專利名稱：一種雪蓮二氫黃酮醇-4-還原酶編碼基因與其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種雪蓮二氫黃酮醇-4-還原酶編碼基因與其應(yīng)用，尤其涉及一種雪 蓮二氫黃酮醇-4-還原酶及其編碼基因與應(yīng)用。
背景技術(shù)：
雪蓮花又名雪蓮，菊科風(fēng)毛菊屬。是民間常用的一類名貴藥用植物，屬多年生草本 植物。一般分布于海拔4，000米以上的高山流石灘上。早在《西北域記》和《相園小識》中， 就有關(guān)于雪蓮的記載。具有散寒除濕，活血通經(jīng)、強(qiáng)筋助陽、抗炎、鎮(zhèn)痛、收縮子宮等功能，民 間用于治療風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎，延緩衰老、動脈硬化、終止妊娠，婦女小腹冷痛、閉經(jīng)、胎衣不下、 麻疹不透、肺寒咳嗽、陽萎等癥。雪蓮花原生植物種類較多，雖然據(jù)中藥文獻(xiàn)記載均可同等 入藥，但其品質(zhì)有優(yōu)劣之分。據(jù)有關(guān)報道，在以上幾種雪蓮中銷售量最大的是新疆天山雪 蓮(雪荷花)(S. involucrata Kar. et Kir.)和水母雪蓮(S. medusa Maxim)。而水母雪蓮 (Saussurea medusa Maxim.)是藏藥“雪蓮”藥材的原植物，分布在我國青海、甘肅、西藏等 地。水母雪蓮是藏藥中的名貴藥材，具有散寒除濕、活血通絡(luò)、抗癌、抗炎及抗疲勞等功效， 可治療風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、婦女月經(jīng)不調(diào)、癰瘡腫毒和高山不適應(yīng)等多種疾病。雪蓮中含黃酮、生物堿、內(nèi)酯、留醇、揮發(fā)油、多糖等多種成分，其有效成分主要為 黃酮類化合物。黃酮類化合物的藥理作用包括抗癌、抗腫瘤，抗心腦血管疾病，鎮(zhèn)咳祛痰，抗 炎、鎮(zhèn)痛作用，免疫調(diào)節(jié)作用，雌性激素樣作用，抗菌及抗病毒作用，抗氧化、抗衰老作用，抗 輻射。如用來治療偏癱的雪蓮?fù)}丸、雪蓮注射液和治療腦動脈硬化與缺血性中風(fēng)的雪蓮 通脈口服液，都是以黃酮類化合物含量為質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的。雪蓮黃酮尤其是黃酮醇類藥理作用 顯著，如水母雪蓮黃酮成分對中樞神經(jīng)系統(tǒng)有抑制作用；以黃酮類化合物為有效成分的雪 蓮注射液治療偏頭痛效果顯著。黃酮類化合物的生物合成是通過苯丙烷類生物合成途徑實現(xiàn)的。是由1分子4-香 豆酰-CoA和3分子丙二酰-CoA在查耳酮合酶(CHS)催化下產(chǎn)生查耳酮(苯基苯乙烯酮) 開始的，查耳酮合酶是將苯丙烷類代謝途徑引向黃酮類合成的第一個最關(guān)鍵酶。二氫黃酮 醇-4-還原酶(DFR)是類黃酮合成途徑中通向花色素苷和原花色素的第一個關(guān)鍵酶基因。 由NADPH提供氫DFR可以將二氫黃酮醇的4位酮基還原形成羥基生成無色原花色素，無色 原花色素不穩(wěn)定進(jìn)一步被花色素苷元合成酶(ANS)和無色原花色素還原酶(LCR)等酶催化 生成花色素苷和原花色素。二氫黃酮醇-4-還原酶(DFR)與黃酮醇合成酶(FLS)競爭二氫 黃酮醇底物。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供二氫黃酮醇-4-還原酶蛋白及其編碼基因與應(yīng)用。本發(fā)明提供的一種蛋白質(zhì)，為二氫黃酮醇-4-還原酶，來源于水母雪蓮 (Saussureamedusa Maxim)，命名為SmDFR，該酶是如下1)或2)的蛋白質(zhì)1)由序列表中序列2所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)；
2)將序列2的氨基酸序列經(jīng)過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添 加且具有相同功能的由1)衍生的蛋白質(zhì)。其中，序列表中序列2由342個氨基酸殘基組成，所述一個或幾個氨基酸殘基的取 代和/或缺失和/或添加為不超過10個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加。為了使1)中的SmDFR便于純化，可在由序列表中序列2所示的氨基酸序列組成的 蛋白質(zhì)的氨基末端或羧基末端連接上如表1所示的標(biāo)簽。表1.標(biāo)簽的序列 上述2)中的SmDFR可人工合成，也可先合成其編碼基因，再進(jìn)行生物表達(dá)得到。上 述2)中的SmDFR的編碼基因可通過將序列表中序列1自5'末端第61-1089所示的DNA序 列中缺失一個或幾個氨基酸殘基的密碼子，和/或進(jìn)行一個或幾個堿基對的錯義突變，和/ 或在其5'端和/或3'端連上表1所示的標(biāo)簽的編碼序列得到。SmDFR蛋白的編碼基因也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。