專利名稱：用于簡易檢測黑素瘤的方法和試劑的制作方法
用于簡易檢測黑素瘤的方法和試劑
背景技術(shù)：
皮膚惡性黑素瘤是一種嚴(yán)重的健康問題，預(yù)計(jì)2008年美國將有至少62，000例侵 襲性黑素瘤新病例，其中8，200例將死于該疾病。黑素瘤發(fā)病率持續(xù)增加，快于任何其他惡 性腫瘤。另外，其為青年成人中最常見的癌癥之一，并因而，在平均損失生命年數(shù)方面其為 排名第二的一類癌癥。已顯示某些蛋白質(zhì)與黑素瘤及其轉(zhuǎn)移相關(guān)。已經(jīng)在免疫組織化學(xué)中使用這些蛋 白質(zhì)或它們的活性，以鑒定轉(zhuǎn)移，這些蛋白質(zhì)包括LlCAM(Thies等人，(2002) ；Fogel等人， (2003))和S-IOO(Diegc)等人，(2003))。高密度微陣列已應(yīng)用于同時(shí)監(jiān)測生物樣品中成千 上萬種基因的表達(dá)。研究導(dǎo)致鑒定了在良性和惡性病變中差異表達(dá)的基因，以及具有預(yù)后 價(jià)值的基因。Luo等人，(2001)和Wang等人，(2004)。用含有可監(jiān)測8，150種mRNA轉(zhuǎn)錄物 表達(dá)的探針的微陣列進(jìn)行了惡性黑素瘤的基因表達(dá)譜分析。Bittner等人，(2000)。這些 研究者鑒定了若干種可能與惡性腫瘤行為相關(guān)的基因。在最近的工作中，比較了黑素瘤細(xì) 胞系和正常黑素細(xì)胞系的基因表達(dá)譜，導(dǎo)致鑒定了在黑素瘤中差異表達(dá)的基因和受到調(diào)節(jié) 的途徑。Takeuchi等人，(2004)。另外，前列腺分化因子⑶F15、粘附分子LlCAM和驅(qū)動蛋 白樣5、骨橋蛋白、組織蛋白酶B、鈣粘蛋白3和早老蛋白2被鑒定為有希望的黑素瘤檢測標(biāo) 志物(Talantov 等人，(2005) ；Wang 等人，(2007))。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供通過如下步驟鑒定黑素瘤的方法獲得組織樣品；分析和測量樣品中 編碼對應(yīng)于 SILV(me20m) (SEQ. ID NO :1_3)和酪氨酸(TYR) (SEQ. ID NO 4)的 mRNA 的基因 的表達(dá)水平。TYR用作確認(rèn)黑素細(xì)胞在受檢樣品中存在的歸一化對照。本發(fā)明還提供通過 如下步驟鑒定黑素瘤的方法獲得組織樣品；并且分析和測量編碼對應(yīng)于GDF15或LlCAM 中的一者或兩者并且分別由引物/探針組SEQ. ID NO :5-7和8-10所識別的mRNA的基因 在樣品中的表達(dá)水平，其中高于預(yù)定截止值的基因表達(dá)指示存在黑素瘤。本發(fā)明還提供通過如下步驟區(qū)分惡性黑素細(xì)胞和良性黑素細(xì)胞的方法獲得組織 樣品；并且分析和測量編碼SILV的基因在樣品中的表達(dá)水平，其中高于預(yù)定截止值的基因 表達(dá)水平指示樣品中存在黑素瘤。本發(fā)明還提供通過如下步驟區(qū)分惡性黑素細(xì)胞和良性黑素細(xì)胞的方法獲得組織 樣品；并且分析和測量編碼⑶F15和LlCAM中的一者或兩者并且由引物/探針組SEQ/ID NO. :5-7和8-10識別的基因在樣品中的表達(dá)水平。高于預(yù)定截止值的基因表達(dá)水平指示 樣品中存在黑素瘤。本發(fā)明還提供通過如下步驟確定患者治療方案的方法從患者獲得組織樣品；并 且分析和測量編碼SILV的基因在樣品中的表達(dá)水平，其中高于預(yù)定截止水平的基因表達(dá) 水平指示樣品中存在黑素瘤。本發(fā)明還提供通過如下步驟確定患者治療方案的方法從患者獲得組織樣品；并 且分析和測量編碼⑶F15和LlCAM中的一者或兩者并且由引物/探針組SEQ/ID NO. :5_7和
