一種一步均相ck?mb檢測(cè)試劑盒及其應(yīng)用
【專利摘要】本發(fā)明提供了一種一步均相CK?MB檢測(cè)試劑盒及其在檢測(cè)CK?MB含量中的應(yīng)用，所述試劑盒包括：(1)抗CK?MB抗體偶聯(lián)的發(fā)光微球試液；(2)抗CK?MB抗體偶聯(lián)的感光微球試液；以及能夠接收和發(fā)射光的反應(yīng)孔。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明試劑盒具有操作方便、檢測(cè)快速、靈敏度高、準(zhǔn)確性好等優(yōu)點(diǎn)，并且特異性強(qiáng)。將其應(yīng)用于心肌損傷的監(jiān)測(cè)，可以提高急性心肌梗塞診斷的準(zhǔn)確率。
【專利說明】
一種一步均相CK-MB檢測(cè)試劑盒及其應(yīng)用
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明屬于檢測(cè)試劑盒領(lǐng)域，特別涉及一種一步均相CK-MB檢測(cè)試劑盒及其應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 急性心肌梗死(Acute Myocardial Infarction，AMI)是世界上發(fā)病率和死亡率較 高的疾病之一。據(jù)最近美國心臟病協(xié)會(huì)數(shù)據(jù)顯示，2003年美國有720萬AMI患者。但同時(shí)AMI 又是高誤診率的疾病之一，一些確實(shí)患有AMI的患者沒有得到恰當(dāng)?shù)奶幚?，?dǎo)致較高的死亡 率;而另一些非AMI患者又接受了不必要的治療，引起不必要的花費(fèi)。世界衛(wèi)生組織推薦:典 型的胸痛、心電圖改變和心肌酶異常三項(xiàng)指標(biāo)中有兩項(xiàng)符合，即可診斷AMI。但許多AMI患者 早期沒有典型的臨床癥狀和心電圖的異常改變，因此心肌損傷標(biāo)志物的檢測(cè)就顯得尤為重 要。近年來心肌標(biāo)志物在臨床中的應(yīng)用得到了越來越廣泛的重視，其發(fā)展也相當(dāng)迅速，在臨 床中出現(xiàn)了很多心肌標(biāo)志物。
[0003] 肌酸激酶(Creatine Kinase，CK)主要存在于脊椎動(dòng)物中，通常存在于動(dòng)物的心 臟，骨骼肌以及腦等組織的細(xì)胞質(zhì)和線粒體中。CK催化肌酸和ATP或磷酸肌酸和ADP之間磷 酸轉(zhuǎn)移的可逆反應(yīng)。CK活性在人體中存在較廣泛，在血中半衰期約為6-8小時(shí)。CK是一個(gè)二 聚體，有3種同工酶的形式存在:2個(gè)B單體(CK-BB)，2個(gè)Μ單體(CK-MM)，MB的單體混合體(CK-MB)。這3種同工酶分子量相同，催化相同的化學(xué)反應(yīng)，但其分子結(jié)構(gòu)和來源不同：CK-BB來源 于橫紋肌，CK-MM來源于大腦和消化道，而CK-MB來源于心肌。心肌中CK-MB占 CK總量的15 % ~25 %。所以在心肌損傷，特別是急性心肌梗死(AMI)時(shí)，測(cè)定CK-MB對(duì)AMI的診斷有極大的 臨床意義。
[0004] 有關(guān)實(shí)驗(yàn)表明，在AMI癥狀發(fā)生后12~48d時(shí)采樣分析，CK-MB質(zhì)量的臨床靈敏度和 臨床特異性分別為96.8%和89.6%，這就使它在眾多心肌標(biāo)志物中脫穎而出，成為對(duì)AMI臨 床診斷起重要作用的一個(gè)指標(biāo)。同時(shí)，結(jié)合cTnI、Myo等心肌特異標(biāo)志物可提高臨床診斷的 準(zhǔn)確性。在缺血性心臟疾病中，當(dāng)被阻塞的冠脈再通時(shí)，心肌中的CK-MB被血流沖刷出來，弓丨 起血液中CK-MB質(zhì)量升高，峰值時(shí)間提前。因此我們可通過CK-MB定量檢測(cè)結(jié)果來判斷溶栓 治療在短時(shí)間內(nèi)再通與否，確定心肌再灌注以及觀察治療效果等。除此之外，CK-MB質(zhì)量還 可以用于較早期診斷AMI，也可以用于估計(jì)梗死范圍大小或再梗死。
