專利名稱：一種細胞分選磁珠及合成方法以及其在細胞分選中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種新型的細胞分選磁珠，包括該磁珠的合成和修飾方法，以及使用 該新型磁珠進行細胞分選的方法，屬于材料科學(xué)和生物化學(xué)中的納米生物應(yīng)用技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
細胞分選是生物學(xué)和免疫學(xué)實驗中的常用技術(shù)，應(yīng)用磁珠分選細胞是這一領(lǐng)域中 常用的手段，在使用磁珠進行細胞分選的方法中，關(guān)鍵技術(shù)為磁珠的合成。目前常用的商品 化微米級磁珠的蛋白偶聯(lián)量小，而納米級磁珠由于磁性小，不易被磁鐵分離，操作復(fù)雜，分 離成本高。針對上述問題，在細胞分選領(lǐng)域，提供一種蛋白偶聯(lián)量高、超順磁性、易于分離的 納米級磁珠，從而簡化操作、降低成本，同時提供高細胞分選效率，在這一領(lǐng)域具有很大的
眉、ο

發(fā)明內(nèi)容
針對上述問題，本發(fā)明提供一種新型的細胞分選磁珠用于除去小鼠脾細胞中的 CD3 T細胞。本磁珠同時具有蛋白偶聯(lián)量高和超順磁性的優(yōu)點，分選后CD3 T細胞在脾細胞 中的含量由36. 5%降為0. 7%，分選效率極高。本磁珠還具有制備方法簡單、環(huán)境友好、成 本低的優(yōu)點，具有較好的應(yīng)用前景。本發(fā)明的目的是提供一種應(yīng)用于細胞陰性分選的磁珠，包括以下3個部分1、共沉淀法合成15nm Fe3O4納米顆粒，并用羥胺還原HAuCl4的方法，在Fe3O4表面 修飾一層金，合成50-70nm金包裹四氧化三鐵磁性納米顆粒(以下以Fe3O4OAu表示)；2、用16-巰基十六酸將Fe3O4OAu納米顆粒表面羧基化，通過共價偶聯(lián)的protein A，特異性吸附IgG型小鼠CD3抗體的Fc段，使其定向偶聯(lián)在磁珠上；3、應(yīng)用該磁珠除去小鼠脾細胞中的⑶3 T細胞的方法。為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采取以下技術(shù)方案本發(fā)明提供的新型細胞分選磁珠，為表面上以共價鍵偶聯(lián)protein A，并通過 protein A與IgG的Fc段的特異性相互作用，定向偶聯(lián)IgG型小鼠⑶3抗體的50-70nm的 金包裹Fe3O4磁性納米顆粒(Fe3O4OAu納米顆粒)。本發(fā)明涉及一種新型細胞分選磁珠，其特征在于50-70nm的金包裹Fe3O4磁性納 米顆粒(Fe3O4OAu納米顆粒)表面上以共價鍵偶聯(lián)protein A，并進一步通過protein A與 IgG的Fc段的特異性相互作用，定向偶聯(lián)IgG型小鼠CD3抗體。該磁珠上CD3抗體偶聯(lián)量 為 55-65 ( μ g CD3 抗體)/ (mg 磁珠)。本發(fā)明還涉及上述新型細胞分選磁珠的合成方法，該方法包括以下步驟(1)用 共沉淀法制備15nm Fe3O4納米顆粒，(2)用羥胺還原HAuCl4的方法，在前述Fe3O4納米顆粒 表面包裹一層金，制得50-70nm的金包裹Fe3O4磁性納米顆粒(Fe3O4OAu納米顆粒)，(3)用 16-巰基十六酸將前述金包裹Fe3O4磁性納米顆粒(Fe3O4OAu納米顆粒)表面羧基化，⑷將protein A以共價鍵偶聯(lián)在前述被表面羧基化的顆粒上，(5)使IgG型小鼠⑶3抗體通過Fc 段定向固定在前一步驟制得的偶聯(lián)有protein A的磁珠上。