一種利用三醇組人參皂苷大規(guī)模轉(zhuǎn)化生產(chǎn)人參皂苷Rk3的方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種利用三醇組人參皂苷大規(guī)模轉(zhuǎn)化生產(chǎn)人參皂苷Rk3的方法，該方法包括將三醇組人參皂苷溶解在發(fā)酵罐的去離子水中，通N2保護后在線滅菌，然后加有機酸溶液，和催化量的Keggin結(jié)構(gòu)的雜多酸HxYW12O40·nH2O催化劑，其中Y選自P、Si、Fe或Zn，x為3或4，n為0?30的正整數(shù)，N2保護恒溫恒壓進行定向轉(zhuǎn)化反應(yīng)，最后收集反應(yīng)產(chǎn)物進行純化即可得到高純度的人參皂苷Rk3。所得的在線滅菌條件為121℃，維持20min，在線滅菌前通N2保護，添加的有機酸為乳酸、蘋果酸、檸檬酸、α?酮戊二酸、丁二酸、反丁烯酸或丙酮酸中的一種或幾種的組合。本發(fā)明工藝簡單易行，副反應(yīng)少，產(chǎn)物純度高，易于工業(yè)化生產(chǎn)。
【專利說明】 一種利用三醇組人參皂苷大規(guī)模轉(zhuǎn)化生產(chǎn)人參皂苷Rk3的
方法
技術(shù)領(lǐng)域
[0001 ]本發(fā)明涉及一種利用三醇組人參皂苷大規(guī)模轉(zhuǎn)化生產(chǎn)人參皂苷Rk3的方法，屬于生物化工領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002]人參的化學(xué)成分復(fù)雜，含有纖維素、皂苷、揮發(fā)油、糖類、蛋白質(zhì)、維生素等?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)和藥理學(xué)研究證明，人參皂苷為人參的主要有效成分，它能代表人參的主要生理活性。人參皂苷(ginsenoside)是人參的主要有效成分，現(xiàn)在已經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)的人參皂苷已經(jīng)超過50種。其中近些年研究最多且與腫瘤細胞凋亡相關(guān)的為人參皂苷Rg3與人參皂苷Rh2。這兩種人參皂苷具有一定的抗腫瘤活性，對正常細胞基本無毒，與其他化療藥物(如順鉑、吉非替尼等)聯(lián)合應(yīng)用有協(xié)同減毒作用。人參皂苷通過調(diào)控腫瘤細胞增殖周期、誘導(dǎo)細胞分化和凋亡來發(fā)揮抗腫瘤作用。將腫瘤細胞誘導(dǎo)分化成正常細胞有利于控制腫瘤發(fā)展，誘導(dǎo)腫瘤細胞凋亡使細胞解體后形成凋亡小體，不引起周圍組織炎癥反應(yīng)。
[0003]人參皂苷可通過五加科植物人參、西洋參、三七、假人參、姜狀三七、竹節(jié)參等植物提取獲得。日本學(xué)者北川勛于1980年開始陸續(xù)從人參中提取得到了人參皂苷20(R)-Rg3、人參皂苷Rh2，并發(fā)現(xiàn)對多種腫瘤細胞有明顯的抑制作用。根據(jù)目前對人參皂苷系列化合物的研究結(jié)果來看，天然的植物提取物中的人參皂苷上攜帶的糖苷一般都有3?5個，而隨著糖苷數(shù)量的減少，抗癌活性逐漸增強，我們聯(lián)想到人參皂苷Rk3等多種去除一定數(shù)量糖苷的人參皂苷都會有良好的抗癌效果，經(jīng)過我們對人生皂苷相關(guān)專利的檢索，查詢到專利CN103193846 A發(fā)明了一種人參皂苷Rk3和人參皂苷Rh4順反異構(gòu)體的制備方法，涉及人參皂苷Rk3與人參皂苷Rh4順反異構(gòu)體的分離方法，產(chǎn)量也僅僅達到毫克級水平，尚未發(fā)現(xiàn)有以三醇組人參皂苷為原料定向轉(zhuǎn)化大規(guī)模生產(chǎn)人參皂苷Rk3方法，主要原因是目前人參皂苷去除糖苷的工藝中很多都要引入強酸、強堿，反應(yīng)控制較為困難，副反應(yīng)較多，對于人參皂苷母環(huán)的破壞也比較嚴重，造成除了目標(biāo)產(chǎn)物之外的副產(chǎn)物較多，一方面轉(zhuǎn)化后的收率很低，另一方面給后期的純化造成了很大的困難，工業(yè)化成本較高，對于后期的產(chǎn)品開發(fā)帶來困難，缺乏競爭力。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明的目的在于提供一種利用三醇組人參皂苷大規(guī)模轉(zhuǎn)化生產(chǎn)人參皂苷Rk3的方法。
[0005]本發(fā)明的實現(xiàn)過程如下:
