，萃取的有機相真空干燥后加甲醇溶解，進行HPLC 檢測分析與定量。檢測方法同方案一，HPLC鑒定獲知原人參二醇糖基化反應的轉(zhuǎn)化率為 32%。
[0082] 方案五
[0083] 按照實施例1得到UGT51糖基轉(zhuǎn)移酶粗酶液。
[0084] W甲醇、原人參二醇、尿巧二磯酸葡萄糖扣DPG)、Tris-HCl緩沖配制反應溶液，反 應溶液中有機溶劑甲醇的比例為5% (v/v)，原人參二醇0. 5g/l，Tris-HCl緩沖的摩爾濃 度為50mmol/L，抑為7. 5, UDPG與原人參二醇之比為10:1 (w/w)。按70% (v/v)比例添加 UGT51糖基轉(zhuǎn)移酶粗酶液于反應液中，3(TC，180巧m，反應48小時。
[0085] 添加同體積正下醇終止反應，萃取的有機相真空干燥后加甲醇溶解，進行HPLC 檢測分析與定量。檢測方法同方案一，HPLC鑒定獲知原人參二醇糖基化反應的轉(zhuǎn)化率為 45%。
[0086] 方案六
[0087] 按照實施例1得到UGT51糖基轉(zhuǎn)移酶粗酶液。
[0088] W己二醇二甲離（DME)、原人參二醇、尿巧二磯酸葡萄糖扣DPG)、TriS-HCl緩沖配 制反應溶液，反應溶液中有機溶劑DME的比例為5 % (v/v)，原人參二醇0. 5g/l，Tris-HCl 緩沖的摩爾濃度為50111111〇1/1，抑為7.5，抓口6與原人參二醇之比為10:1(巧/^)。按70%(乂/ V)比例添加UGT51糖基轉(zhuǎn)移酶粗酶液于反應液中，3(TC，18化pm,反應48小時。
[0089] 添加同體積正下醇終止反應，萃取的有機相真空干燥后加甲醇溶解，進行HPLC 檢測分析與定量。檢測方法同方案一，HPLC鑒定獲知原人參二醇糖基化反應的轉(zhuǎn)化率為 48%。
[0090] 實施例4 UGT糖基轉(zhuǎn)移酶突變體的構建及其體外酶法合成稀有人參皂巧化2
[0091] W重組質(zhì)粒祀T28-UGT51為模板，W帶有突變位點的一對互補的寡核巧酸為引 物，用PrimeSTAR服高保真酶（TakaRa公司）進行全質(zhì)粒PCR擴增，獲得具有特定突變位 點的重組質(zhì)粒。引物序列如下：
[0092] 對應于SEQ NO:2中第801位絲氨酸被丙氨酸取代的突變體：
[0093] S801A_F:CCAGTGGAGTTGATGGCGTTGATGGTGGAAAATG
[0094] S801A_R:CATTTTCCACCATCAACGCCATCAACTCCACTGG ；
[0095] 對應于SEQ NO:2中第802位亮氨酸被丙氨酸取代的突變體：
[0096] L802A_F:GTGGAGTTGATGTCCGCGATGGTGGAAAATGAAT
[0097] L802A_R:ATTCATTTTCCACCATCGCGGACATCAACTCCAC ；
[0098] 對應于SEQ NO:2中第804位額氨酸被丙氨酸取代的突變體：
[0099] V804A_F:TTGATGTCCTTGATGGCGGAAAATGAATCAATGA
[0100] V804A_R:TCATTGATTCATTTTCCGCCATCAAGGACATCAA ；
[0101] 對應于SEQ NO:2中第812位賴氨酸被丙氨酸取代的突變體：
[0102] K812A_F:ATGAATCAATGAATGTTGCGATGCTGAGAGAAGCT
[0103] K812A_R:GCTTCTCTCAGCATCGCAACATTCATTGATTCATT ；
[0104] 對應于SEQ NO:2中第815位精氨酸被丙氨酸取代的突變體：
[0105] R815A_F: GAATGTTMAATGCTGGCGGAAGCTTCGAGCAAA
[010引 R815A_R:TTTGCTCGAAGCTTCCGCCAGCATTTTAACATTC ;