38-10識別的基因在樣品中的表達(dá)水平，其中高于預(yù)定截止水平的基因表達(dá)水平指示樣品中 存在黑素瘤。最終的標(biāo)志物是SILV，并且在本文中其被定義為編碼任何變體、等位基因等的基 因。SILV也被描述為黑素細(xì)胞蛋白17 ；PMEL17 ；前黑素體蛋白；PMEL ；GP100 ；ME20 ；SI ；SIL ； D12S53E，并且由登錄號NM_006928. 3表示。本發(fā)明還提供用于進(jìn)行分析以確定細(xì)胞樣品中 黑素瘤存在的試劑盒，其包含核酸擴(kuò)增和檢測試劑。本發(fā)明還提供了用于擴(kuò)增和檢測本發(fā)明方法所獲得的PCR產(chǎn)物的引物/探針組。 這些組包括如下序列SEQ.IDNO1，SILV，正向引物，AGCTTATCATGCCTGGTCAA
SEQ.IDNO2，SILV，反向引物，GGGTACGGAGAAGTCTTGCT
SEQ.IDNO:3，SILV，探針，F(xiàn)AM-AGGTTCCGCTATCGTGGGCAT-BHQ1
SEQ.IDNO4, ABI AoD*, Hs00165976_ml
SEQ.IDNO5，⑶F15，正向引物，CGCCAGAAGTGCGGCT
SEQ.IDNO6，⑶F15，反向引物，CGGCCCGAGAGATACGC
SEQ.IDNO:7，⑶F15，MGB 探針，F(xiàn)AM-ATCCGGCGGCCAC
SEQ.IDNO:8，L1CAM，正向引物，ACTATGGCCTTGTCTGGGATCTC
SEQ.IDNO:9，L1CAM，反向引物，AGATATGGAACCTGAAGTTGCACTG
SEQ.IDNO:10，L1CAM, MGB 探針，F(xiàn)AM-CACCATCTCAGCCACAGC 本發(fā)明還提供通過本發(fā)明方法所利用的PCR方法獲得的擴(kuò)增子。這些擴(kuò)增子包括 以下序列SEQ. ID NO :11，GDF15 PCR 擴(kuò)增子CGCCAGAAGTGCGGCTGGGATCCGGCGGCCACCTGCACCTGCGTATCTCTCGGGCCGSEQ. ID NO 12 LlCAM PCR 擴(kuò)增子ACTATGGCCTTGTCTGGGATCTCAGATTTTGGCAACATCTCAGCCACAGCGGGTGAAAACTACAGTGTC GTCTCCTGGGTCCCCAAGGASEQ. ID NO 13 SILV PCR 擴(kuò)增子AGCTTATCATGCCTGGTCAAGAAGCAGGCCTTGGGCAGGTTCCGCTGATCGTGGGCATCTTGCTGGTGT TGATGGCTGTGGTCCTTGCATTATGAAGCAAGACTTCTCCGTACCCCTCTGATATATAGGCGCAGACTSEQ. ID NO 14 TYR PCR 擴(kuò)增子TCTGCTGGTATTTTTCTGTAMGACCATTTGCAAMTTGTMCCTMTACAMGTGTAGCCTTCTTCCM


圖1是示出了 SILV、⑶F15和LlCAM在區(qū)分良性和惡性皮膚病變中的性能的坐標(biāo)圖。圖2是描繪了 SILV、⑶F15和LlCAM在區(qū)分明確的黑素瘤和良性痣中的靈敏度對 特異性的坐標(biāo)圖。圖3是SILV在區(qū)分黑素瘤和非典型痣中的性能的坐標(biāo)圖。圖4是描繪了 SILV在區(qū)分明確的黑素瘤和良性痣中的靈敏度對特異性的坐標(biāo)圖。