本發(fā)明還涉及新型細胞分選磁珠的合成方法，包括以下步驟(1)用共沉淀法制 備Fe3O4納米顆粒的步驟，具體為將摩爾比為2 1的FeCl3 · 6H20和FeCl2 · 4H20溶于 40mmol/L HCl水溶液，制成鐵鹽水溶液(Fe3+與Fe2+的濃度分別為0. 8mol/L和0. 4mol/L)， 在機械攪拌下，將制得的鐵鹽水溶液逐滴滴加至1. 5mol/L NaOH水溶液中，前述過程中控制 溫度保持在80°C，將制得的Fe3O4磁性納米顆粒用磁鐵分離、收集后用純凈水洗滌4次，再將 Fe3O4磁性納米顆粒分散于純凈水中，制成0. lmol/L的Fe3O4儲備液。本步驟中使用的鐵鹽 水溶液與NaOH水溶液之間的體積比為1 10。(2)用羥胺還原HAuCl4的方法，在前述Fe3O4納米顆粒表面包裹一層金，制得 50-70nm的金包裹Fe3O4磁性納米顆粒(Fe3O4OAu納米顆粒)的步驟，具體為將前述 0. lmol/L的Fe3O4儲備液與0. 2mol/L的NH2OH 'HCl水溶液滴加至0. Olmol/LTMAOH水溶液 中，加熱至80°C，在充分攪拌下，將0. 1% (w/v)HAuCl4水溶液滴加至上述溶液中，然后在2 小時內(nèi)緩慢滴加15mmol/L檸檬酸鈉水溶液，滴加完成后繼續(xù)加熱攪拌3小時，該步驟中控 制溶液溫度保持在80°C;生成的金包裹Fe3O4磁性納米顆粒(Fe3O4OAu納米顆粒)經(jīng)磁鐵分 離后，先后分別用純凈水和乙醇各洗滌2次，9，OOOrpm離心15分鐘，棄去洗滌液，在真空干 燥箱中60°C放置1-2小時烘干，得到金包裹Fe3O4磁性納米顆粒(Fe3O4OAu納米顆粒)，本步 驟中使用的Fe3O4儲存液、NH2OH · HCl水溶液、HAuCl4水溶液、檸檬酸鈉水溶液之間的體積 比為 1 0. 3 15 8 20。(3)用16-巰基十六酸將前述金包裹Fe3O4磁性納米顆粒(Fe3O4OAu納米顆粒)表 面羧基化的步驟具體為按重量(mg)體積(ml)為5 2的比例取Fe3O4OAu納米顆粒超 聲分散于20mmol/L 16-巰基十六酸的乙醇溶液中，超聲反應(yīng)48h ；反應(yīng)完畢后將磁珠溶液 用乙醇洗滌3次，9，OOOrpm離心15分鐘后，再分散至乙醇中，制成2mg/mL羧基化的磁珠分 散液。(4)將protein A以共價鍵偶聯(lián)在前述被表面羧基化的顆粒上的步驟，具體為 a.活化取前述羧基化的磁珠分散液，磁鐵分離后棄去乙醇，重新分散于含有EDC和NHS 的、濃度分別為20mg/mL和10mg/mL的水溶液中，超聲反應(yīng)1小時，反應(yīng)過程中每隔5分鐘 將反應(yīng)液充分混勻一次，其中使用的磁珠分散液與含有EDC和NHS的水溶液兩者體積比 為1 2，b. protein A偶聯(lián)將活化后的磁珠用磁鐵分離后重新分散于含有150 μ g/mL protein A的PBS溶液中，置于搖床上在4°C下以40rpm的速度混勻反應(yīng)12-14小時。(5)使IgG型小鼠⑶3抗體的Fc段定向固定在前一步驟制得的偶聯(lián)有proteinA 的磁珠上的步驟，具體為將上一步驟獲得的偶聯(lián)有protein A的磁珠用磁鐵分離后分散 于含有100 μ g/mL小鼠⑶3抗體的PBS溶液中，置于搖床上在4°C下以40rpm的速度混勻反 應(yīng)12-14小時，使⑶3抗體的Fc段定向固定在偶聯(lián)有proteinA的磁珠上。