所述編碼基因為如下1)、2)、3)或4)或5)的所示的基因1)序列表中序列1所示的DNA分子；2)序列表中序列1自5，末端第61-1089位核苷酸所示的DNA分子；3)序列表中序列1自5’末端的第56位-1129位核苷酸所示的DNA分子；4)在嚴(yán)格條件下與1)或2)或3)限定的DNA分子雜交且具有相同功能的DNA分 子；5)與1)或2)或3)限定的DNA序列至少具有90%同源性且具有相同功能的DNA 分子。所述步驟5)中的基因，與1)或2)或3)的基因最好有95%以上的同源性。序列表中的序列1由1166個堿基組成，自5'末端第61-1089位為編碼區(qū)，編碼 序列表中序列2的蛋白質(zhì)。上述嚴(yán)格條件可為在6XSSC，0. 5% SDS的溶液中，在68°C下雜 交，然后用 2 X SSC, 0. 1% SDS 和 1XSSC，0. 1% SDS 各洗膜一次。含有上述SmDFR編碼基因的重組載體、轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系、重組菌或表達(dá)盒也屬于本 發(fā)明的保護(hù)范圍。所述重組載體為在載體pYES2的Hind III和EcoR I位點間插入所述編碼基因得到的重組載體。所述重組菌為將所述的重組載體導(dǎo)入宿主菌得到的重組菌。所述宿主菌為釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)?？捎矛F(xiàn)有的植物表達(dá)載體構(gòu)建含有反義SmDFR編碼基因的重組表達(dá)載體。所 述植物表達(dá)載體包括雙元農(nóng)桿菌載體和可用于植物微彈轟擊的載體等，如PCAMBIA3301、 pCAMBIA1300、pBI121、pBinl9、pCAMBIA2301、pCAMBIA1301-UbiN 或其它衍生植物表達(dá)載體。 攜帶有本發(fā)明的SmDFR編碼基因的植物表達(dá)載體可通過Ti質(zhì)粒、Ri質(zhì)粒、植物病毒載體、 直接DNA轉(zhuǎn)化、顯微注射、電導(dǎo)、農(nóng)桿菌介導(dǎo)等常規(guī)生物學(xué)方法轉(zhuǎn)化到植物細(xì)胞或組織中。使用SmDFR編碼基因構(gòu)建重組植物表達(dá)載體時，在其轉(zhuǎn)錄起始核苷酸前可加上任 何一種增強(qiáng)型、組成型、組織特異型或誘導(dǎo)型啟動子，如花椰菜花葉病毒(CAMV) 35S啟動 子、泛生素基因Ubiquitin啟動子(pUbi)等，它們可單獨使用或與其它的植物啟動子結(jié)合 使用；此外，使用本發(fā)明的SmDFR編碼基因構(gòu)建植物表達(dá)載體時，還可使用增強(qiáng)子，包括翻 譯增強(qiáng)子或轉(zhuǎn)錄增強(qiáng)子，這些增強(qiáng)子區(qū)域可以是ATG起始密碼子或鄰接區(qū)域起始密碼子 等，但必需與編碼序列的閱讀框相同，以保證整個序列的正確翻譯。所述翻譯控制信號和起 始密碼子的來源是廣泛的，可以是天然的，也可以是合成的。翻譯起始區(qū)域可以來自轉(zhuǎn)錄起 始區(qū)域或結(jié)構(gòu)基因。為了便于對轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞或植物進(jìn)行鑒定及篩選，可對所用植物表達(dá)載體進(jìn)行 加工，如加入可在植物中表達(dá)可產(chǎn)生顏色變化的酶或發(fā)光化合物的基因(GUS基因、螢光素 酶基因等)、具有抗性的抗生素標(biāo)記物(慶大霉素標(biāo)記物、卡那霉素標(biāo)記物等)或是抗化學(xué) 試劑標(biāo)記基因(如抗除莠劑基因)等。上述蛋白質(zhì)SmDFR在體外還原黃酮類化合物中的應(yīng)用，或上述編碼基因SmDFR在 體外還原黃酮類化合物中的應(yīng)用也是本發(fā)明保護(hù)的范圍；所述黃酮類化合物優(yōu)選為二氫黃 酮醇和3-去羥基二氫黃酮醇；所述二氫黃酮醇優(yōu)選為二氫槲皮素，所述3-去羥基二氫黃酮 醇優(yōu)選為圣草酚。本發(fā)明的另一個目的是提供培育黃酮醇和/或黃酮類含量提高的轉(zhuǎn)基因植物的 方法。本發(fā)明提供的方法是是將目的植物中的所述蛋白的編碼基因的功能喪失，得到轉(zhuǎn) 基因植物；所述轉(zhuǎn)基因植物中黃酮醇醇和/或黃酮類含量高于所述目的植物；將目的植物中的所述蛋白的編碼基因的功能喪失的方法是通過向其中轉(zhuǎn)入重組 表達(dá)載體實現(xiàn)的；所述重組表達(dá)載體是向PCAMBIA1302載體的多克隆位點中插入DNA片段 得到的，所述DNA片段由CaMV 35S啟動子、所述蛋白的編碼基因的反向片段和Nos終止子 依次連接而成；所述權(quán)利要求1所述蛋白的編碼基因的反向片段是序列表中序列1的自5’末端 第56-1129位核苷酸所示DNA片段的反向互補(bǔ)片段。所述CaMV 35S啟動子的序列為genbank V00140. 