專利名稱：：人參皂苷-Re在神經(jīng)細胞保護中的應用的制作方法
技術領域：
：本發(fā)明屬于醫(yī)藥
技術領域：
，涉及人參皂苷-Re在神經(jīng)細胞保護中的應用。具體涉及人參皂苷-Re對帕金森病、阿爾茨海默病、腦中風、腦缺血等神經(jīng)系統(tǒng)疾病及其所造成的神經(jīng)細胞損傷保護作用，提示人參皂苷-Re可以預防和治療多種腦和神經(jīng)系統(tǒng)疾病。
背景技術：
：神經(jīng)細胞的損傷、衰老、死亡具有不可逆的特點，在目前眾多的腦和神經(jīng)系統(tǒng)疾病中，都存在神經(jīng)細胞嚴重損傷并導致加速死亡的特點，如帕金森病、阿爾茨海默病、腦中風、腦缺血等。帕金森病.(PD)是一種常見的慢性神經(jīng)退變性疾病，多發(fā)于50歲以上人群，并隨著年齡的增長發(fā)病率逐漸增加，我國的PD患病率在50-60歲之間為O.5%,60歲以上為1%,80歲以上人群的發(fā)病率超過5%。PD病理改變主要黑質(zhì)多巴胺能神經(jīng)元的變性、脫失，研究表明帕金森病患者多巴胺神經(jīng)元喪失50%以上。阿爾茨海默病(AD)是一種原發(fā)性、退行性腦病，以獲得性持續(xù)性記憶減退、認知功能障礙、行為異常以及人格改變?yōu)樘卣鳌Ｆ涮卣餍圆±碜兓癁榇竽X皮質(zhì)萎縮、P淀粉樣蛋白沉積、神經(jīng)元纖維纏結(jié)、大量記憶性神經(jīng)元數(shù)目減少等。據(jù)流行病學統(tǒng)計，到2050年，全世界AD人口將超過1億。因此，AD已成為老年人死亡的重要原因之一。缺血性腦血管病(ICVD)是威脅人類健康與生存的主要疾病之一，是目前人類重點防治的一類疾病。在ICVD的治療中重建血流或增強缺血區(qū)的血流供應是缺血腦組織修復損傷的必要條件，但同時帶來的再灌注損傷也是目前最受關注的問題，腦缺血以及缺血再灌注后能引起一系列病理和生化變化，主要表現(xiàn)為腦能量耗竭，興奮性氨基酸(EAA)釋放增加，胞內(nèi)Ca"超載，毒性自由基產(chǎn)生，細胞膜功能受損，細胞腫脹，凋亡和壞死，炎性細胞損害等。它們之間互為因果、互相促進。人參作為滋補珍品已有幾千年的藥用歷史，人參皂苷為人參的有效成分之一，具有廣泛的生物活性，表現(xiàn)為興奮中樞，促進學習記憶，促進蛋白質(zhì)、DNA、RNA合成，增加海馬突觸等作用。而在人參皂苷中，人參阜苷-Re，以下簡稱Re屬于人參三醇型皂苷(結(jié)構(gòu)如下所示)，約占總皂苷的30%。同時由于Re是人參莖葉中含量最多的皂苷，因此這使利用人參龜苷-Re研制新藥成為可能。目前，關于人參皂苷-Re的研究報道較多。藥理方面實驗表明，人參皂苷-Re具有較好的降低血糖，調(diào)節(jié)細胞膜的流動性，促進小鼠骨髓細胞增殖，增強心肌細胞的抗氧化以及改善心肌缺血等作用。但人參皂苷-Re對神經(jīng)細胞的保護作用未見報道。通過研究，我們發(fā)現(xiàn)人參阜苷-Re對帕金森病小鼠具有較好的保護作用(已申請專利，公開號CN1650876A)。進一步的深入研究表明，人參皂苷-Re是一個較好的神經(jīng)細胞保護劑，對多種腦病以及神經(jīng)細胞損傷具有保護作用。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的在于提供人參皂苷_Re在神經(jīng)細胞保護中的應用，人參皂苷-Re在多種腦病模型及神經(jīng)細胞中具有保護作用，人參皂苷-Re對腦缺血、腦缺血再灌注損傷、帕金森病小鼠、阿爾茨海默病、PC12細胞具有保護作用，為帕金森病、阿爾茨海默病、腦中風、腦缺血等神經(jīng)系統(tǒng)疾病的預防和治療提供了一種新的藥物。對于小鼠模型，人參皂苷-Re的應用劑量為8-26mg/kg;對于大鼠模型，人參皂苷-Re的應用劑量為5-26mg/kg;對于細胞實驗，人參皂苷-Re的應用劑量為10—5-l(T8mol/L。具體實施例方式實施例1本實施例涉及的是人參皂苷-Re對小鼠腦缺氧、缺血、腦水腫的保護作用。1.1結(jié)扎雙側(cè)頸總動脈和迷走神經(jīng)小鼠存活時間測定取健康昆明種小白鼠40只，雌雄各半，按體重、性別均衡分成4組，每組10只。