本發(fā)明涉及的細胞分選磁珠的合成方法還包括將使用前述方法制得的該磁珠上 未反應(yīng)的活性位點進行封閉的步驟。其方法為將固定有CD3抗體的Fc段的磁珠分散于細 胞分選緩沖溶液中，置于搖床上在4°C下以40rpm的速度混勻反應(yīng)12-14小時。根據(jù)本發(fā)明的實施方案之四，本發(fā)明還涉及上述細胞分選磁珠的用途，以除去小 鼠脾細胞中的⑶3 T細胞。
本發(fā)明還涉及一種小鼠脾細胞分選方法，該方法為使用本發(fā)明合成的磁珠進行小 鼠脾細胞分選。


圖1 (a)為在Fe3O4納米顆粒上包裹金形成Fe3O4OAu納米顆粒的流程；圖1 (b) Fe3O4OAu納米顆粒被在磁場中被分離；圖2為透射電子顯微鏡結(jié)果(a) Fe3O4納米顆粒；(b) Fe3O4OAu納米顆粒。圖3為X射線衍射圖譜(a) Fe3O4納米顆粒；(b) Fe3O4OAu納米顆粒。圖4為聚丙烯酰胺凝膠電泳分析結(jié)果1.純化后的⑶3抗體；2. BSA ；3. Marker.圖5為純化后的⑶3抗體刺激小鼠T淋巴細胞的實驗結(jié)果。圖6為小鼠⑶3抗體在磁珠上的定向偶聯(lián)流程圖。圖7為小鼠脾細胞經(jīng)磁珠分選前和分選后的流式細胞儀分析結(jié)果。
具體實施例方式本發(fā)明使用的實驗試劑與原料為16-巰基十六酸(16-Mercaptohexadecanoic acid 90 %, 448303) > proteinA(P3838)購自Sigma-Aldrich公司。1_乙基_ (3-二甲基氨基丙基)碳二亞胺鹽 酸鹽(EDC HCl 98+%，5002E19M)、N-羥基琥玻酰亞胺(NHS 98+%，10130571)購自 Alfa Aesar公司。FeCl3 6H20購自國藥集團化學(xué)試劑有限公司。FeCl2 4H20購自廣東.汕頭市 西隴化工廠。鹽酸羥胺(NH2OH HCl)購自北京化工廠。檸檬酸鈉.2H20、四甲基氫氧化胺 (TMAOH) 10% (w/v)水溶液購自北京化學(xué)試劑公司。HAuCl4 4H20購自沈陽有色金屬研究院。 抗小鼠CD3單克隆抗體雜交瘤細胞株由北京大學(xué)醫(yī)學(xué)部醫(yī)學(xué)免疫重點實驗室保存。若無特 別說明，在實驗過程中使用的純凈水均由Milli-Q水純化系統(tǒng)(Millipore公司，Molsheim 市，法國)制備而成。其余未提到的試劑均為分析純，并且使用前無需進一步的純化。IOmM磷酸緩沖溶液(PBS，pH 7. 4)的配制方法將8. Og NaCl,2. 9gNa2HP04 · 12H20、 0. 2g KH2PO4和0. 2g KCl溶于IL純凈水。細胞分選緩沖溶液為含有0. 1 % (w/v)BSA和 0. 05% (ν/ν)吐溫 20 的 PBS 溶液。本發(fā)明采用的實驗儀器為Avanti J-25離心機購自美國Beckman Coulter公司。JEM-200CX型透射電子顯 微鏡(TEM)購自日本JEOL公司。D/MAX-2400型X射線衍射儀(XRD)購自日本理學(xué)株式會 社。NU-5500E型細胞培養(yǎng)箱購自美國NUAIR公司。凝膠電泳儀(Mini PROTEAN 3 Cell型 電泳槽、Power Pac Universal 500V/2. 