1中第1-364位核苷酸；所述Nos 終止子啟動子序列，genbank AJ007623. 1中第1-318位核苷酸。所述目的植物為雙子葉植物，所述雙子葉植物優(yōu)選為新疆雪蓮；所述黃酮醇為蘆丁、楊梅酮、莰菲醇和/或槲皮素，所述黃酮類為芹菜素。本發(fā)明的實驗證明，通過構(gòu)建雪蓮cDNA文庫，并利用此文庫通過簡并引物篩選到水母雪蓮SmDFR的編碼基因，經(jīng)過酵母表達(dá)和體外酶促反應(yīng)所克隆到的基因是有功能的二 氫黃酮醇-4-還原酶的編碼基因，利用特異引物通過PCR克隆了 SmDFR的編碼基因，并構(gòu)建 了含有SmDFR的重組表達(dá)載體，獲得了轉(zhuǎn)反義SmDFR新疆雪蓮。轉(zhuǎn)反義SmDFR新疆雪蓮黃 酮醇的測定結(jié)果表明，轉(zhuǎn)反義SmDFR新疆雪蓮與轉(zhuǎn)空載體的新疆雪蓮相比，蘆丁和楊梅酮 等黃酮醇含量有明顯的提高。說明將反義SmDFR導(dǎo)入雪蓮中，可以獲得黃酮醇含量升高的 雪蓮。本發(fā)明的黃酮醇合成相關(guān)蛋白及其編碼基因?qū)鉀Q雪蓮野生資源短缺的問題有重要 價值。


圖1為水母雪蓮SmDFR體外催化二氫槲皮素圖2為水母雪蓮SmDFR體外催化圣草酚圖3為新疆雪蓮胚性愈傷的轉(zhuǎn)化和轉(zhuǎn)基因植株再生圖4為反義轉(zhuǎn)基因雪蓮PCR檢測圖5為新疆雪蓮中類黃酮的HPLC圖譜。
具體實施例方式下述實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法。下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。實施例1、雪蓮二氫黃酮醇-4-還原酶基因(SmDFR)的克隆與體外表達(dá)1.雪蓮cDNA文庫的構(gòu)建建庫所用水母雪蓮1-15天愈傷組織紅色系，通過如下方法誘導(dǎo)用水 母雪蓮(Saussurea medusa Maxim ；Xie H H, Wang Τ, Matsuda H, et al. 2005. Bioactiveconstituents from Chinese natural medicines XV'inhibitory effect on aldosereductase and structures of Saussureosides A and B from Saussurea medusa. ChemPharm Bull,53(11) =1416-1422 ；公眾可以從中國科學(xué)院植物研究所獲得。)的莖與葉 片作外植體，在含有0. 2mg/L芐氨基嘌呤、2mg/L萘乙酸、30g/L蔗糖，pH值5. 8的MS培養(yǎng) 基上誘導(dǎo)出愈傷組織，并在含有2mg/L萘乙酸、0. 5mg/L芐氨基嘌呤和30g/L蔗糖的MS培養(yǎng) 基中，25士 1°C，16h光照/8h黑暗下培養(yǎng)、繼代擴(kuò)繁獲得紅色系愈傷組織。分別稱取培養(yǎng)1-14天的紅色系愈傷組織各50mg，共計700mg混合樣品于研缽 中，用TRIZOL Reagent (購自GIBCO公司)提取總RNA。取1-3 μ 1總RNA樣品，用SMART cDNALibrary Construction Kit (Catlog# :K1051_1) (CL0NTECH)自帶的 CDSIII 酶切位點 的PolyT引物合成第一鏈cDNA。采用LD PCR(long distance PCR)擴(kuò)增用cDNA第一鏈以 獲得雙鏈cDNA。加入蛋白酶K消化去除cDNA中的Taq酶，再用Sfi I酶切cDNA，然后用 CHR0MASPIN-400 (Catlog# :636076，Clontech)對 cDNA 進(jìn)行大小分離。收集大小> 500bp 的cDNA，將收集到的cDNA與λ TripIEx2 Vector (Promega)連接，連接好的DNA由包裝蛋白 Packagene Lambda DNA Packaging System(購自 Promega 公司)包裝后，力口入明膠使終濃 度為0. 01%，DMSO終濃度為7%，可以在-70°C下保存1年滴度不變。將文庫分成20個亞 文庫，避免反復(fù)凍溶，每個亞文庫來自于在原始文庫擴(kuò)增時不同培養(yǎng)皿的回收物，其組成可能不同，可保存，這樣就完成了雪蓮噬菌體文庫構(gòu)建。2.從雪蓮cDNA文庫篩選雪蓮二氫黃酮醇_4_還原酶基因cDNA根據(jù)Genbank上已經(jīng)登陸的近源物種(主要為菊科)的DFR的基因核苷酸序列的 保守區(qū)域(共69aa)，用軟件DNAMAN4. 0 (美國Lyrmon Biosoft公司)設(shè)計合成上下游部分 簡并引物DFRgl :5，-GAG AAT GAA GT(A/G)AT(A/C/T)AA(A/G)CC-3，，DFRg2 :5，-AAA ATA CAT CCA TCC(A/G/C/T)GT CAT-3，。每個亞文庫取1 μ L為模板，以DFRgl、DFRg2為引物，25 μ L反應(yīng)體系，先于95°C加 熱IOmin裂解噬菌體，加入PCR擴(kuò)增混合物，進(jìn)行PCR擴(kuò)增。IOXPCR Buffer2. 5 μ 1dNTPs0· 5 μ 1Taq (北京鼎國)0. 2 μ 1Primer DFRgl0. 5 μ 1Primer DFRg20. 5 μ 1Model3. 0 μ 1ddH2017. 8μ 1PCR 程序模板(IX λ稀釋緩沖液洗脫的噬菌體)95°C預(yù)變性 IOmin ；94"C，4min (熱啟動 PCR)