一種利用三醇組人參皂苷大規(guī)模轉(zhuǎn)化生產(chǎn)人參皂苷Rk3的方法，包括如下步驟:在發(fā)酵罐中，將三醇組人參皂苷溶解于去離子水中，通^保護后在線滅菌，然后加有機酸溶液和催化量的Keggin結(jié)構(gòu)的雜多酸HxYW12O4Q.nifeO催化劑，其中Y選自P、S1、Fe或Zn，x為3或4，η為0-30的正整數(shù)，在80?105°C下反應(yīng)24?48h，然后經(jīng)沉淀、洗滌、干燥得到目標(biāo)產(chǎn)物。
[0006]所述的醇組人參皂苷選自人參皂苷Rgl、人參皂苷Re、人參皂苷Rg2、人參皂苷Rf、人參皂苷Rhl。
[0007]所述的醇組人參皂苷的純度大于80%，濃度為50?300g/L之間。
[0008]所述的發(fā)酵罐裝水量不大于發(fā)酵罐有效容積的70%。
[0009]所述的滅菌條件為121°C，維持20min，且加熱前通N2進行保護。
[0010]所述N2流速為發(fā)酵罐有效容積量的50%/min?200%/min，時間Imin?5min。
[0011]所述的有機酸選自乳酸、蘋果酸、檸檬酸、α-酮戊二酸、丁二酸、反丁烯酸、丙酮酸，反應(yīng)體系中所用的有機酸的濃度為0.01?0.1moI/L。
[0012]所述發(fā)酵罐的轉(zhuǎn)速為50rpm?200rpm。
[0013]上述方法制備的目標(biāo)產(chǎn)物可以利用工業(yè)化色譜柱對目標(biāo)產(chǎn)物精制純化。
[0014]利用上述方法合成的人參皂苷Rk3原料藥制成硬膠囊、軟膠囊、片劑、沖劑、滴丸或注射劑。
[0015]本發(fā)明的積極效果:本發(fā)明綜合使用有機酸和雜多酸催化劑，催化效果得到大大提升;本發(fā)明采用相對溫和的有機酸在生物反應(yīng)器中的穩(wěn)定條件下定向轉(zhuǎn)化得到人參皂苷Rk3，將水溶性良好的三醇組人參皂苷定向轉(zhuǎn)化為水溶性差的人參皂苷Rk3，轉(zhuǎn)化率高，收率高，后期精制純化工藝簡單，生產(chǎn)成本低，有利于工業(yè)化生產(chǎn)，可顯著提高原料藥及成品藥的市場競爭力。
【附圖說明】
[0016]圖1為人參皂苷Rgl轉(zhuǎn)化為人參皂苷Rk3的示意圖；
圖2為人參皂苷Rk3標(biāo)準(zhǔn)品的液相色譜圖；
圖3為本發(fā)明方法生產(chǎn)得到人參皂苷Rk3的液相色譜圖。
【具體實施方式】
[0017]下面給出的實施例，是為了便于理解本發(fā)明。并不以任何方式限定本發(fā)明的權(quán)利要求和核心內(nèi)容。
[0018]實施例1
將有效容積為100L的全自動發(fā)酵罐中加入65L的去離子水，然后加入3500g純度為85%的人參皂苷Re(雜質(zhì)為其他類型的人參皂苷及多糖)，通他，通氣流量為50L/min，持續(xù)5min，然后停止通氣開始加熱在線滅菌，滅菌條件為121°C，維持20min。降溫至105°C以下后，補加濃度為0.15moVL的無菌檸檬酸溶液5L和1g雜多酸H3PW12O4Q.5H20，然后加熱發(fā)酵罐內(nèi)液體至105°C并維持24h，同時保持攪拌轉(zhuǎn)速為300rpm，反應(yīng)結(jié)束后將所有液體放出于容器中靜置12h，棄上清，將剩余底部含有沉淀的液體約6L離心棄上清，收集沉淀物并烘干，得到人參皂苷Rk3粗品約1940g，HPLC檢測人參皂苷Rk3的純度為94.6%。
[0019]對比實例:與上述制備方法類似，不同的是僅使用有機酸或雜多酸，人參皂苷Rk3粗品僅能得到不足1500g。
[0020]實施例2
將有效容積為500L的全自動發(fā)酵罐中加入300L的去離子水，然后加入90kg純度為95%的人參皂苷Rgl(雜質(zhì)為其他類型的人參皂苷及多糖)，通％，通氣流量為350L/min，持續(xù)4min，然后停止通氣開始在線滅菌，滅菌條件為121°C，維持20min。降溫至90°C以下后，補加濃度為〇.6mol/L的無菌蘋果酸溶液25L，濃度為0.8mol/L的無菌丁二酸溶液5L和20g雜多酸 H4SiW12〇4〇 ? 25H20,然后加熱發(fā)酵罐至80°C并維持48h，同時保持攪拌轉(zhuǎn)速為lOOrpm，反應(yīng)結(jié)束后將所有液體放出靜置于容器中24h，棄上清，底部約有100L固液混合物，再加入100L去離子水洗滌一次，再靜置24h后棄上清，將底部混合物攪拌均勻后離心棄上清，收集沉淀物并烘干，得到人參皂苷Rk3粗品約65kg，HPLC檢測人參皂苷Rk3的純度為94.9%。