5A/500W 電源)購自美國 Bio-Rad 公司。CARYlE 型 紫外可見分光光度計購自澳大利亞Varian公司。FACS Calibur 101型流式細胞儀購自美 國BD公司。QB-206型多用途旋轉(zhuǎn)搖床購自海門市其林貝爾儀器制造有限公司。透析袋由 華美科技有限公司提供(北京，中國)。釹鐵硼強磁鐵的大小為40*15*5mm。TomTec公司 96孔細胞收集儀。EG&G公司β-counter。下述實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法。下述實施例中所 用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。實施例1 :Fe304@Au納米顆粒的制備與表征
1、Fe3O4 (15nm)納米顆粒的制備a. 5. 2g FeCl3 6H20，2. Og FeCl2 4H20 溶于 40mmol/L HCl 水溶液，制成鐵鹽溶液；b.在充分的機械攪拌下，將制得的鐵鹽溶液逐滴滴加至250mL 1. 5mol/L NaOH水 溶液中，整個過程中溫度保持在80°C ；c.制得的Fe3O4納米顆粒被磁鐵分離，收集后用200mL純凈水洗滌4次，分散于 IOOmL純凈水中，制成0. lmol/L的Fe3O4儲存液。2、Fe3O4OAu (50_70nm)納米顆粒的制備(圖 1)a. 5mL 0. lmol/L 的 Fe3O4 儲存液與 1. 5mL 0. 2mol/L 的 NH2OH HCl 水溶液滴加至 75mL 0. 01mol/L TMAOH 水溶液中，加熱至 80°C ；b.在充分攪拌下，40mL 0. 1% (w/v) HAuCl4水溶液滴加至上述溶液中，然后在2h 內(nèi)緩慢滴加IOOmL 15mmol/L檸檬酸鈉水溶液，滴加完成后繼續(xù)加熱攪拌3h。該步驟中溶液 溫度保持在80°C ；c.生成的Fe3O4OAu經(jīng)磁鐵分離后，用50mL純凈水洗滌2次，50mL乙醇洗滌2次， 9，OOOrpm離心15min，棄去洗滌液，在真空干燥箱中60°C放置l_2h烘干。3、Fe3O4OAu (50_70nm)納米顆粒的表征Fe3O4與Fe3O4OAu納米顆粒的TEM表征如圖2所示，F(xiàn)e3O4納米顆粒約為15nm，經(jīng)金 包裹后，F(xiàn)e3O4OAu納米顆粒約為50-70nm。Fe3O4與Fe3O4OAu納米顆粒的XRD表征如圖3所 示，在金包裹后b圖中出現(xiàn)了 Au的三個特征衍射峰(111)、(200)和(220)，證明Au在Fe3O4 外的包裹成功。實施例2 小鼠CD3單克隆抗體的制備與純化1、小鼠⑶3單克隆抗體的制備a.將抗小鼠CD3單克隆抗體雜交瘤細胞株置于細胞培養(yǎng)基中，培養(yǎng)條件37°C和 5% CO2，每隔2天換一次細胞培養(yǎng)液，待細胞濃度大于IO5個/孔時停止換液；b.在抗體大量制備前幾天，向健康Balb/c小鼠腹腔中注入石蠟油。將一定數(shù)量的 單克隆細胞用無菌PBS溶液吹下，1，OOOrpm以下離心3_5min，細胞沉淀重懸于0. 5mL PBS 中，注入小鼠腹腔內(nèi)；c.單克隆細胞注入小鼠7-10天后，小鼠腹部可見明顯脹大，取其腹水。用左手固 定小鼠，用75%酒精消毒其腹部，再于小鼠下方放置一支試管，將滅菌的16號注射針頭刺 入小鼠下腹部，讓腹水滴入試管內(nèi)，當(dāng)腹水停滴時，輕輕移動針頭，并輕柔其腹部，使腹水繼 續(xù)滴出。