[0107] 對應于SEQ NO:2中第816位谷氨酸被丙氨酸取代的突變體：
[0108] E816A_F:GTTAAAATGCTGAGAGCGGCTTCGAGCAAATTT
[0109] E816A_R:AAATTTGCTCGAAGCCGCTCTCAGCATTTTAAC ；
[0110] 對應于SEQ NO:2中第849位絲氨酸被丙氨酸取代的突變體：
[0111] S849A-F ; CTGATTGAATCACCCGCGGCTATGGTTGGTATTC
[0112] S849A_R ：AATACCAACCATAGCCGCGGGTGATTCAATCAGA
[0113] 對應于SEQ NO:2中第849位絲氨酸被額氨酸取代的突變體：
[0114] S849V-F ; CTGATTGAATCACCCGTTGCTATGGTTGGTATTC [01 巧]S849V_R ;AATACCAACCATAGCAACGGGTGATTCAATCAGA
[0116] 對應于SEQ NO:2中第888位賴氨酸被丙氨酸取代的突變體；
[0117] K888A-F:ATTGTACCAGATCAAGCGAGGGGCGGTAACTA
[0118] K888A-R:TAGTTACCGCCCCTCGCTTGATCTGGTACAAT
[0119] 對應于SEQ NO:2中第892位天冬醜胺被丙氨酸取代的突變體：
[0120] N892A-F:AAAAAAGGGGCGGTGCGTATAACTACCTGACA
[0121] N892A_R:TGTCAGGTAGTTATACGCACCGCCCCTTTTTT
[0122] 擴增體系為；PrimeSTAR Buffer 6X) IOy L、dNTP (2. 5mM) 4 uL、重組質(zhì)粒模板 20ng、引物（IOyM)各2y UPrimeSTAR服高保真酶0.5uL、補充雙蒸水至50yL。擴增 條件為98C預變性1分鐘；98C變性10砂、68C退火及延伸7分鐘（30個循環(huán)）。膠回收 PCR產(chǎn)物，用化nl酶（Fermentas公司）在37C條件下消化膠回收產(chǎn)物化，降解初始模板。 消化產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至E. COli BL21，涂布到含有50 y g/mL卡那霉素LB瓊脂平板上，37 C過夜培 養(yǎng)，篩選陽性克隆，測序驗證。得到UGT糖基轉(zhuǎn)移酶突變體的重組菌。
[0123] 按照實施例1的方法得到UGT51糖基轉(zhuǎn)移酶突變體的粗酶液。
[0124] W二甲基亞諷（DMSO)、原人參二醇、尿巧二磯酸葡萄糖（UDPG)、Tris-HCl緩沖配 制反應溶液，反應溶液中有機溶劑DMSO的比例為10% (v/v)，原人參二醇0. 5g/L，Tris-肥1 緩沖的摩爾濃度為50mmol/L，抑為7. 5，UDPG與原人參二醇之比為10:l(w/w)。按70% (v/ V)比例添加UGT51糖基轉(zhuǎn)移酶突變體粗酶液于反應液中，3(TC，18化pm,反應48小時。
[01巧]添加同體積正下醇終止反應，萃取的有機相真空干燥后加甲醇溶解，進行HPLC檢 測分析與定量。檢測方法同實施例3, HPLC鑒定獲知原人參二醇糖基化反應的轉(zhuǎn)化率分別 為 S801A ;86%，L802A ;92%，V804A ;88%，K812A ;90%，R815A ;88%，E816A ;88%，S849A : 83%，S849V ;85%，K888A ;86%，N892A ;84%。