具體實(shí)施例方式本發(fā)明提供了定性和定量鑒定黑素瘤；區(qū)分惡性黑素細(xì)胞和良性黑素細(xì)胞；診斷 具有不明確的病理學(xué)特征的黑素細(xì)胞病變；以及確定黑素瘤患者治療方案的方法。這些方 法還提供了對患者預(yù)后、患者監(jiān)測和藥物開發(fā)的輔助。這些方法依賴于分析和測量作為黑 素瘤活檢分析的最終標(biāo)志物的SILV (me20m)的表達(dá)水平，其中相對于TYR歸一化對照，某一 水平的基因表達(dá)可指示分析樣品中惡性黑素細(xì)胞的存在。本發(fā)明集中于所鑒定的基因表達(dá)標(biāo)志物用于在多種皮膚病變中診斷惡性黑素瘤 的用途，包括使用石蠟包埋(“FFPE”)組織，稱為不明病例的具有不明確的形態(tài)學(xué)特征或疑 似原發(fā)性黑素細(xì)胞病變。在這種背景下皮膚病理學(xué)家的觀點(diǎn)會出現(xiàn)分歧。因而，本發(fā)明的 用途是在基因表達(dá)測定法(基于RT-PCR)中鑒定可區(qū)分良性黑素細(xì)胞皮膚病變和原發(fā)性黑 素瘤的基因表達(dá)標(biāo)志物，用于診斷可疑病變中的黑素瘤。使用RT-PCR，對分離自47例原發(fā)性黑素瘤、48例良性皮膚痣和98例非典型/可 疑的痣(包括48例非典型痣和50例黑素瘤(由皮膚病理學(xué)家指定))組織樣本的總RNA 進(jìn)行了分析。通過對黑素瘤、良性痣和非典型/可疑的皮膚樣品進(jìn)行一步定量RT-PCR測定 法，檢測了三種黑素瘤特異性基因(SILV、⑶F15和L1CAM)的差異基因表達(dá)。結(jié)果證明了將 SILV用作最終標(biāo)志物可區(qū)分含有良性或惡性黑素細(xì)胞的臨床相關(guān)組織樣品的能力。高密度cDNA和低聚核苷酸微陣列使得能同時(shí)監(jiān)測成千上萬種基因的表達(dá)。微陣 列技術(shù)提供了對mRNA豐度的定量測量并且作為基于基因表達(dá)發(fā)現(xiàn)標(biāo)志物的工具已獲得接 受。在癌癥研究方面，微陣列分析已鑒定了在良性和惡性病變、不同癌癥類型中差異表達(dá)的 基因或具有預(yù)后意義的基因。Luo等人，(2001) ；Su等人，(2001) ；Henshall等人，(2003)； 和Wang等人，(2004)。第一次惡性黑素瘤的基因表達(dá)譜分析使用了含有8，150種mDNA轉(zhuǎn) 錄物的探針的微陣列，并且鑒定了可能與惡性腫瘤行為相關(guān)的基因。Bittner等人，(2000)。 由于他們的研究中所分析的樣品不包括含有正?；蛄夹院谒丶?xì)胞的組織，因此沒有鑒定在 惡性黑素瘤中差異表達(dá)的基因。與正常皮膚相反，良性痣中的黑素細(xì)胞含量與黑素瘤中的 接近。在另一研究中，將源自黑素瘤或良性痣組織的兩種合并的樣品與cDNA陣列雜交， 發(fā)現(xiàn)了在源自黑素瘤或源自痣的樣品中優(yōu)先表達(dá)的基因。Seykora等人，(2003)。其他研究 者使用了扣除雜交或?qū)谒亓黾?xì)胞系上產(chǎn)生的SAGE文庫的分析，用于監(jiān)測黑素瘤中的基 因表達(dá)。Hipfel等人，(2000)；和Weeraratna (2004)。最近，將一些黑素瘤細(xì)胞系和黑素細(xì) 胞系的基因表達(dá)譜進(jìn)行比較導(dǎo)致鑒定了一些差異表達(dá)的基因和在黑素瘤中受調(diào)節(jié)的途徑。 Hoek等人，(2004)。雖然這些研究為黑素瘤遺傳學(xué)提供了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)，但還沒有明確區(qū)分 黑素瘤和良性組織的標(biāo)志物。