一次可得到約l_3mL腹水。1，OOOrpm離心5min，吸取上層透明清液，凍于_20°C。2、小鼠⑶3單克隆抗體的純化a.制得的腹水從-20°C冰箱中取出后置于4°C冰箱使其融化，用等體積的IOmMpH 7. 4PBS溶液稀釋。向腹水稀釋液中緩慢加入等體積的飽和硫酸銨(50%飽和度)，置于4°C 冰箱中過夜。將腹水稀釋液11，OOOrpm離心，棄上清，用等體積的PBS溶液溶解沉淀；b.將硫酸銨飽和度變?yōu)?3%重復(fù)上述沉淀-溶解步驟2次，11，OOOrpm離心，棄去 上清。沉淀用適量PBS溶解，置于PBS溶液中透析過夜；c.純化得到的抗體經(jīng)SDS-PAGE分析，抗體純度在85%以上(圖4)。3、⑶3抗體對T淋巴細胞的刺激活性測試a.將Balb/c小鼠脾細胞中分選出T淋巴細胞，以4X IO5/孔的細胞數(shù)在96孔細胞培養(yǎng)板中，37°C，5% CO2環(huán)境下培養(yǎng)96小時，同時加入lyg/ml的⑶3抗體，設(shè)置不加抗 體的孔作為對照，實驗組與對照組各設(shè)三個平行孔。b.終止培養(yǎng)前8小時每孔加入0. 2 μ Ci 3H-TdR0用96孔板細胞收集儀將細胞收 集于玻璃纖維素濾紙上，測定放射活度，實驗結(jié)果如圖5所示。實施例3 小鼠⑶3抗體在磁珠上的定向偶聯(lián)(圖6)1、Fe3O4OAu納米顆粒的表面羧基化a.稱取25mg Fe3O4OAu納米顆粒超聲分散于IOmL含有20mmol/L 16-巰基十六酸 的乙醇溶液中，超聲反應(yīng)48h ；b.反應(yīng)完畢后將磁珠溶液用乙醇洗滌3次，9，OOOrpm離心15min，重新分散至 12. 5mL乙醇中，制成2mg/mL羧基化的磁珠分散液。2、⑶3抗體在磁珠上的偶聯(lián)a.取500 μ L 2mg/mL羧基化的磁珠分散液，磁鐵分離后棄去乙醇，重新分散于ImL 含有20mg/mL EDC和10mg/mL NHS的水溶液中，超聲反應(yīng)lh，反應(yīng)過程中每隔5min將反應(yīng) 液充分混勻一次；b.將活化后的磁珠用磁鐵分離后重新分散于ImL含有150 μ g/mL protein A的 PBS溶液中，置于搖床上在4°C下以40rpm的速度混勻反應(yīng)過夜。proteinA上的氨基與磁珠 上活化的羧基反應(yīng)生成肽鍵，使protein A以共價鍵偶聯(lián)在磁珠上；c.將偶聯(lián)有protein A的磁珠用磁鐵分離后重新分散于ImL含有100 μ g/mL⑶3 抗體的PBS溶液中，置于搖床上在4°C下以40rpm的速度混勻反應(yīng)過夜，使⑶3抗體的Fc段 定向固定在偶聯(lián)有protein A的磁珠上；d.將定向偶聯(lián)有CD3抗體的磁珠用磁鐵分離，取清液用考馬斯亮藍染色法測定蛋 白濃度，測得CD3抗體的偶聯(lián)量為60 士 5(yg CD3抗體)/ (mg磁珠)。將分離出的磁珠重新 分散于ImL細胞分選緩沖溶液中，置于搖床上在4°C下以40rpm的速度混勻反應(yīng)過夜，封閉 磁珠上未反應(yīng)的活性位點；e.反應(yīng)完畢后用ImL細胞分選緩沖溶液，洗滌磁珠兩次，分散于ImL細胞分選緩沖 溶液中，分裝后置于-20°C冰箱中保存。實施例4 小鼠脾細胞的磁性分選1、將2 X IO6個小鼠脾細胞收集于EP管中，3，OOOrpm離心3min，用細胞分選緩沖 溶液洗滌一次。