專利名稱：一種基因工程抗菌肽及其制備方法和應用的制作方法
技術領域：
本發(fā)明屬于生物工程技術領域，具體地說，涉及一種基因工程抗菌肽及其制備方法和應用。
背景技術：
抗生素的濫用不僅導致了藥物殘留等公共衛(wèi)生問題，而且由于耐藥菌株和新的致病亞型菌株的出現(xiàn)，使得細菌性疾病的防治再次成為困擾人類的難題。所以開發(fā)新的抗菌藥物成為一個越來越重大的研究課題。抗菌肽(Antibacterialρ印tide，ABP)又叫抗微生物肽(Antimicrobial peptide)、抗生素肽(Antibiotics ρ印tide)，是生物體經誘導產生的一類具有多種生物活性的小分子多肽，是宿主免疫防御系統(tǒng)的一個重要組成部分，具有廣譜抗菌、無耐藥性及毒副作用等優(yōu)點。天蠶素A是較早從惜古比天蠶中分離的抗菌肽，具有廣譜的殺菌能力， 耐高溫且對真核細胞無毒副作用，其N端堿性很強，形成雙親a螺旋結構，N端序列對于其活性具有重要作用。由于天蠶素A由37個氨基酸殘基組成，在體內應用時能引起免疫反應等問題，所以它不是發(fā)展為藥物的理想候選者。Magainins是1987年由Zasloff從非洲爪蟾的皮膚中分離出來的一類堿性無半胱氨酸的多肽，具有廣譜抗性、親水脂特性，有較低的溶血活性，不同于裂解肽Melittin和Bomhinin，后者具有高效的細胞溶血作用。一些其他種類的抗菌肽如防衛(wèi)素和蜂毒素等，它們不是結構過于復雜，就是抗菌能力不足，或者是對真核細胞有毒性。隨著對抗菌肽結構、功能與殺菌機理研究的深入，人們開始嘗試設計殺菌活力更強、抗菌譜更廣的新型抗菌肽。本發(fā)明既是基于上述已知抗菌肽的優(yōu)點人工設計的一種新型抗菌肽。

發(fā)明內容
本發(fā)明提供了一種基因工程抗菌肽及其制備方法和應用，可以解決現(xiàn)有技術存在的結構復雜、抗菌能力不足且抗菌譜不夠廣的問題。本發(fā)明根據(jù)cecropin A和magainins的殺菌特點，自行設計了一種新型抗菌肽氨基酸序列。在此基礎上，選用畢赤酵母偏愛密碼子，人工合成新型抗菌肽基因，克隆于畢赤酵母中表達，獲得新型抗菌肽重組酵母菌株，并將發(fā)酵規(guī)模放大到發(fā)酵罐水平，實現(xiàn)抗菌肽產品的高密度發(fā)酵和高效表達。發(fā)酵液進一步純化后制成粉劑、液體等抗菌肽制劑?；蚬こ炭咕闹苿┛勺鳛樾笄蒿暳咸砑觿┗蛴糜谛笄菁膊〉念A防和治療。為解決上述技術問題，本發(fā)明采用以下技術方案予以實現(xiàn)
一種基因工程抗菌肽，所述抗菌肽具有如下氨基酸序列KWKLFKKIAGPKFLHSKKKFN?？梢姳景l(fā)明的抗菌肽序列結構簡單，而且是一種殺菌活力更強、抗菌譜更廣的新型抗菌肽。進一步地，上述基因工程抗菌肽的制備方法，包括如下步驟(1)抗菌肽基因的合成
根據(jù)cecropin A和magainin氨基酸序列，選用畢赤酵母偏好密碼子，合成抗菌肽基因序列，并在其N端引入Kex2酶切位點，兩端引入ZAoI和損^酶切位點，以便于克隆入畢赤酵母表達載體中，另設計合成一對引物Pl和P2，用于重組載體及重組酵母菌的鑒定，上游引物位于抗菌肽基因區(qū)，下游引物位于畢赤酵母3’ AOX基因區(qū)，引物擴增長度為250bp，
Pl 5' - AAGTGGAAATTGTTCAAGAA - 3'
P2 5’ - GCAAATGGCAT，TCTGACATCC -3，；
(2)抗菌肽表達載體的構建與鑒定
將含抗菌肽基因的載體和表達載體均用損ol和損al雙酶切，酶切產物回收并連接，進行PCR鑒定、測序；
(3)重組陽性質粒轉化酵母菌株與篩選
陽性質粒經feci單酶切線性化后加入畢赤酵母感受態(tài)細胞懸液中，電轉化后均勻涂布于含100 μ g/mL Zeocin的YPDS選擇平板上，30°C孵育3 -5天，待YPDS平板上的陽性轉化子生長較大，將各轉化子依次點種至含kocin 200 μ g/mL, 500 μ g/mL, 1000 μ g/mL的 YPDS選擇平板，以在高濃度kocin平板上正常生長的菌落為可能高拷貝重組菌株；