目前所用的幾種標(biāo)志物(例如酪氨酸酶、HMB-45、mart-a/黑 素-a和MITF)還沒有被證實(shí)具有黑素細(xì)胞腫瘤鑒定的預(yù)后價(jià)值(Phsie等人，(2008))。因 此，這些標(biāo)志物具有有限的臨床用途。如美國專利公布No.20070154889(將其以引用的方式全文并入本文)中所公開 的，PCR被證明對檢測黑素瘤的轉(zhuǎn)移具有足夠的特異性和靈敏度。在本發(fā)明中，提供了一種 在從初級皮膚活檢材料區(qū)分黑素瘤和非黑素瘤病變中具有改善的診斷性能的方法。本發(fā)明 的分析法可用于對可疑的(或不明確的)病變進(jìn)行明確地(或不含糊地)診斷。因而，本 發(fā)明可特別用于檢測早期組織樣品。優(yōu)選的是，概率度量將相對于良性黑素細(xì)胞或正常組織來區(qū)分具有黑素瘤的組織。本發(fā)明方法采用從FFPE組織樣品提取核酸的快速技術(shù)和擴(kuò)增和檢測指示原發(fā)性 皮膚病變的核酸片段的方法。這些核酸片段定性和定量地測量由標(biāo)志基因編碼的mRNA。組 織樣品包括源于打孔活織檢查、針吸活組織檢查、切除活組織檢查、刮取活組織檢查的皮膚 病變。本文所提供的方法使得能在初級皮膚活檢組織樣品中進(jìn)行黑素瘤檢測，使得醫(yī)師能 確定是否要立即對早期疾病實(shí)施適當(dāng)?shù)闹委煼桨?。在本發(fā)明的方法中，對用于進(jìn)行測定法 的組織充分采樣很重要。這包括對組織樣品進(jìn)行正確切除和處理以及提取RNA。一旦獲得 樣品，正確處理組織樣品以便檢測任何存在的癌性細(xì)胞很重要。在本發(fā)明的一種方法中，RNA分離自FFPE組織樣品塊?？梢允褂萌魏魏线m的市售 石蠟試劑盒，例如來自Roche的High Pure RNA Paraffin Kit (高純度RNA石蠟試劑盒) (產(chǎn)品目錄號3270289)。優(yōu)選的是，如下根據(jù)包埋腫瘤的大小對FFPE樣品進(jìn)行切片2 至5mm切成9 X 10 μ m ；彡6至8mm切成6 X 10 μ m。根據(jù)生產(chǎn)商提供的說明書對切片去除石 蠟，并可將分離的RNA存儲于-80°C的無RNA酶的水中。就測量mRNA水平來確定基因表達(dá)而言，可通過本領(lǐng)域已知的任何手段來進(jìn)行分 析，并且包括諸如PCR、滾環(huán)擴(kuò)增(RCA)、連接酶鏈反應(yīng)(LCR)、鏈置換擴(kuò)增(SDA)、基于核酸 序列的擴(kuò)增(NASBA)等之類的方法。所涉及的快速分子診斷學(xué)最優(yōu)選的是定量PCR方法， 包括QRT-PCR。可通過本領(lǐng)域已知的任何方法進(jìn)行檢測，包括微陣列、基因芯片和熒光。典型的PCR包括多個(gè)擴(kuò)增步驟或循環(huán)，其選擇性擴(kuò)增靶核酸種類。典型的PCR包 括三個(gè)步驟變性步驟，其中靶核酸變性；退火步驟，其中一組PCR引物(正向引物和反向 引物)退火至互補(bǔ)DNA鏈；延伸步驟，其中熱穩(wěn)定性DNA聚合物延伸引物。通過重復(fù)該步驟 多次，DNA片段被擴(kuò)增而產(chǎn)生對應(yīng)于靶DNA序列的擴(kuò)增子。典型的PCR包括20個(gè)或更多個(gè) 變性、退火和延伸循環(huán)。通常，退火后延伸步驟可同時(shí)進(jìn)行，在這種情況中該循環(huán)僅含兩個(gè) 步驟。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例中，RT-PCR擴(kuò)增反應(yīng)可在使得這些步驟中每一個(gè)步驟的時(shí) 長可在數(shù)秒的范圍內(nèi)，而不是在數(shù)分鐘的范圍的時(shí)間上進(jìn)行。