[0126] 重組蛋白在N末端攜帶有6-His標簽，誘導表達獲得的粗酶液用媒柱一步純化，使 用200mM咪哇溶液洗脫，過夜透析去除咪哇，即獲得純酶。W TweenSO、原人參二醇、尿巧二 磯酸葡萄糖扣DPG)、Tris-HCl緩沖配制反應溶液，反應溶液中TweenSO的比例為1% (v/ V)，原人參二醇0. 5mM, Tris-肥1緩沖的摩爾濃度為50mmol/L，抑為7. 5, UDPG 5mM。按終 濃度為0. 3mg/mL添加UGT51糖基轉(zhuǎn)移酶及其突變體的純酶于反應液中，3(TC，反應15min。 添加同體積正下醇終止反應，萃取的有機相真空干燥后加甲醇溶解，HPLC分析與定量測定 酶活力。UGT51糖基轉(zhuǎn)移酶及其突變體的相對酶活力如表1所示。
[0127]

【權利要求】
1. 一種糖基轉(zhuǎn)移酶在合成人參皂苷Rh2中的應用，其特征在于，所述糖基轉(zhuǎn)移酶是來 源于釀酒酵母的UGT51基因編碼的糖基轉(zhuǎn)移酶，命名為UGT51蛋白，編碼該蛋白的核苷酸序 列為3￡9勵:1,氨基酸序列為3￡9從):2或核苷酸序列為3￡9勵:3,氨基酸序列為3￡9勵:4。
2. -種糖基轉(zhuǎn)移酶在合成人參皂苷Rh2中的應用，其特征在于，所述糖基轉(zhuǎn)移酶是經(jīng) 過取代、缺失或添加一個或多個氨基酸且與SEQ N0:2或SEQ N0:4所示蛋白具有相同功能 的衍生蛋白。
3. -種糖基轉(zhuǎn)移酶，其特征在于，其是通過用另一種氨基酸殘基取代野生型UGT51糖 基轉(zhuǎn)移酶的一個或多個位置上的氨基酸殘基而獲得的糖基轉(zhuǎn)移酶突變體。
4. 一種糖基轉(zhuǎn)移酶，其特征在于，其是通過用另一種氨基酸殘基取代與野生型UGT51 糖基轉(zhuǎn)移酶表現(xiàn)出至少90%同源性的氨基酸序列的糖基轉(zhuǎn)移酶的一個或多個位置上的氨 基酸殘基而獲得的糖基轉(zhuǎn)移酶突變體。
5. 如權利要求3或4所述的糖基轉(zhuǎn)移酶，其特征在于，用于取代原有氨基酸殘基的所述 另一種氨基酸殘基優(yōu)選為丙氨酸或纈氨酸。
6. 編碼如權利要求3或4所述糖基轉(zhuǎn)移酶突變體的基因。
7. 包含如權利要求6所述糖基轉(zhuǎn)移酶突變體基因的重組載體。
8. -種糖基轉(zhuǎn)移酶轉(zhuǎn)糖基化體外合成人參皂苷Rh2的方法，其特征在于，以原人參二 醇和糖基供體UDPG為原料，在糖基轉(zhuǎn)移酶的催化作用下，原人參二醇的3位羥基發(fā)生糖基 化反應，生成稀有人參皂苷Rh2 ; 所述糖基轉(zhuǎn)移酶為UGT51蛋白，或去除N末端膜結(jié)合區(qū)后的UGT51蛋白，或用另一種氨 基酸殘基取代野生型UGT51糖基轉(zhuǎn)移酶的一個或多個位置上的氨基酸殘基而獲得的糖基 轉(zhuǎn)移酶突變體，或用另一種氨基酸殘基取代與野生型UGT51糖基轉(zhuǎn)移酶表現(xiàn)出至少90%同 源性的氨基酸序列的糖基轉(zhuǎn)移酶的一個或多個位置上的氨基酸殘基而獲得的糖基轉(zhuǎn)移酶 突變體。
9. 如權利要求8所述的方法，其特征在于，所述糖基供體UDPG與原人參二醇的比例為： 1:1 ?10:1(w/w)。
10. -種微生物體內(nèi)全合成人參皂苷Rh2的方法，其特征在于，以可生產(chǎn)原人參二醇的 工程菌為基礎，導入糖基轉(zhuǎn)移酶編碼基因 UGT51或其突變基因的表達盒，得到重組菌，發(fā)酵 培養(yǎng)獲得目標產(chǎn)物人參皂苷Rh2 ; 所述糖基轉(zhuǎn)移酶編碼基因 UGT51的表達盒具體包括啟動子PGK1、糖基轉(zhuǎn)移酶編碼基因 UGT51和終止子ADH1 ; 所述糖基轉(zhuǎn)移酶編碼基因 UGT51突變基因的表達盒具體包括啟動子PGK1、糖基轉(zhuǎn)移酶 編碼基因 UGT51突變基因和終止子ADH1。
【文檔編號】C12N9/10GK104357418SQ201410534597
【公開日】2015年2月18日 申請日期:2014年10月11日 優(yōu)先權日:2014年10月11日
【發(fā)明者】楊廣宇, 馮雁, 莊宇 申請人:上海交通大學