提取可能的高拷貝重組酵母基因組DNA，以P1、P2為引物進行PCR反應，PCR產物用 1%瓊脂糖凝膠電泳觀察，擴增出250bp的條帶重組子定為陽性轉化子；
(4)陽性克隆的誘導表達
將篩選到的陽性重組菌單菌落接種于含100 μ g/mL Zeocin的YPD培養(yǎng)液中，振搖培養(yǎng)18個小時，取此菌液按4%體積比轉接于5 ml BMGY培養(yǎng)基中搖振培養(yǎng)18_24h 左右，0D_值為5-6，培養(yǎng)物直接轉接于25 ml BMMY培養(yǎng)基中，28°C繼續(xù)搖振培養(yǎng)，為了維持誘導表達，每隔24h補加100%甲醇使終濃度達1%, 48h后，4°C 5000 r/min離心IOmin, 收集上清，進行抑菌活性測定。進一步地，經上述制備方法得到的高產抗菌肽的陽性重組子(重組畢赤酵母菌株)，其高密度、高效表達的發(fā)酵罐生產工藝。所述的基因工程抗菌肽用于制備抗菌肽制劑，具體制備工藝如下將篩選得到的陽性重組子活化后按1%-10%接種量接種于三角瓶，28-30°C，200r/min搖床培養(yǎng)16_24h 后以5%-20%接種量接入發(fā)酵罐，在28-30 0C，500-1500r/min, pH值5. 0-6. 0，通氣量 0. 1-1. OVVMCIL發(fā)酵液Imin通入的氧氣量)，溶氧>20%情況下進行發(fā)酵，在培養(yǎng)18_24h后流加50%甘油4h，待溶氧突然升至100%時流加甲醇至發(fā)酵結束，整個發(fā)酵持續(xù)48-7 ；
發(fā)酵結束后原罐蒸汽100°C滅菌10-20min，放料，5000r/min離心lOmin，收集發(fā)酵上清即為抗菌肽半成品；
上述抗菌肽半成品經微濾、超濾、噴霧干燥或凍干生產的粉劑和以生化方法精制、純化后得到液體制劑，即為抗菌肽半成品衍生的基因工程抗菌肽制劑。更進一步地，上述基因工程抗菌肽作為畜禽飼料添加劑或畜禽疾病的預防和治療。本發(fā)明設計的新型抗菌肽與國內外同類產品相比，生產工藝簡單，生產成本低，抑菌能力強，且抗菌譜廣，極具市場前景。


圖1是重組酵母的PCR鑒定電泳照片，泳道M是DL2000 marker,泳道1是陽性轉化子；
圖2是不同誘導時間新型抗菌肽對金黃色葡萄球菌Cowanl的抑菌活性； 在圖2中，C:同體積的空載體重組酵母的誘導表達上清；0、1
(24h)、2 (48h),3 (72h)、4 (96h),5 (120h):不同誘導時間對其抑菌能力的影響。
具體實施例方式下面結合附圖和具體實施方式
對本發(fā)明作進一步詳細的說明。一種基因工程抗菌肽，所述抗菌肽具有如下氨基酸序列 KWKLFKKIAGPKFLHSKKKFN。實施例1
新型抗菌肽的制備方法
1)新型抗菌肽基因的設計與合成
根據(jù)GenBank中Cecropin A和Magainin II的氨基酸序列，對天蠶素A部分即雜合肽的N端沒有進行任何變動，保持了原天蠶素A的天然a螺旋結構，在鉸鏈區(qū)域內選用了 Cecropin A的鉸鏈區(qū)AGP作為可變區(qū)的氨基酸組成。并將Magainin N端近C端的非極性氨基酸丙氨酸A替換成帶正電荷極性氨基酸賴氨酸K，以便在不影響其a螺旋結構的基礎上，增強C端的正電荷數(shù)，使抗菌肽更容易更牢固的吸附在細菌細胞膜的表面。同時為了保證抗菌肽C末端的酰胺化，在C末端添加了天冬酰胺N。最后設計的雜合抗菌肽的氨基酸序列為
KffKLFKKIAGPKFLHSKKKFN
對設計新型抗菌肽氨基酸序列，選用畢赤酵母偏好密碼子，合成新型抗菌肽基因序列， 并在其N端引入Kex2酶切位點。兩端引入BioI和^CbaI酶切位點，以便于克隆入畢赤酵母表達載體中。另設計合成一對引物，用于重組載體及重組酵母菌的鑒定，上游引物位于新型抗菌肽基因區(qū)，下游引物位于畢赤酵母3’ AOX基因區(qū)，引物擴增長度約為250bp。Pl 5’ - AAGTGGAAATTGTTCAAGAA - 3’