即空白對照組(0.5%CMC-Na)，人參Re低、中、高劑量組(8、16、32mg/kg)，每天獾.胃給藥l次，連續(xù)給藥7天，末次給藥l小時后用5%水合氯醛(350mg/kg)麻醉，結(jié)扎雙側(cè)頸總動脈和迷走神經(jīng)，觀察小鼠存活時間(每分鐘呼吸少于或等于5次為死亡)。..表l人參皂苷一Re對小鼠的存活時間的影響GroupDoes(mg'kg-1)nSurvivaltime(s)Control一10386.0±86.4Re810548.0士183.8'1610563.9±28.廣3210646.0士82.9"*P<0.05;**P<0.01與對照組比較1.2結(jié)扎雙側(cè)頸總動脈小—嵐腦指數(shù)和腦含水量測定實驗動物分組及給藥方式同前。末次給藥1小時后開始實驗，受試動物用5%水合氯醛(350mg/kg)麻醉，結(jié)扎雙側(cè)頸總動脈，形成急性不完全性腦缺血模型。手術3小時后，斷頭取腦稱重計算腦指數(shù)(腦指數(shù)=腦濕重xl00/體重)。然后一部分用于千濕法測腦含水量(含水量=(濕重-干重)/干重)。表2人參皂苷一^e'對結(jié)扎雙側(cè)頸總動脈小鼠腦指數(shù)和腦含水量的影響<table>tableseeoriginaldocumentpage5</column></row><table>*P<0.05**P<0.01與對照組比較1.3"結(jié)扎雙側(cè)頸總動脈小鼠腦組織SOD和MDA的含量測定實驗動物分組及給藥方式同前。末次給藥l小時后開始實驗，受試動物用5%水合氯醛(35tfmg/kg)麻醉，結(jié)扎雙側(cè)頸總動脈，形成急性不完全性腦缺血模型。手術3小時后，斷頭取腦勻漿后，測定組織中SOD和MDA的含量，測定方法根據(jù)試劑盒說明書進行。表3人參皂苷一Re對結(jié)扎雙側(cè)頸總動脈小鼠腦組織SOD和MDA含量的影響<table>tableseeoriginaldocumentpage5</column></row><table>*P<0.05;**P<0.01.與對照組比較以上結(jié)果表明，人參皂苷-Re對腦缺氧、缺血、腦水腫具有明顯的保護作用。實施例2本實施例涉及的是人參皂苷-Re對大鼠腦缺血再灌注損傷的保護作用。將50只健康雄性受試大鼠按體重均衡分為5組，每組10只。即假手術組(Shamsurgery,SAM)、模型對照組(0.5%CMC-NalOmL/kg，Vehicle,VEH)、人參皂苷-Re低、中、高劑量組(5、10、20mg/kg)。各組實驗動物連續(xù)灌胃給藥7天，第6天給藥后晚間禁食，自由飲水。末次給藥后lh,釆用栓線法阻斷大鼠中動脈致局灶性腦缺血(MCA0)再灌注模型。MCA0再灌注24h大鼠與假手術組動物比較，腦功能出現(xiàn)明顯障礙，并，出現(xiàn)明顯的腦梗塞。人參皂苷-Re在所選劑量范圍內(nèi)連續(xù)灌胃給藥7天，對MCA0再灌注24h大'鼠行為障礙和腦梗塞面積有明顯的改善作用。表4人參皂苷一Re對MCA0再灌注大鼠行為障礙的改善作用<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>以上實驗結(jié)果表明，人參皂苷-Re預防給藥對腦缺血再灌注有顯著的保護作用。，實施例3本實施例涉及的是人參皂苷-Re對大鼠腦缺血再灌注海馬CAl區(qū)神經(jīng)細胞的保護作用。實驗方法和分組同實施例2。與假手術組神經(jīng)細胞比較，MCAO再灌注24h大鼠CAl區(qū)神經(jīng)細胞腫脹變形，胞膜結(jié)構(gòu)不完整，并出現(xiàn)不同程度的胞核深染、核固縮、細胞間隙增大、間質(zhì)水腫明顯。不同濃度給藥組則使神經(jīng)細胞的核深染、核固縮程度減輕，神經(jīng)細胞形態(tài)尚正常，細胞間質(zhì)水腫減輕，核仁清晰可見，缺血中心區(qū)壞死的神經(jīng)元減少。病理組織學檢査結(jié)果提示人參皂苷-Re在所選劑量范圍內(nèi)能改善腦缺血再灌注造成的神經(jīng)細胞損傷，減少神經(jīng)細胞死亡，從而起到抗腦缺血再灌注損傷的作用。實施例4本實施例涉及的是人參皂苷-Re對大鼠腦缺血再灌注后線粒體功能的影響。