具體地講，使用能產(chǎn)生至少每 秒5°C的熱升溫速率的熱循環(huán)儀，可在30分鐘或更短時(shí)間內(nèi)使用RT-PCR擴(kuò)增。更優(yōu)選地， 擴(kuò)增在少于25分鐘內(nèi)進(jìn)行。據(jù)此，對PCR循環(huán)的每個(gè)步驟提供的以下時(shí)間不包括升溫時(shí) 間。變性步驟可進(jìn)行10秒鐘或更少的時(shí)間。事實(shí)上，某些熱循環(huán)儀具有“0”秒的設(shè)置，這 可能是最佳的變性步驟持續(xù)時(shí)間。即，其足夠熱循環(huán)儀達(dá)到變性溫度。退火和延伸步驟最 優(yōu)選每一者均少于10秒，并且當(dāng)在相同的溫度下進(jìn)行時(shí)，組合的退火/延伸步驟可以少于 10秒。一些同質(zhì)探針檢測方法可能需要單獨(dú)的延伸步驟，以使快速測定性能最佳。為了使 總擴(kuò)增時(shí)間和非特異性副反應(yīng)兩者最小化，退火溫度通常高于50°C。更優(yōu)選地，退火溫度高 于 55 0C ο對RT-PCR來說單個(gè)合并反應(yīng)(無實(shí)驗(yàn)者的干預(yù))因?yàn)槿缦氯舾稍蚴抢硐氲?(1)實(shí)驗(yàn)誤差風(fēng)險(xiǎn)降低；(2)靶標(biāo)或產(chǎn)物污染風(fēng)險(xiǎn)降低；以及(3)測定速度加快。反應(yīng)可由 一種或多種聚合物酶組成。就兩種聚合酶而言，這些酶的其中之一通常是基于RNA的DNA 聚合酶(逆轉(zhuǎn)錄酶)，而另一種酶是熱穩(wěn)定的基于DNA的DNA聚合酶。為了使測定性能最 佳，優(yōu)選對這兩種酶促功能均采用“熱啟動”技術(shù)的形式。美國專利5，411，876和5，985，619 提供了不同的“熱啟動”方法的例子，將這兩篇專利以引用的方式并入本文。優(yōu)選的方法包括使用一種或多種熱啟動方法，這些方法可掩蔽有效進(jìn)行DNA聚合所需的一種或多種組 分。美國專利5，550，044和5，413，924描述了制備用于這類方法的試劑的方法，將這兩篇專 利以引用的方式并入本文。美國專利6，403，341描述了一種隱蔽方法，該方法涉及其中一 種PCR試劑組分的化學(xué)改變，將該專利以引用的方式并入本文。在最優(yōu)選的實(shí)施例中，RNA 依賴性和DNA依賴性聚合酶兩者的活性存在于單一酶中。有效進(jìn)行擴(kuò)增所需的其他組分包 括三磷酸核苷、二價(jià)鹽和緩沖液組分。在某些情況下，非特異性核酸和酶穩(wěn)定劑可能是有利 的。在優(yōu)選的RT-PCR中，某些逆轉(zhuǎn)錄酶和PCR組分的量是非典型的，以便利用某些熱 循環(huán)儀的較快升溫時(shí)間。具體地講，引物濃度非常高。用于逆轉(zhuǎn)錄酶的典型的基因特異性引物濃度為少于約20nM。為了實(shí)現(xiàn)快速逆轉(zhuǎn) 錄酶反應(yīng)以一至兩分鐘的數(shù)量級進(jìn)行，逆轉(zhuǎn)錄酶引物濃度升高至大于20nM，優(yōu)選至少約 50nM，并且通常為約ΙΟΟηΜ。標(biāo)準(zhǔn)的PCR引物濃度范圍是IOOnM至300nM。在標(biāo)準(zhǔn)的PCR中 可使用較高的濃度以補(bǔ)償Tm變化。然而，為了本發(fā)明目的，參考的引物濃度是用于其中不 需要補(bǔ)償Tm的情況。如果Tm補(bǔ)償是必須的或理想的，則可以經(jīng)驗(yàn)方法確定和使用成比例 增高的濃度的引物。