P2 5’ - GCAAATGGCAT，TCTGACATCC -3'
2)抗菌肽表達載體的構建與鑒定
將含抗菌肽基因的載體和酵母表達載體均用損ol和損al雙酶切，酶切產物回收并連接，進行PCR鑒定、測序。3)重組陽性質粒轉化酵母菌株與篩選
陽性質粒經feci單酶切線性化后加入畢赤酵母感受態(tài)細胞懸液中。電轉化后均勻涂布于含100 μ g/mL Zeocin的YPDS選擇平板上，30°C孵育3 -5天。待YPDS平板上的陽性轉化子生長較大，將各轉化子依次點種至含kocin 200 μ g/mL, 500 μ g/mL, 1000 μ g/mL的 YPDS選擇平板，以在高濃度kocin平板上正常生長的菌落為可能高拷貝重組菌株。提取可能的高拷貝重組酵母基因組DNA。以P1、P2為引物進行PCR反應，PCR產物用1%瓊脂糖凝膠電泳觀察，能擴增出大約250bp的條帶重組子定為陽性轉化子。4)陽性克隆的誘導表達
5將篩選到的陽性重組菌單菌落接種于含100 μ g/mL Zeocin的YPD培養(yǎng)液中，28°C振搖培養(yǎng)18個小時。取此菌液按4%體積比轉接于5 ml BMGY培養(yǎng)基中，28°C搖振培養(yǎng)18_24h 左右，0D600值約為5-6。培養(yǎng)物直接轉接于25 ml BMMY培養(yǎng)基中，28°C繼續(xù)搖振培養(yǎng)。 為了維持誘導表達，每隔24h補加100%甲醇使終濃度達1%。48h后，4°C 5000 r/min離心 lOmin，收集上清，進行抑菌活性測定。實施例2
新型抗菌肽IOL規(guī)模發(fā)酵罐生產和制劑制備
1)抗菌肽將篩選得到的陽性重組子活化后按1%_10%接種量接種于三角瓶，28-30°C， 200r/min搖床培養(yǎng)16_24h后以5%_20%接種量接入IOL發(fā)酵罐(實裝培養(yǎng)基6L)，溫度 28-300C，轉速 500-1500r/min,培養(yǎng)基 pH 值 5. 0-6. 0，通氣量 0. 1-1. OVVM (IL 發(fā)酵液 Imin 通入的氧氣量)，溶氧>20%情況下進行發(fā)酵，在培養(yǎng)18-24h后流加50%甘油4h，待溶氧突然升至100%時流加甲醇至發(fā)酵結束，整個發(fā)酵持續(xù)48-72h。2)發(fā)酵結束后原罐蒸汽100°C滅菌10-20min，放料，5000r/min離心lOmin，收集發(fā)酵上清即為抗菌肽半成品。3)新型抗菌肽制劑
抗菌肽半成品經微濾、超濾、噴霧干燥、凍干等生產的粉劑和以生化方法精制、純化后得到液體制劑。上述基因工程抗菌肽作為畜禽飼料添加劑或畜禽疾病的預防和治療。以上所述，僅是本發(fā)明的較佳實施例而已，并非是對本發(fā)明作其它形式的限制，任何熟悉本專業(yè)的技術人員可能利用上述揭示的技術內容加以變更或改型為等同變化的等效實施例。但是凡是未脫離本發(fā)明技術方案內容，依據(jù)本發(fā)明的技術實質對以上實施例所作的任何簡單修改、等同變化與改型，仍屬于本發(fā)明技術方案的保護范圍。
權利要求
1.一種基因工程抗菌肽，其特征在于所述抗菌肽具有如下氨基酸序列 KWKLFKKIAGPKFLHSKKKFN。