線粒體被稱為細胞內(nèi)的動力工廠，是一個敏感而多變的重要細胞器，是細胞中能量儲存和供給的場所。在腦缺血過程中最直接的損傷是腦內(nèi)能量供應急劇減少，隨著缺血時間的延長，線粒體的形態(tài)和結(jié)構(gòu)均可呈現(xiàn)不同程度的破壞，從而進一步加劇產(chǎn)能功能的障礙。1995年，Siesjo等人提出腦缺血過程中細胞內(nèi)4'T超載。自由基的大量產(chǎn)生和乳酸酸中毒等作用均與細胞內(nèi)能量的迅速減少密切相關，腦缺血引起的損傷和遲發(fā)性神經(jīng)元壞死的最根本原因可能是能量的缺乏和腦的微循環(huán)障礙。已有越來越多的證據(jù)表明，線粒體功能障礙是導致腦缺血直接損傷和遲發(fā)性神經(jīng)元壞死的主要原因，同時也是啟動細胞凋亡的關鍵因素。本實驗采用Merocyanine-540探針分子和DPH熒光探針考察了人參皂苷-Re對局灶性腦缺血再灌注后大鼠線粒體膜脂質(zhì)堆積密度和線粒體膜流動性的影響。表6人參皂苷一Re對大鼠腦缺血再灌注后腦組織中線粒體膜流動性的影響<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>以上實驗結(jié)果表明，人參皂苷-Re可減輕腦缺血再灌注后對線粒體的損傷，而對腦缺血再灌注引起的腦損傷有一定的保護作用。實施例5本實施例涉及的是人參皂苷-Re對PC12細胞損傷模型的保護作用。阿爾茨海默病UD)的特征性病理變化為大腦皮層萎縮，并伴有(3-淀粉樣蛋白(AI3)沉積，神經(jīng)元纖維纏結(jié)，大量記憶性神經(jīng)元數(shù)目減少，以及老年斑的形成。研究表明，在AD的形成和發(fā)展過程中，AP的神經(jīng)毒性作用是關鍵因素。其具體機制包括細胞內(nèi)c,穩(wěn)態(tài)，促進自由基的生成,降低r通道的功能，增加致炎細胞因子引起的炎癥反應，激活補體系統(tǒng)，增加腦內(nèi)興奮性氨基酸，主要是谷氨酸的含量等。A(3的神經(jīng)毒性表現(xiàn)在兩個方面，一是放大各種傷害性刺激如低血糖、興奮毒素、自由基等的細胞損傷效應，二是直接的細胞毒性。PC12細胞為大鼠髓質(zhì)嗜鉻細胞克隆化的細胞株。分化的PC12細胞具有較典型的神經(jīng)內(nèi)分泌細胞的特征，所包含的酶類、膜受體以及其遞質(zhì)合成方面具有神經(jīng)細胞的一般特征，且具有可傳代特點，因此被廣泛用于研究神經(jīng)細胞分化、離子通道、受體、遞質(zhì)分泌的實驗，也是研究神經(jīng)毒性的最常用的細胞株。結(jié)合AD的發(fā)病機制和PC12細胞的特點，本實施例考察了人參皂苷-Re對缺糖、自由基、谷氨酸以及AP對PC12細胞損傷的保護作用。表8'人參皂苷一Re對PC12細胞缺糖損傷模型的影響<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>+PO.05與對照組較；**P<0.01與模型組較表9人參皂苷—Re對PC12細胞i由基損傷模型的影響<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>與對照組比較；**P<0.01與模型組比較表10人參皂苷一Re對PC12細胞谷氨酸損傷模型的影響<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>++PO.01與對照組比較；*P<0.05與模型組比較表11人參皂苷一Re對PC12細胞淀粉樣蛋白(Ap)損傷模型的影響<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>++PO.01與對照組比較；**P<0.01與模型組比較以上實驗結(jié)果表明，不同濃度的人參皂苷-Re(l(T8、10—7、l(T6、10—5M)能夠顯著保護缺糖、自由基、谷氨酸、A(3等各種因素導致的體外培養(yǎng)的PC12細胞損傷或死亡。提示人參皂苷-Re具有一定的神經(jīng)保護作用，而這種作用是通過上述諸多方面來實現(xiàn)的。