加入400 μ L的⑶3磁珠，將細胞重懸，室溫孵育30min ；2、將EP管置于磁場中l(wèi)Omin，吸出不含磁珠的細胞清液。將分選后的細胞溶液離 心，棄去上清，加入100 μ L⑶3-ΡΕ抗體染色，室溫孵育15min，同時設(shè)置未分選的脾細胞作 為對照；3、用細胞分選緩沖溶液洗滌細胞2次，由流式細胞儀分析細胞組成，結(jié)果如圖7所 示，分選后⑶3 T細胞在脾細胞中的含量由36. 5%降為0.7%。盡管上面的描述及圖1-7以及公開了本申請的優(yōu)選實施例，但是，可以設(shè)想，本領(lǐng) 域的技術(shù)人員可在所附權(quán)利要求的精神和范圍內(nèi)設(shè)計對本發(fā)明的各種修改，上述內(nèi)容均應(yīng) 落入本專利保護范圍之內(nèi)。
權(quán)利要求
一種用于細胞陰性分選的磁珠，其特征在于該磁珠為表面上以共價鍵偶聯(lián)protein A，并通過protein A與IgG的Fc段的特異性相互作用，定向偶聯(lián)IgG型小鼠CD3抗體的50 70nm的金包裹Fe3O4磁性納米顆粒(Fe3O4@Au納米顆粒)。
2.如權(quán)利要求1所述的磁珠，其特征在于CD3抗體在該磁珠上的偶聯(lián)方式為定向偶聯(lián)， 且偶聯(lián)量為(55-65 μ gCD3抗體)/ (mg磁珠)。
3.如權(quán)利要求1或2所述的用于細胞陰性分選的磁珠的合成方法，其特征在于包括以 下步驟(1)用共沉淀法制備15nmFe3O4納米顆粒；(2)用羥胺還原HAuCl4的方法，在前述Fe3O4納米顆粒表面包裹一層金，制得50-70nm 的金包裹Fe3O4磁性納米顆粒(Fe3O4OAu納米顆粒)；(3)用16-巰基十六酸將前述金包裹Fe3O4磁性納米顆粒(Fe3O4OAu納米顆粒)表面羧 基化；(4)將proteinA以共價鍵偶聯(lián)在前述被表面羧基化的顆粒上；(5)使IgG型小鼠⑶3抗體通過Fc段定向固定在前一步驟制得的偶聯(lián)有proteinA的 磁珠上；(6)將使用前述方法制得的磁珠上未反應(yīng)的活性位點進行封閉。
4.如權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于所述的步驟(1)為將摩爾比為2 1的FeCl3 ·6Η20和FeCl2 ·4Η20溶于40mmol/LHCl 水溶液，制成鐵鹽水溶液，在機械攪拌下，將制得的鐵鹽溶液逐滴滴加至1. 5mol/L NaOH水 溶液中，前述過程中控制溫度保持在80°C，將制得的Fe3O4磁性納米顆粒用磁鐵分離、收集 后用純凈水洗滌4次，再將Fe3O4磁性納米顆粒分散于純凈水中，制成0. lmol/L的Fe3O4儲 備液，本步驟中使用的Fe3+、Fe2+與NaOH之間的摩爾比為2 1 37. 5 ；所述的步驟⑵為將前一步驟中制得的0. lmol/L的Fe3O4儲備液與0. 2mol/L的 NH2OH -HCl水溶液滴加至0. Olmol/L TMAOH水溶液中，加熱至80°C，在充分攪拌下，將0. 1 % (w/v)HAuCl4水溶液滴加至上述溶液中，然后在2小時內(nèi)緩慢滴加15mmol/L檸檬酸鈉水溶 液，滴加完成后繼續(xù)加熱攪拌3小時，該步驟中控制溶液溫度保持在80°C ；生成的金包裹 Fe3O4磁性納米顆粒(Fe3O4OAu納米顆粒)經(jīng)磁鐵分離后，先后分別用純凈水和乙醇各洗滌 2次，9，OOOrpm離心15分鐘，棄去洗滌液，在真空干燥箱中60°C放置1_2小時烘干，得到金 包裹Fe3O4磁性納米顆粒(Fe3O4OAu納米顆粒)，本步驟中使用的Fe3O4儲備液、NH2OH · HCl 水溶液、HAuCl4水溶液、檸檬酸鈉水溶液之間的體積比為1 0. 