[0005] 常用的CK-MB檢測(cè)方法有金標(biāo)定性試驗(yàn)、焚光免疫法、聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELI SA )、磁 微?；瘜W(xué)發(fā)光法(CMIA)和生化儀檢測(cè)。金標(biāo)定性實(shí)驗(yàn)快速，但該方法靈敏度低、無法動(dòng)態(tài)監(jiān) 測(cè)CK-MB含量的變化。熒光免疫法操作復(fù)雜，對(duì)操作環(huán)境和操作人員有較高的要求。ELISA法 的檢測(cè)靈敏度較低，目前主要應(yīng)用于傳染性疾病篩查等對(duì)檢測(cè)靈敏度要求較低的項(xiàng)目，并 且反應(yīng)時(shí)間較長。CMIA法是從ELISA法改進(jìn)而來，與ELISA法相比具有操作簡單，檢測(cè)速度快 等特點(diǎn)，但是CMIA法是非均相反應(yīng)，操作過程需要清洗，降低了檢測(cè)的可重復(fù)性。自動(dòng)生化 分析儀檢測(cè)，其檢測(cè)成本低、速度快，因而應(yīng)用最普遍。但由于目前該項(xiàng)目測(cè)定方法本身的 局限，偶爾會(huì)產(chǎn)生測(cè)定結(jié)果的假性升高，甚至出現(xiàn)CK-MB酶活性高于總CK酶活性的怪異現(xiàn) 象。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 發(fā)明目的：為解決上述問題，本發(fā)明利用CK-MB的抗體，以氧通道化學(xué)發(fā)光技術(shù)為 平臺(tái)，研發(fā)出一種針對(duì)急性心肌梗塞診斷的CK-MB快速檢測(cè)試劑盒。使其與現(xiàn)有檢測(cè)試劑盒 相比，具有操作方便、檢測(cè)快速、靈敏度高、準(zhǔn)確性好等優(yōu)點(diǎn)；將其應(yīng)用于心肌損傷的監(jiān)測(cè)， 可以提高急性心肌梗塞診斷的準(zhǔn)確率。
[0007] 技術(shù)方案:本發(fā)明提供了一種一步均相CK-MB檢測(cè)試劑盒，包括：
[0008] (1)抗CK-MB抗體偶聯(lián)的發(fā)光微球試液；
[0009] (2)抗CK-MB抗體偶聯(lián)的感光微球試液；
[0010] (3)分析緩沖液；
[0011]以及能夠接收和發(fā)射光的反應(yīng)孔。
[0012 ]作為優(yōu)選，所述抗CK-MB抗體為針對(duì)CK-MB不同表位的單克隆抗體或多克隆抗體， 其可以通過常規(guī)免疫學(xué)方法獲得。
[0013] 所述發(fā)光微球表面活性基團(tuán)為醛基、羧基、氨基等，發(fā)光微球帶有發(fā)光化合物和鑭 系元素化合物的高分子。發(fā)光化合物可以是Dioxene(二氧雜環(huán)己稀)或Thioxene(二甲基噻 吩）的衍生物等，鑭系元素化合物可以是Eu(TTA)3/T0P0或Eu(TTA)3/Phen等，發(fā)光微球大小 為100-300nm，該微球可由市場(chǎng)購得，如鉑金埃爾默公司。
[0014] 所述感光微球表面活性基團(tuán)為醛基、羧基、氨基等，感光微球帶有光激發(fā)產(chǎn)生單線 態(tài)氧的染料，如酞箐染料、葉綠素等，感光微球大小為100_300nm，該微球可由市場(chǎng)購得，如 鉑金埃爾默公司。
[0015] 所述抗CK-MB抗體偶聯(lián)的發(fā)光微球，其中發(fā)光微球與抗CK-MB抗體的質(zhì)量比為（1-100): 1;所述抗CK-MB抗體偶聯(lián)的發(fā)光微球試液的濃度為10-200μg/ml。