為了實(shí)現(xiàn)快速PCR，PCR引物濃度通常高于250nM，優(yōu)選高于約300nM， 并且通常為約500nM。商業(yè)使用的診斷方法也優(yōu)選采用一種或多種內(nèi)部陽性對照，其可在陰性結(jié)果的情 況下確認(rèn)特定擴(kuò)增反應(yīng)的進(jìn)行。在RT-PCR中必須控制的假陰性結(jié)果的可能原因包括RNA 量不足、RNA降解、RT和/或PCR的抑制以及實(shí)驗(yàn)誤差。就測量蛋白質(zhì)含量來確定基因表達(dá)而言，本領(lǐng)域任何已知的方法都是合適的，只 要其可導(dǎo)致足夠的特異性和靈敏度。例如，可通過使蛋白質(zhì)結(jié)合至該蛋白質(zhì)特異性的抗體 或抗體片段，并測量抗體結(jié)合的蛋白質(zhì)的量來測量蛋白質(zhì)含量?？捎梅派湫詿晒庠噭┗蚱?他可檢測試劑標(biāo)記抗體，以方便檢測。檢測方法包括(但不限于)酶聯(lián)免疫吸附測定法 (ELISA)和免疫印跡技術(shù)。本發(fā)明提供了足以鑒定組織樣品中的惡性黑素細(xì)胞的特異性和靈敏度。這些方法 通過測量由標(biāo)志物編碼的mRNA來確定特定標(biāo)志物基因SILV的表達(dá)。本文示出的結(jié)果表 明，SILV是證實(shí)可明確辨別黑素瘤病例和良性的明確病例以及辨別可疑組織樣品組中的不 同非典型亞組的首要標(biāo)志物。在本文中標(biāo)志物定義為編碼任何變體、等位基因等的基因，包 括 SEQ IDNO 1-3。在本發(fā)明方法中，將酪氨酸酶用作對照基因，以證明組織樣品中存在黑素細(xì)胞 以及對黑素細(xì)胞含量進(jìn)行歸一化。Mandelcorn-Monson等人，(2003)；以及美國專利 No. 6，153，388對酪氨酸酶進(jìn)行了描述，并且由登錄號No. NM_000372表示。酪氨酸酶也定 義為編碼由ABI assay ondemand識別的mRNA的基因(Hs00165976_ml)，PCR擴(kuò)增子為SEQ ID NO :14。任何給定的基于擴(kuò)增的分子診斷法的特異性很大程度上(但不是排他地)依賴于 引物組的種類。引物組是成對的正向和反向寡核苷酸引物，其退火至靶DNA序列以使得能 擴(kuò)增靶序列，從而產(chǎn)生靶序列特異性的擴(kuò)增子。引物必須能擴(kuò)增所關(guān)注的疾病狀態(tài)的標(biāo)志 物。就本發(fā)明而言，標(biāo)志物涉及黑素瘤。反應(yīng)必須還含有檢測特異性信號的某些手段。這優(yōu)選通過使用試劑來完成，這些試劑可檢測源于所關(guān)注靶序列的聚合反應(yīng)的DNA序列的區(qū)域。當(dāng)結(jié)合至所關(guān)注的特異性核 酸序列時(shí)，用于檢測的優(yōu)選試劑產(chǎn)生可測量的信號差異。通常，這些方法涉及在結(jié)合至所關(guān) 注序列時(shí)引起熒光增加的核酸探針。通常，通過針對每種PCR引物對分析擴(kuò)增子產(chǎn)生的相 對速率來監(jiān)測本發(fā)明方法的反應(yīng)進(jìn)展。本發(fā)明還包括引物/探針組及其在受權(quán)利要求書保護(hù)的方法中的用途。這些序 列的ID是SEQ，ID No. 1-100可通過多種檢測試劑和方法來監(jiān)測擴(kuò)增子產(chǎn)生，包括但 不限于熒光引物，以及結(jié)合雙鏈DNA的熒光探針和熒光染料。也可使用分子信標(biāo)、蝎型物 (Scorpion)和其他檢測方案。監(jiān)測PCR的通用方法采用熒光水解探針測定法。該方法利用 某些熱穩(wěn)定性DNA聚合酶(例如Taq或Tfl DNA聚合酶)的5 ‘核酸酶活性，在PCR過程 中裂解寡聚探針。