[〇〇21]實施例3將有效容積為200L的全自動發(fā)酵罐中加入120L的去離子水，然后加入28kg純度為90% 的人參皂苷Rhl(雜質(zhì)為其他類型的人參皂苷及多糖)，通仏，通氣流量為200L/min，持續(xù) 3min，然后停止通氣開始在線滅菌，滅菌條件為121°C，維持20min。降溫至100°C以下后，補加濃度為〇.2mol/L的無菌蘋果酸溶液10L，濃度為0.2mol/L的a-酮戊二酸溶液10L，乳酸 225mL和50g雜多酸H3FeW12〇4〇 ? 30H20，然后加熱發(fā)酵罐至95 °C并維持36h，同時保持攪拌轉(zhuǎn)速為50rpm，反應(yīng)結(jié)束后將所有液體放出在容器中靜置24h，棄上清，將剩余底部含有沉淀的液體約40L離心棄上清，再加入40L去離子水洗滌一次，再靜置24h后棄上清，將底部混合物攪拌均勻后離心棄上清，收集沉淀物并烘干，得到人參皂苷Rk3粗品約25kg，HPLC檢測人參皂苷Rk3的純度為93.8%。[〇〇22]實施例4將有效容積為50L的全自動發(fā)酵罐中加入30L的去離子水，然后加入10.5kg含量為90% 的三醇組人參皂苷(其中人參皂苷Rgl為8kg，人參皂苷Re為2.5kg，雜質(zhì)為其他類型的人參皂苷及多糖)，通N2,通氣流量為150L/min，持續(xù)lmin，然后停止通氣開始在線滅菌，滅菌條件為121°C，維持20min。降溫至100°C以下后，補加濃度為0.7mol/L的無菌反丁烯酸溶液5L 和20g雜多酸H3ZnW12〇4〇 ? 15H20,然后加熱發(fā)酵罐至100°C并維持30h，同時保持攪拌轉(zhuǎn)速為 200rpm，反應(yīng)結(jié)束后將所有液體放出在容器中靜置24h，棄上清，將剩余底部含有沉淀的液體約35L離心棄上清，再加入10L去離子水洗滌一次，再靜置24h后棄上清，將底部混合物攪拌均勻后離心棄上清，收集沉淀物并烘干，得到人參皂苷Rk3粗品約7.5kg，HPLC檢測人參皂苷1^3的純度為95.6%。
【主權(quán)項】
1.一種利用三醇組人參皂苷大規(guī)模轉(zhuǎn)化生產(chǎn)人參皂苷Rk3的方法，其特征在于:在發(fā)酵罐中，將三醇組人參皂苷溶解于去離子水中，通犯保護后在線滅菌，然后加有機酸溶液和催化量的Keggin結(jié)構(gòu)的雜多酸HxYW12O4Q.ηΗ20催化劑，其中Y選自P、S1、Fe或Zn，x為3或4，n為0-30的正整數(shù)，在80?105°C下反應(yīng)24?48h，然后經(jīng)沉淀、洗滌、干燥得到目標(biāo)產(chǎn)物。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于:所述的醇組人參皂苷選自人參皂苷Rg1、人參皂苷Re、人參皂苷Rg2、人參皂苷Rf、人參皂苷Rhl。3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于:所述的醇組人參皂苷的純度大于80%，濃度為50?300g/L之間。4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于:所述的發(fā)酵罐裝水量不大于發(fā)酵罐有效容積的70%。5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于:所述的滅菌條件為121°C，維持20min，且加熱前通N2進行保護。6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于:N2流速為發(fā)酵罐有效容積量的50%/min?200%/min，時間 Imin?5min。7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于:所述的有機酸選自乳酸、蘋果酸、檸檬酸、α-酮戊二酸、丁二酸、反丁烯酸、丙酮酸，反應(yīng)體系中所用的有機酸的濃度為0.01 -0.1mol/L08.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于:所述發(fā)酵罐的轉(zhuǎn)速為50rpm?200rpm。9.根據(jù)權(quán)利要求1至8所述的方法，其特征在于:利用工業(yè)化色譜柱對目標(biāo)產(chǎn)物精制純化。10.利用權(quán)利要求1所述方法合成的人參皂苷Rk3原料藥制成硬膠囊、軟膠囊、片劑、沖劑、滴丸或注射劑。
【文檔編號】A61K31/704GK106008644SQ201610346366
【公開日】2016年10月12日
【申請日】2016年5月24日
【發(fā)明人】范代娣, 惠俊峰, 段志廣, 馬沛, 李偉娜, 米鈺, 朱晨輝, 馬曉軒
【申請人】西北大學(xué)