3 15 8 20, Fe3O4, NH2OH · HCl、TMA0H、HAuCl4 和檸檬酸鈉之間的摩爾比為 5 3 7. 5 1. 2 15 ；所述的步驟(3)為按重量(mg)體積(ml)為5 2的比例取Fe3O4OAu納米顆粒超 聲分散于20mmol/L 16-巰基十六酸的乙醇溶液中，超聲反應(yīng)48h ；反應(yīng)完畢后將磁珠溶液 用乙醇洗滌3次，9，OOOrpm離心15分鐘后，再分散至乙醇中，制成2mg/mL羧基化的磁珠分 散液；所述的步驟(4)為，a.活化取前述羧基化的磁珠分散液，磁鐵分離后棄去乙醇，重新 分散于含有EDC和NHS的、濃度分別為20mg/mL和10mg/mL的水溶液中，超聲反應(yīng)1小時， 反應(yīng)過程中每隔5分鐘將反應(yīng)液充分混勻一次，其中使用的磁珠分散液與含有EDC和NHS 的水溶液兩者體積比為1 2，b.proteinA偶聯(lián)將活化后的磁珠用磁鐵分離后重新分散于含有150yg/mL protein A的PBS溶液中，置于搖床上在4°C下以40rpm的速度混勻反應(yīng) 12-14小時；所述的步驟(5)為，將上一步驟獲得的偶聯(lián)有protein A的磁珠用磁鐵分離后分散于 含有100μ g/mL小鼠⑶3抗體的PBS溶液中，置于搖床上在4°C下以40rpm的速度混勻反應(yīng) 12-14小時，使⑶3抗體通過Fc段定向固定在偶聯(lián)有protein A的磁珠上。
5.如權(quán)利要求3所述的方法，其中還包括將制得的該磁珠上未反應(yīng)的活性位點進行封 閉的步驟。
6.如權(quán)利要求5所述的方法，其中所述的封閉步驟為將固定有CD3抗體的Fc段的磁珠 分散于細胞分選緩沖溶液中，置于搖床上在4°C下以40rpm的速度混勻反應(yīng)12-14小時。
7.如權(quán)利要求1-2所述的磁珠在分選小鼠脾細胞中的用途。
8.如權(quán)利要求7所述的用途，其特征在于所述的分選為除去小鼠脾細胞中的CD3T細胞。
9.一種小鼠脾細胞分選方法，其特征在于使用權(quán)利要求1或2所述的磁珠進行分選。
全文摘要
本發(fā)明提供一種新型細胞分選磁珠，該磁珠為表面上以共價鍵偶聯(lián)proteinA，并通過protein A與IgG的Fc段的特異性相互作用，定向偶聯(lián)IgG型小鼠CD3抗體的50-70nm金包裹Fe3O4磁性納米顆粒(Fe3O4@Au納米顆粒)。本發(fā)明涉及該磁珠的合成和修飾方法，以及使用該磁珠進行細胞分選的方法。本發(fā)明磁珠用于除去小鼠脾細胞中的CD3 T細胞，使CD3 T細胞在脾細胞中的含量由36.5％降為0.7％，分選效率極高。本磁珠還同時具有蛋白偶聯(lián)量高和超順磁性的優(yōu)點，而且制備方法簡單，環(huán)境友好，成本較低，具有較好的應(yīng)用前景。
文檔編號C12N5/078GK101892196SQ201010226278
公開日2010年11月24日 申請日期2010年7月14日 優(yōu)先權(quán)日2010年7月14日
發(fā)明者崔毅然, 張新祥, 洪超, 高曉明 申請人:北京大學(xué)