實驗結(jié)果還提示我們?nèi)藚⒃碥?Re對腦缺血后引起的中風、血管性癡呆、認知功能障礙、阿爾茨海默病等可能有一定的預防和治療作用。實施例6'本實施例涉及的是人參皂苷-Re對帕金森病小鼠多巴胺能神經(jīng)元和Y-氨基丁酸(GABA)能神經(jīng)元的保護作用。在已申請的專利(公開號CN1650876A)中，我們提到人參皂苷-Re對1-甲基-4-苯基-l.2,3,6-四氫吡啶(MPTP)致帕金森病模型小鼠具有保護作用。經(jīng)過進，步的深入研究，我們發(fā)現(xiàn)人參皂苷-Re對黑質(zhì)多巴胺能神經(jīng)元和GABA能神經(jīng)元具有保護作用。帕金森病的主要病理改變是黑質(zhì)致密部多巴胺能神經(jīng)元發(fā)生進行性變性缺失，導致紋狀體內(nèi)多巴胺及其代謝產(chǎn)物的急劇下降。研究表明，帕金森患者腦內(nèi)多巴胺能細胞至少80%以上發(fā)生凋亡，提示細胞凋亡可能是帕金森病患者黑質(zhì)神經(jīng)元變性的原因。GABA能神經(jīng)元廣泛分布于中樞神經(jīng)系統(tǒng)，其神經(jīng)末梢釋放的GABA是一種重要的抑制性神經(jīng)遞質(zhì)。許多研究發(fā)現(xiàn)GABA與帕金森病密切相關，GABA能神經(jīng)元功能的降低可失去對谷氨酸神經(jīng)元的抑制作用，造成谷氨酸的神經(jīng)毒性作用，損害多巴胺能神經(jīng)元。本實施例通過多項分組生物學技術考察了人參皂苷-Re的抗帕金森病小鼠黑質(zhì)多巴胺神經(jīng)元凋亡的保護作用以及對GABA能神經(jīng)元的保護作表12人參皂苷一Re對帕金森病小鼠黑質(zhì)致密部細胞凋亡的影響<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>+PO.05與對照組比較；*PO.05與模型組比較表13人參皂苷一Re對帕金森病小鼠黑質(zhì)GABA能神經(jīng)元的影響<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>+PO.05與對照組比較；*P<0.05與模型組比較表14人參皂苷一Re對帕金森病小鼠紋狀體GABA能神經(jīng)元的影響<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>+PO.05與對照組比較；*P<0.05與模型組比較以上實驗結(jié)果表明，人參皂苷-Re對帕金森病小鼠的多巴胺能神經(jīng)元及GABA能神經(jīng)元有保護作用。將人參皂苷-Re和常用的藥物輔料結(jié)合用常規(guī)手段可制備成臨床上常用的各種劑型。權(quán)利要求1、人參皂苷-Re在神經(jīng)細胞保護中的應用，其特征在于人參皂苷-Re對腦缺血、腦缺血再灌注損傷、帕金森病小鼠、阿爾茨海默病、PC12細胞具有保護作用。2、人參皂苷-Re在制備治療帕金森病、阿爾茨海默病、腦中風、腦缺血病藥物中的應用。3、根據(jù)權(quán)利要求1所述的人參皂苷-Re在神經(jīng)細胞保護中的應用，其特征在于對于小鼠模型，人參皂苷-Re的應用劑量為8_26mg/kg;對于大鼠模型，人參皂苷-Re的應用劑量為5-26mg/kg;對于細胞實驗，人參皂苷-Re的應用劑量為10_5-10—8mol/L。全文摘要本發(fā)明屬于醫(yī)藥
技術領域：
，公開了人參皂苷-Re人參皂苷-Re在神經(jīng)細胞保護中的應用，提出人參皂苷-Re對腦缺血、腦缺血再灌注損傷、帕金森病小鼠、阿爾茨海默病、PC12細胞具有保護作用，為帕金森病、阿爾茨海默病、腦中風、腦缺血等神經(jīng)系統(tǒng)疾病的預防和治療提供了一種新的藥物。對于小鼠模型，人參皂苷-Re的應用劑量為8-26mg/kg；對于大鼠模型，人參皂苷-Re的應用劑量為5-26mg/kg；對于細胞實驗，人參皂苷-Re的應用劑量為10^-5-10^-8mol/L。文檔編號A61P25/28GK101254194SQ20081001067公開日2008年9月3日申請日期2008年3月17日優(yōu)先權(quán)日2008年3月17日發(fā)明者周曉棉,峰徐,成徐,徐琲琲,曹穎林申請人:沈陽藥科大學