94 °C,Imin
52°C’Imin I 40 cycles
72 °C,Imin 72 °C,IOmin 選取信號最強(qiáng)的陽性池，作10倍梯度稀釋到IO6倍，每個梯度稀釋物取1 μ L為模 板，按同樣程序進(jìn)行PCR檢測，確定在下一級篩選時本級陽性池的最大稀釋倍數(shù)Ν(能夠檢 測到陽性信號的極限稀釋倍數(shù))。將選中的初級陽性池按其最大稀釋倍數(shù)N稀釋，取IyL 稀釋物感染大腸桿菌并鋪制10個9cm LB平板，培養(yǎng)并回收洗脫物。從平板上挑取生長并 分離良好的單噬菌斑，置于緩沖液中，渦旋震蕩，稍離心，于4°C冰箱過夜。取3 μ L洗脫物為 模板，PCR程序擴(kuò)增檢測，獲得陽性單克隆，陽性克隆記作pTripIEX2-SmDFR。
Primer VEC20．5 u l
Model3．o u l
ddH。017．8 u l
PCR程序
模板(1×入稀釋緩沖液洗脫的噬菌體)95℃預(yù)變性lOmin；
94℃，4min(熱啟動PCR)；
94℃．1min＼50℃，lmin」 40 cycles72℃．1min』
72℃，lOmin
PCR產(chǎn)物電泳檢測，克隆得到大小大于1000bp的片段，將該P(yáng)CR產(chǎn)物測序，結(jié)果該P(yáng)CR產(chǎn)物具有序列表中序列l(wèi)(基因的cDNA)。將該P(yáng)CR產(chǎn)物的基因命名為SmDFR，將該基因編碼的蛋白命名為SmDFR，該蛋白的氨基酸序列為序列表中的序列2。SmDFR的開放閱讀框為序列l(wèi)的第6卜1089位核苷酸。對采用BLAST相似性分析，通過比較得知，SmDFR全長cDNA序列與cDNA翻譯后的 氨基酸序列與同屬菊科的植物相似度很高，其中斑點矢車菊(Centaurea maculosa)中的 DFR基因和氨基酸序列的相似性最高，達(dá)到92%。表明，從水母雪蓮中克隆到的SmDFR為二 氫黃酮醇-4-還原酶的編碼基因。5. SmDFR的體外表達(dá)與酶促反應(yīng)產(chǎn)物鑒定1) pYES2-SmDFR表達(dá)載體的構(gòu)建提取水母雪蓮的RNA，反轉(zhuǎn)錄成cDNA，以cDNA為模板，用引物SmDFR-Yf和 SmDFR-Yr擴(kuò)增，引物SmDFR-Yf和SmDFR-Yr的兩端分別引入Hind III和EcoRI的識別位 點，引物的序列如下SmDFR-Yf 5' -TCC AAG CTT ACAACATGGTACAAGATTCTC-3，SmDFR-Yr :5’ -GCG GAA TTC AGTACAATGAGACATAAATGT-3，PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測，回收并純化1092bp的DNA片段，用Hind III 和EcoRI酶切該片段，瓊脂糖凝膠電泳回收酶切后的片段與經(jīng)同樣雙酶切的pYES2載 體(Invitrogen, Cat. no :v82520)連接，得到重組質(zhì)粒pYES2_SmDFR。得到的重組質(zhì)粒 pYES2-SmDFR轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH-5 α，經(jīng)過氨芐青霉素抗性篩選挑去單菌落用5ml液體LB培 養(yǎng)基培養(yǎng)過夜提取質(zhì)粒，用HindIII和EcoRI酶切質(zhì)粒DNA鑒定，得到1092bp的片段為陽 性pYES2-SmDFR，將陽性pYES2_SmDFR送去測序，測序結(jié)果為該陽性質(zhì)粒含有序列表中序 列1的自5，末端的第56位-1129位核苷酸(含有SmDFR)，證明為陽性pYES2_SmDFR。2)pYES2_SmDFR 轉(zhuǎn)化釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae) INVScl 和蛋白質(zhì)誘 導(dǎo)表達(dá)將上述獲得的陽性pYES2_SmDFR采用LiAC法轉(zhuǎn)入釀酒酵母 (Saccharomycescerevisiae) INVScl (Invitrogen, Cat. no :C81000)，得至Ij重組菌 INVScl/ pYES2-SmDFR。將從重組菌中提取的質(zhì)粒為模板，用引物SmDFR-Yf和SmDFR-Yr擴(kuò)增驗證得 到目的片段(1092bp，序列1的自5，末端的第56位-1129位核苷酸)，將該重組菌命名為陽性重組菌 INVScl/pYES2-SmDFR。將該陽性重組菌INVScl/pYES2_SmDFR進(jìn)行蛋白質(zhì)半乳糖誘導(dǎo)表達(dá)，按照 Invitrogen公司的pYES2產(chǎn)品說明書，玻璃珠破壁后提取酵母總蛋白，獲得SmDFR蛋白粗提 液。采用上述的方法將空載體pYES2載體轉(zhuǎn)入釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae) INVScl中，獲得的INVScl/pYES2，同樣誘導(dǎo)表達(dá)，得到空載體的蛋白粗提液。3)體外酶促反應(yīng)以二氫槲皮素(Dihydroquercetin，CAS24198-97-8，SIGMA-ALDRICH T4512-25MG) 和圣草酚(3-Deoxydihydroquercetin，CAS552-58-9，上海亞培生物科技有限公司)為底