本發(fā)明還提供通過本發(fā)明方法中利用的PCR方法提供的擴(kuò)增子。這些擴(kuò)增子包括 如下序列:SEQ. ID No 11-14。選擇寡聚物，在延伸條件下退火至擴(kuò)增的靶序列。探針通常在5'末端具有熒光 報(bào)告分子，在3’末端具有熒光猝滅劑。只要寡聚物是完整的，來自報(bào)告分鐘的熒光信號就 被猝滅。然而，當(dāng)寡聚物在延伸過程中被消化時(shí)，熒光報(bào)告分子不再臨近于猝滅劑?？蓪?給定擴(kuò)增子的游離熒光報(bào)告分子的相對積聚與對照樣品的相同擴(kuò)增子的積聚和/或?qū)φ?基因例如(但不限于)β -肌動蛋白或PBGD的積聚相比較，以確定RNA群體中給定RNA的 給定cDNA產(chǎn)物的相對豐度。熒光水解探針測定法的產(chǎn)物和試劑容易商購獲得，例如，購自 Applied Biosystems0最優(yōu)選的檢測試劑是TaqMaη .探針(Roche Diagnostics，Branchburg，NJ)，它 們在美國專利5，210，015 ；5, 487，972和5，804，375中有所描述，將這些專利以引用的方式 并入本文。基本上，這些探針涉及通過分離探針上的熒光_猝滅劑組合而進(jìn)行核酸檢測，所 述分離是通過用于PCR中的5’ -3’外切核酸酶活性。任何合適的熒光團(tuán)都可以用于任何 標(biāo)志物或?qū)φ?。這些熒光團(tuán)包括(但不限于)Texas RecUCal Red、Fam、Cy3和Cy5。在一 個(gè)實(shí)施例中，以下熒光團(tuán)對應(yīng)于指出的標(biāo)志物=PLAB =Fam ；LlCAM =Texas Red或Cal Red ； 酪氨酸酶C1 ；PBGD :Cy5?？扇菀撰@得用于控制和監(jiān)測擴(kuò)增子積聚的設(shè)備和軟件，包括購自 Cepheid ofSunnyvale, California 的 Smart 熱循環(huán)儀禾口購自 Applied Biosystems 的 ABI Prism 7900的序列檢測系統(tǒng)。在上述QRT-PCR的方法的商業(yè)化中，某些用于檢測特定核酸的試劑盒尤其有用。 在一個(gè)實(shí)施例中，試劑盒包括擴(kuò)增和檢測標(biāo)志物的試劑。任選地，試劑盒包括樣品制備試劑 和/或制品(如試管)，以從淋巴結(jié)組織提取核酸。該試劑盒也可以包括使樣品污染的風(fēng)險(xiǎn) 最小的制品(如用于淋巴結(jié)切開和制備的一次解剖刀和表面)。在優(yōu)選的試劑盒中，包括了上述單管QRT-PCR方法的必要試劑，例如逆轉(zhuǎn)錄酶、逆 轉(zhuǎn)錄酶引物、相應(yīng)的PCR引物組(優(yōu)選針對標(biāo)志物和對照)、熱穩(wěn)定性DNA聚合酶(例如 Taq聚合酶)和合適的檢測試劑，例如(但不限于)蝎型探針、用于熒光水解探針測定法的 探針、分子信標(biāo)探針、雙鏈DNA的特異性單染料引物或熒光染料(例如溴化乙錠)。弓丨物優(yōu) 選為產(chǎn)生上述高濃度的量。熱穩(wěn)定性DNA聚合酶通常可在商業(yè)上從多個(gè)制造商獲得。試劑 盒中的額外材料可以包括合適的反應(yīng)試管或管形瓶、屏蔽組分，通常是蠟珠，任選包括鎂； 逆轉(zhuǎn)錄酶和PCR階段的反應(yīng)混合物(通常為10X)，包括必要的緩沖液和試劑，例如dNTP ；不含核酸酶或不含RNA酶的水；RNA酶抑制劑；可用于QRT-PCR的逆轉(zhuǎn)錄酶和/或PCR階段的 對照核酸和/或任何額外的緩沖液、化合物、輔因子、離子組分、蛋白質(zhì)和酶、聚合物等?？?