2.—種權利要求1所述的基因工程抗菌肽的制備方法，其特征在于包括如下步驟(1)抗菌肽基因的合成根據(jù)cecropin A和magainin氨基酸序列，選用畢赤酵母偏好密碼子，合成抗菌肽基因序列，并在其N端引入Kex2酶切位點，兩端引入ZAoI和損^酶切位點，以便于克隆入畢赤酵母表達載體中，另設計合成一對引物Pl和P2，用于重組載體及重組酵母菌的鑒定，上游引物位于抗菌肽基因區(qū)，下游引物位于畢赤酵母3’ AOX基因區(qū)，引物擴增長度為250bp，Pl 5' - AAGTGGAAATTGTTCAAGAA - 3'P2 5’ - GCAAATGGCAT，TCTGACATCC -3，；(2)抗菌肽表達載體的構建與鑒定將含抗菌肽基因的載體和表達載體均用損ol和損al雙酶切，酶切產物回收并連接，進行PCR鑒定、測序；(3)重組陽性質粒轉化酵母菌株與篩選陽性質粒經feci單酶切線性化后加入畢赤酵母感受態(tài)細胞懸液中，電轉化后均勻涂布于含100yg/mL kocin的YPDS選擇平板上，30°C孵育3 _5天，待YPDS平板上的陽性轉化子生長較大，將各轉化子依次點種至含kocin 200 μ g/mL, 500 μ g/mL, 1000 μ g/mL的 YPDS選擇平板，以在高濃度kocin平板上正常生長的菌落為可能高拷貝重組菌株；提取可能的高拷貝重組酵母基因組DNA，以P1、P2為引物進行PCR反應，PCR產物用 1%瓊脂糖凝膠電泳觀察，擴增出250bp的條帶重組子定為陽性轉化子；(4)陽性克隆的誘導表達將篩選到的陽性重組菌單菌落接種于含100 μ g/mL Zeocin的YPD培養(yǎng)液中，振搖培養(yǎng)18個小時，取此菌液按4%體積比轉接于5 ml BMGY培養(yǎng)基中，搖振培養(yǎng)18_24h左右，OD600值為5-6，培養(yǎng)物直接轉接于25 ml BMMY培養(yǎng)基中，28°C繼續(xù)搖振培養(yǎng)，每隔24h 補加100%甲醇使終濃度達1%，4 ι后，4°C 5000 r/min離心lOmin，收集上清，進行抑菌活性測定。
3.權利要求1所述的基因工程抗菌肽用于制備抗菌肽制劑，具體制備工藝如下將篩選得到的陽性重組子活化后按1%-10%接種量接種于三角瓶，28-30°C，200r/min搖床培養(yǎng) 16-24h后以5%-20%接種量接入發(fā)酵罐，在^-30°C，500-1500r/min，pH值5. 0-6. 0，通氣量 0. 1-1. 0VVM,溶氧>20%情況下進行發(fā)酵，在培養(yǎng)18-24h后流加50%甘油4h，待溶氧突然升至100%時流加甲醇至發(fā)酵結束，整個發(fā)酵持續(xù)48-7 ；發(fā)酵結束后原罐蒸汽100°C滅菌10-20min，放料，5000r/min離心lOmin，收集發(fā)酵上清即為抗菌肽半成品；上述抗菌肽半成品經微濾、超濾、噴霧干燥或凍干生產的粉劑和以生化方法精制、純化后得到液體制劑，即為抗菌肽半成品衍生的基因工程抗菌肽制劑。
4.上述任一權利要求所述的基因工程抗菌肽作為畜禽飼料添加劑或畜禽疾病的預防和治療。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種基因工程抗菌肽及其制備方法和應用，可以解決現(xiàn)有技術存在的結構復雜、抗菌能力不足且抗菌譜不夠廣的問題。所述抗菌肽具有如下氨基酸序列KWKLFKKIAGPKFLHSKKKFN。本發(fā)明根據(jù)cecropinA和magainins的殺菌特點，自行設計了一種新型抗菌肽氨基酸序列。在此基礎上，選用畢赤酵母偏愛密碼子，人工合成新型抗菌肽基因，克隆于畢赤酵母中表達，獲得新型抗菌肽重組酵母菌株，并將發(fā)酵規(guī)模放大到發(fā)酵罐水平，實現(xiàn)抗菌肽產品的高密度發(fā)酵和高效表達。發(fā)酵液進一步純化后制成粉劑、液體等抗菌肽制劑?；蚬こ炭咕闹苿┛勺鳛樾笄蒿暳咸砑觿┗蛴糜谛笄菁膊〉念A防和治療。
文檔編號A61P31/00GK102199196SQ20101027131
公開日2011年9月28日 申請日期2010年9月3日 優(yōu)先權日2010年9月3日
發(fā)明者叢雁方, 凌紅麗, 王宏華, 蔣貽海, 賈德強 申請人:青島寶依特生物制藥有限公司, 青島康地恩藥業(yè)有限公司