物，反應(yīng)液總體積500 μ 1，其中包括IOOmM Tris-HCl 緩沖液(ρΗ = 7. 5)370 μ 1SmDFR蛋白質(zhì)粗提液(0. 15μ g μ Γ1，由上述獲得。)70 μ 1IOmM NADPH (溶于 IOOmM Tris-HCl，ρΗ = 7. 5)50 μ 110 μ gy r1 底物(溶于甲醇)10 μ 11.將反應(yīng)液置于1. 5ml離心管中30°C水浴中保溫4h。2.反應(yīng)液用400 μ 1乙酸乙酯萃取兩遍，兩次上清乙酸乙酯相合并轉(zhuǎn)移到一個新 的離心管中，敞口放置于50°C烘箱中將乙酸乙酯蒸干。3.殘留物用50 μ 1正丁醇鹽酸(95 :5，ν/ν)酶促產(chǎn)物的重新溶解，95 °C煮沸 5min，用于 HPLC-MS 鑒定。4)體外酶促反應(yīng)產(chǎn)物的HPLC-MS鑒定用Agilent 1100 HPLC/MSD Trap VL 鑒定產(chǎn)物。色譜柱Z0RBAX Eclipse XDB-C18,4. 6 X 150mm, 5 μ m(Agilent Co, USA)，柱溫 30°C，進(jìn)樣量 10 μ 1，流速 Iml mirT1。流 動相溶液A乙腈，溶液B ρΗ 3. 0三氟乙酸(TFA)水。洗脫程序0-20min =A 90% -10%, B 10% -90%o 檢測波長 214nm。質(zhì)譜參數(shù)電噴霧(ESI)離子阱，氣化溫度325°C，載氣(N2)流速10. OlmirT1，載氣 壓力 40psi，八極射頻振幅(octopole RF amplitude) 150vpp, skim 1 voltage34V, skim 2 voltage 6V, capillary exit 107V, cap exit offset 73V，MSn 碰撞能量 40%。分析采用 正離子選擇模式(m/z M+H+)，全離子掃描，離子選擇范圍m/z50-1000。結(jié)果如圖1和圖2所示，圖1中A為水母雪蓮SmDFR體外催化二氫槲皮素后的總離 子圖，箭頭所指為底物；B.生成的產(chǎn)物矢車菊素苷元(箭頭所指)(m/z 287) ；C.矢車菊素 苷元的質(zhì)譜圖譜。圖2中A.水母雪蓮SmDFR體外催化圣草酚后的總離子圖，箭頭所指為底 物；B.生成的產(chǎn)物(箭頭所指)(m/z 271) ；C.產(chǎn)物的質(zhì)譜圖譜。從圖1可以的產(chǎn)物的出峰 順序和質(zhì)譜圖顯示，底物二氫槲皮素在體外被SmDFR還原后又被化學(xué)催化生成了矢車菊素 苷元，二氫槲皮素為黃酮醇的一種；從圖2的產(chǎn)物的出峰順序和質(zhì)譜圖顯示，底物圣草酚在 體外被SmDFR還原后又被化學(xué)催化生成了(J-Leucofisetinidin，圣草酚為3-去羥基二氫 黃酮醇的一種。表明SmDFR可以體外催化二氫黃酮醇底物生成相應(yīng)的無色花色素，SmDFR具 有二氫黃酮醇-4-還原酶的活性和黃烷酮還原酶(FlavanonM-reductase，F(xiàn)NR)活性(二 氫槲皮素是二氫黃酮醇-4-還原酶最常用的底物，SmDFR能夠催化二氫槲皮素就表明它具有二氫黃酮醇-4-還原酶功能，此外SmDFR還可能具有黃烷酮還原酶功能，以3-去羥基二 氫黃酮醇，即黃烷酮為底物，生成另外一類化合物。)。以上述獲得的空載體的蛋白粗提液為對照進(jìn)行檢測，結(jié)果為沒有活性。實施例2應(yīng)用反義水母雪蓮二氫黃酮醇-4-還原酶基因提高新疆雪蓮黃酮醇含量1. pCAMBIA1301-反義SmDFR表達(dá)載體的構(gòu)建以實施例獲得的水母雪蓮的cDNA為模板，引物DFRa 1和DFRa2的兩端分別弓丨 Λ BamHI和Sac I的識別位點，引物DFRal和DFRa2的序列如下DFRal :5，-TAC gag ctc ACAACA TGG TAC AAG ATT CTC-3’ ；DFRa2 :5’ -GCG gga tcc AGT ACA ATG AGA CAT AAATGT-3'；PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測，回收并純化DNA片段，用Sac I和BamHI酶切該 片段，瓊脂糖凝膠電泳回收酶切后的片段與經(jīng)同樣雙酶切的PBI121 (Clontech)載體連接， 將SmDFR cDNA反向插入到pBI121載體CaMV 35S啟動子和Nos終止子之間，得到重組質(zhì)粒 PBI121-反義SmDFR。