任選地，試劑盒包括核酸提取試劑和材料。說明書也優(yōu)選包括在試劑盒內(nèi)。提供了如下實(shí)例來舉例說明受權(quán)利要求書保護(hù)的本發(fā)明但不對其進(jìn)行限制。實(shí)例1患者的臨床和病理學(xué)特征從在喬治城大學(xué)醫(yī)院(Georgetown University Hospital)診斷患有原發(fā)性黑素 細(xì)胞皮膚病變的患者選擇了 204份FFPE皮膚活檢組織樣本。該患者系列包括102份具有明 確的侵襲性黑素瘤或良性痣特征的樣本和102份具有各種程度的細(xì)胞異型度的樣本。這些 非典型樣本最初被分類為可疑的/非典型的樣本，隨后由皮膚病理學(xué)專家辨別為非典型痣 或惡性黑素瘤。排除了兩份患者樣品，因?yàn)樵跇悠分苽洳襟E后RNA收率不足(少于350ng)。 由于PCR控制失敗，又排除了另外九份RNA樣品。符合條件用于分析的最終樣品組由193 份活檢組織(起始樣品組的95% )，代表47份黑素瘤、48份良性痣和98份非典型/可疑活 檢組織(通過皮膚病理學(xué)家進(jìn)行歸屬，包括48份非典型痣和50份黑素瘤)。這些黑素瘤樣 品的病理學(xué)和臨床特征的匯總在表1中示出。表 1
患者特征晚期黑 素瘤黑素瘤嚴(yán)重非 典型中度非 典型良性 痣平均年齡59514244042性別女性83520833男性64815515T期(厚度)Tis21Tl ( < Imm)162T2(l. 01-2mm)7Τ3(2· 01-4mm)3T4 ( > 4mm)1M2診斷淺表擴(kuò)展性黑素瘤650結(jié)節(jié)性黑素瘤5原位黑素瘤21惡性雀斑11黑素瘤，其他31復(fù)合痣31炎性復(fù)合痣13
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權(quán)利要求
一種鑒定黑素瘤的方法，所述方法包括如下步驟a.獲得組織樣品；和b.測量所述樣品中編碼對應(yīng)于SILV的mRNA的基因(SEQ ID No.1 3和13)的表達(dá)水平。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，所述方法還包括測量編碼酪氨酸酶的基因(SEQID NO :4和14)的表達(dá)水平。
3.根據(jù)權(quán)利要求1和3所述的方法，所述方法測量SILV相對于TYR的表達(dá)水平。
4.根據(jù)權(quán)利要求1、2或3的方法，其中所述樣品是初級皮膚活檢樣品。
5.根據(jù)權(quán)利要求1、2或3所述的方法，其中基因表達(dá)在微陣列或基因芯片上測量。
6.根據(jù)權(quán)利要求1、2或3所述的方法，其中基因表達(dá)通過核酸擴(kuò)增來確定，所述核酸擴(kuò) 增通過從所述樣品提取的RNA的聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)來進(jìn)行。
7.一種方法，其中黑素瘤診斷的概率從權(quán)利要求1、2或3確定。
全文摘要
本發(fā)明公開了用于簡易檢測黑素瘤的方法和試劑，通過確定指示黑素瘤的特定基因的差異表達(dá)是否超過截止值而提供在活檢組織中鑒定早期惡性黑素細(xì)胞的測定法。
文檔編號C12N15/11GK101948915SQ201010226228
公開日2011年1月19日 申請日期2010年7月8日 優(yōu)先權(quán)日2009年7月8日
發(fā)明者D·塔蘭托夫, H·王, J·F·帕爾馬, T·杰特克, T·維納, Y·王 申請人:維里德克斯有限責(zé)任公司