將重組質(zhì)粒pBI 121-反義SmDFR轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH-5 α，卡那霉素篩選 重組子，提取質(zhì)粒用Sac I和BamHI雙酶切鑒定，將陽性重組子送去測序，結(jié)果為得到含有 SmDFR cDNA反向片段的陽性重組子。將pBI121-反義SmDFR載體經(jīng)EcoRI和PstI酶切，將反義SmDFR連同CaMV 35S 啟動子和Nos終止子一起切下，產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測，回收并純化片段(2100bp)，將 該片段和經(jīng) EcoRI 和 PstI 酶切的 pCAMBIA1302 (Cambia Institute, Austrilia)載體連接， 獲得重組表達(dá)載體PCAMBIA1302-反義SmDFR。所述CaMV 35S啟動子的序列為genbank V00140. 1中第1-364位核苷酸；所述Nos 終止子啟動子序列，genbank AJ007623. 1中第1-318位核苷酸。將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH-5 α，卡那霉素和潮霉素篩選重組子，提取質(zhì)粒 用EcoRI和PstI酶切鑒定。用液氮凍融法將pCAMBIA1302-反義SmDFR導(dǎo)入農(nóng)桿菌 ΕΗΑ105 (Invitrogen)，獲得重組子，用卡那霉素、潮霉素和利福平篩選重組子，以單菌落為 模板，CaMV 35S 引物(5' -CCCACTATCCTTCG-3‘)和 DFRal 為引物 PCR 鑒定，得到 IlOObp 的片段為陽性單菌落，命名為EHA105/pCAMBIA1302-反義SmDFR。2.新疆雪蓮胚性愈傷的誘導(dǎo)If ifi H ^ (Saussurea involucrata Kar. et Kir. ， Yi Τ, Chen H B, Zhao Z Ζ, etal. 2009. Identification and determination of the major constituents in thetraditional uighur medicinal plant Saussurea involucrata by LC-DAD-MS. Chromatographia,69 537-542 ；公眾可以從中國科學(xué)院植物研究所獲得。)種子的無菌處 理新疆雪蓮種子于0. 3%的次氯酸鈉溶液中除菌20min，無菌水沖洗5_6次，倒出無菌水 除菌后的新疆雪蓮種子用鑷子和接種針小心剝?nèi)シN皮，置于MS+5mg/L 2，4-D+O. 5mg/L6_BA 的培養(yǎng)基上誘導(dǎo)愈傷組織，愈傷組織生長良好后于MS+3mg/L 2,4-D+O. 5mg/L 6-BA的培養(yǎng) 基上繼代培養(yǎng)。新疆雪蓮幼胚在誘導(dǎo)培養(yǎng)基上培養(yǎng)40天，每20天繼代一次，可長出色澤淡 黃的愈傷組織。3.轉(zhuǎn)反義SmDFR新疆雪蓮的獲得挑取EHA105/pCAMBIA1302-反義SmDFR的單菌落，將其接種到Y(jié)EB液體培養(yǎng)基中 (含 Kan (卡那霉素，Kanamycin) 100mg/L, Hyg (潮霉素，Hygromycin B) 50mg/L, Rif (利福
10平，Rifampicin) 50mg/L)，28 °C振蕩培養(yǎng)過夜。吸取200 μ 1過夜培養(yǎng)的農(nóng)桿菌(ΕΗΑ105/ PCAMBIA1302-反義 SmDFR)菌液于 20ml YEB 液體培養(yǎng)基中(含 Kanl00mg/L，Hyg50mg/L, Rif50mg/L)，28°C快速振蕩培養(yǎng)生長至對數(shù)期(0D600 = 0. 6)，約3_4h。室溫6000rpm離心 5min收集菌體，用MStl液體培養(yǎng)基洗一次收集的菌體，確保培養(yǎng)基中不含抗生素，然后將菌 體重新懸浮于IOml MStl液體培養(yǎng)基中待用。挑選生長良好的新疆雪蓮愈傷組織，用灼燒后的鑷子取出，置于準(zhǔn)備好的菌液中， 浸染30min，倒出菌液，愈傷移至MS+3mg/L 2，4-D+O. 5mg/L 6-BA培養(yǎng)基上暗培養(yǎng)48小時 (為防止菌量過多，干擾后期除菌，可在培養(yǎng)基表面放一層濾紙)。最后將材料移至MS+3mg/ L 2,4-D+O. 5mg/L 6-BA+Hyg40mg/L+Cef 400mg/L培養(yǎng)基上篩選培養(yǎng)。20天后可看到綠色 愈傷長出，將篩選出的生長良好的綠色愈傷接種于MS+lmg/L 6-BA+O. Img/LNAA+Hyg40mg/L 的培養(yǎng)基上誘導(dǎo)出17株轉(zhuǎn)反義SmDFR新疆雪蓮苗。新疆雪蓮從胚性愈傷到分化出幼苗的過程見圖3所示。采用相同的方法將空載體PCAMBIA1302轉(zhuǎn)入新疆雪蓮中，獲得轉(zhuǎn)空載體新疆雪蓮。4.轉(zhuǎn)基因新疆雪蓮的檢測將上述獲得的轉(zhuǎn)反義SmDFR新疆雪蓮苗用CTAB法提取基因組DNA，以基因組DNA 為模板，以CaMV 35S引物和DFRal為引物PCR檢測水母雪蓮SmDFR cDNA是否已經(jīng)整合到 新疆雪蓮基因組中，檢測結(jié)果如圖4所示，其中C+ 陽性對照，以pCAMBIA1302-反義SmDFR 為模板；C-陰性對照，以野生型新疆雪蓮基因組DNA為模板；M :2000PlusDNA Marker ；A3、 A5、A6、A8、All、A12、A13、A16、A22、A23、A24、A26、A27、A30、A24、A36、A39 均為 TO 代轉(zhuǎn)反 義SmDFR新疆雪蓮苗，以TO代轉(zhuǎn)反義SmDFR新疆雪蓮基因組DNA為模板。從圖中可以看出， 獲得17株陽性轉(zhuǎn)反義SmDFR新疆雪蓮苗，表明SmDFRcDNA已經(jīng)整合到新疆雪蓮基因組中。5.轉(zhuǎn)基因新疆雪蓮黃酮醇含量的檢測1)取轉(zhuǎn)反義SmDFR新疆雪蓮苗繼代后獲得轉(zhuǎn)反義SndFR新疆雪蓮苗系，IOd取樣， 每個系四瓶，從每瓶中挑選生長健壯的轉(zhuǎn)反義SmDFR新疆雪蓮苗，去除干葉葉黃葉和底部 愈傷，每瓶選取組培苗葉片鮮重IOOmg左右，放入研缽中在液氮中研磨成粉末，按照每IOmg 鮮重葉片加入100 μ 1 80%甲醇(ν/ν)，轉(zhuǎn)入2ml離心管中，充分混勻，室溫下提取24h，其間 每隔幾小時上下翻動離心管一次。2)將提取液室溫下12，OOOrpm離心lOmin，小心將上清液收集到一個新的離心管 中，所得的沉淀重新用原提取液體積一半的80%甲醇(ν/ν)室溫下提取24h。3)室溫下，12000rpm離心IOmin收集上清，將兩次上清液合并，用0.22 μ m濾膜過 濾后用于HPLC檢測。HPLC 檢測參數(shù)色譜柱ZORBAX Eclipse XDB-C18，2. 1 X 150mm，5 μ m(Agilent Co，USA)，柱溫30°C，進(jìn)樣量5 μ 1，流速0.25ml mirT1。流動相溶液A 0.20%磷酸水溶液，溶 液B 甲醇。洗脫程序:0-3min,95%A,5%B ；3_20min，A 95% -65%,B 5% -35%;20-30min, A 65 % -60 %, B 35 % -40 % ；30_38min :A 60 %, B 40 % ；38_45min :A 60 % -80 %, B 40% -20% ；45-49min :A 80%, B 20% ；49_50min :A 80% -95%, B 20% -5% ；50_70min A 95%，B5%。檢測波長 270nm。在如上色譜條件下，類黃酮標(biāo)準(zhǔn)品(芹菜素SIGMA-ALDRICH 460475 ；莰菲醇 SIGMA-ALDRICH K1003 ；槲皮素 SIGMA-ALDRICH Q0125 ；楊梅酮 M6760 ；蘆 丁 SIGMA-ALDRICHR5143)的保留時間如圖5A所示。檢測樣品中各種黃酮醇的保留時間分別 是蘆丁 27. 6min,楊梅酮29. 2min,槲皮素32. 3min,莰菲醇34. 7min ；另外黃酮類中的芹菜素 (莰菲醇的衍生物)的保留時間為35. lmin。以轉(zhuǎn)空載體新疆雪蓮和野生型(新疆雪蓮)為對照，實驗重復(fù)四次，結(jié)果取平均 值。結(jié)果如圖5所示，其中A 類黃酮標(biāo)準(zhǔn)品；B SmDFR-A39 (編號為A39的轉(zhuǎn)反義 SmDFR新疆雪蓮苗株系)；C 野生型對照。SmDFR-A39的保留時間如圖5B所示，檢測樣品 中各種黃酮醇的保留時間分別是蘆丁 27. 5min,楊梅酮28. 9min,槲皮素32. 8min,莰菲醇 34. 4min;另外黃酮類中的芹菜素(莰菲醇的衍生物)的保留時間為35. 3min。野生型對照 的保留時間如圖5C所示，檢測樣品中各種黃酮醇的保留時間分別是蘆丁 27. 6min，楊梅酮 29. lmin，槲皮素 31. 7min。圖中顯示SmDFR_A39中蘆丁、楊梅酮等黃酮醇和/或黃酮類的含量較野生型 對照顯著升高，具體計算可知，野生型對照的蘆丁為25. 16士6. 68 μ g/g鮮重、楊梅酮為 22. 43士4. 57 μ g/g 鮮重，莰菲醇為 9. 23士0. 49 μ g/g 鮮重、槲皮素為 0. 78士 1. 35 μ g/g 鮮 重、芹菜素為3. 68士 1. 19 μ g/g鮮重，SmDFR-A39的蘆丁為71. 15士 17. 64 μ g/g鮮重、楊梅酮 為 54. 30士9. 81 μ g/g 鮮重、莰菲醇為 13. 41 士4. 07 μ g/g 鮮重、槲皮素為 10. 76士2.71 μ g/ g鮮重和芹菜素16. 47士 12. 07 μ g/g鮮重。轉(zhuǎn)空載體新疆雪蓮與野生型對照的結(jié)果無顯著差別。表明導(dǎo)入反義水母雪蓮SmDFR基因使新疆雪蓮中黃酮醇含量增加。將黃酮代謝途 徑中的有效基因?qū)氲叫陆┥徶?，然后再生成高產(chǎn)黃酮轉(zhuǎn)基因苗，進(jìn)行人工栽培，將是解 決雪蓮野生資源短缺的有效途徑。
權(quán)利要求
一種蛋白質(zhì)，是如下1)或2)的蛋白質(zhì)1)由序列表中序列2所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)；2)將序列2的氨基酸序列經(jīng)過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的由1)衍生的蛋白質(zhì)。
2.權(quán)利要求1所述蛋白質(zhì)的編碼基因。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述編碼基因，其特征在于所述編碼基因為如下1)、2)、3)或 4)或5)的所示的基因1)序列表中序列1所示的DNA分子；2)序列表中序列1自5，末端第61-1089位核苷酸所示的DNA分子；3)序列表中序列1自5’末端的第56位-1129位核苷酸所示的DNA分子；4)在嚴(yán)格條件下與1)或2)或3)限定的DNA分子雜交且具有相同功能的DNA分子；5)與1)或2)或3)限定的DNA序列至少具有90%同源性且具有相同功能的DNA分子。
4.含有權(quán)利要求2或3所述編碼基因的重組載體、轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系、重組菌或表達(dá)盒。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的重組載體或重組菌，其特征在于所述重組載體為在載體 PYES2的多克隆位點插入權(quán)利要求2或3所述編碼基因得到的重組載體；所述重組菌為將權(quán)利要求4所述的重組載體導(dǎo)入宿主菌得到的重組菌；所述宿主菌優(yōu)選為釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)。
6.權(quán)利要求1所述蛋白質(zhì)在體外還原黃酮類化合物中的應(yīng)用，或權(quán)利要求2或3所 述編碼基因在體外還原黃酮類化合物中的應(yīng)用；所述黃酮類化合物優(yōu)選為二氫黃酮醇和 3-去羥基二氫黃酮醇；所述二氫黃酮醇優(yōu)選為二氫槲皮素，所述3-去羥基二氫黃酮醇優(yōu)選 為圣草酚。
7.一種培育黃酮醇和/或黃酮類含量提高的轉(zhuǎn)基因植物方法，是將目的植物中的權(quán)利 要求1所述蛋白的編碼基因的功能喪失，得到轉(zhuǎn)基因植物；所述轉(zhuǎn)基因植物中黃酮醇和/或 黃酮類含量高于所述目的植物。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的方法，其特征在于將目的植物中的權(quán)利要求1所述蛋白的 編碼基因的功能喪失的方法是通過向其中轉(zhuǎn)入重組表達(dá)載體實現(xiàn)的；所述重組表達(dá)載體是 向PCAMBIA1302載體的多克隆位點中插入DNA片段得到的，所述DNA片段由CaMV 35S啟動 子、權(quán)利要求1所述蛋白的編碼基因的反向片段和Nos終止子依次連接而成；所述權(quán)利要求1所述蛋白的編碼基因的反向片段是序列表中序列1的自5’末端第 56-1129位核苷酸所示DNA片段的反向互補(bǔ)片段。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的方法，其特征在于所述目的植物為雙子葉植物，所述雙子葉 植物優(yōu)選為新疆雪蓮；所述黃酮醇為蘆丁、楊梅酮、莰菲醇和/或槲皮素；所述黃酮類為芹 菜素。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種雪蓮二氫黃酮醇-4-還原酶編碼基因與其應(yīng)用。本發(fā)明提供的一種蛋白質(zhì)，為二氫黃酮醇-4-還原酶，命名為SmDFR，該酶是如下1)或2)的蛋白質(zhì)1)由序列表中序列2所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)；2)將序列2的氨基酸序列經(jīng)過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的由1)衍生的蛋白質(zhì)。本發(fā)明的實驗證明，通過構(gòu)建雪蓮cDNA文庫，并利用此文庫通過簡并引物篩選到水母雪蓮SmDFR的編碼基因，經(jīng)過酵母表達(dá)和體外酶促反應(yīng)所克隆到的基因是有功能的二氫黃酮醇-4-還原酶的編碼基因。本發(fā)明的黃酮醇合成相關(guān)蛋白及其編碼基因?qū)鉀Q雪蓮野生資源短缺的問題有重要價值。
文檔編號C12N15/113GK101921735SQ20101022634
公開日2010年12月22日 申請日期2010年7月6日 優(yōu)先權(quán)日2010年7月6日
發(fā)明者喬獻(xiàn)麗, 呂曉芬, 趙德修, 陳福東 申請人:中國科學(xué)院植物研究所