[0016] 所述抗CK-MB抗體偶聯(lián)的感光微球，其中感光微球與抗CK-MB抗體的質(zhì)量比為（1-100): 1;所述抗CK-MB抗體偶聯(lián)的感光微球試液的濃度為10-200μg/ml。
[0017]所述反應(yīng)孔為微孔板、微流控試劑盤、反應(yīng)杯或反應(yīng)管等。
[0018] 所述分析緩沖液的制備，包括如下步驟：將HETOS 0.1-2g、BSA 0.1-5g、Casein 0.1-5g、NaCl 0.5-3g、Triton X-100 0.01-lml加入蒸餾水溶解后，制成分析緩沖液。
[0019] 所述抗CK-MB抗體偶聯(lián)的發(fā)光微球試液或抗CK-MB抗體偶聯(lián)的感光微球試液主要 由以下步驟制成：
[0020] ⑴將抗體加入到超濾管中，離心，用HEPES緩沖液(pH7.4)重復(fù)洗滌，抗體稀釋到 lmg/ml備用；取發(fā)光微球或者感光微球，用HEPES緩沖液(pH7.4)重復(fù)清洗兩次，離心，去除 上清；
[0021 ] (2)將抗體溶液加入到發(fā)光微球或感光微球中，重懸；
[0022] (3)加入 10%Tween20;
[0023] (4)加入400mM NaCNBH3,加入HEPES緩沖液將體積補(bǔ)足；
[0024] (5)37 Γ震蕩反應(yīng)24-48小時(shí)；
[0025] (6)封閉：用800mMNa0H配制65mg/ml CM0溶液，加到反應(yīng)體系中；
[0026] (7)37°C 震蕩反應(yīng)；
[0027] (8)離心，去除上清；
[0028] (9)加入Tris-HCl(pH8.0)緩沖液重懸，離心，去除上清，重復(fù)一次；
[0029] (10)最后一次離心后用roS緩沖液(pH7-8)和牛血清白蛋白混合液重懸微球，終濃 度5mg/ml，使用前稀釋至所需濃度。
[0030] 本發(fā)明還提供了所述一步均相CK-MB檢測(cè)試劑盒在檢測(cè)CK-MB含量中的應(yīng)用。
[0031] 其中，檢測(cè)方法包括以下步驟：
[0032] (1)在試劑盒的反應(yīng)孔中加入樣品、抗CK-MB抗體偶聯(lián)的發(fā)光微球試液和抗CK-MB 抗體偶聯(lián)的感光微球試液，混合反應(yīng)5-60分鐘；
[0033] (2)激發(fā)光照射反應(yīng)孔，測(cè)量每個(gè)反應(yīng)孔發(fā)光量獲得光信號(hào)值；
[0034] (3)繪制CK-MB濃度與光信號(hào)值的標(biāo)準(zhǔn)曲線，利用步驟(2)測(cè)得的光信號(hào)值，通過標(biāo) 準(zhǔn)曲線計(jì)算CK-MB含量。
[0035] 技術(shù)效果:與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明試劑盒具有操作方便、檢測(cè)快速、靈敏度高、準(zhǔn) 確性好等優(yōu)點(diǎn)，并且特異性強(qiáng)。將其應(yīng)用于膀胱癌的監(jiān)測(cè)，可以提高膀胱癌診斷的準(zhǔn)確率。
【附圖說明】
[0036]圖1是本發(fā)明CK-MB氧通道化學(xué)發(fā)光檢測(cè)試劑盒原理示意圖；
[0037] 圖2是本發(fā)明CK-MB氧通道化學(xué)發(fā)光檢測(cè)試劑盒檢測(cè)線性范圍圖；
[0038] 圖3是本發(fā)明試劑盒與羅氏CK-MB試劑盒的檢測(cè)結(jié)果相關(guān)性比較。
【具體實(shí)施方式】
[0039]根據(jù)下述實(shí)施例，可以更好地理解本發(fā)明。然而，本領(lǐng)域的技術(shù)人員容易理解，實(shí) 施例所描述的具體的物料配比、工藝條件及其結(jié)果僅用于說明本發(fā)明，而不應(yīng)當(dāng)也不會(huì)限 制權(quán)利要求書中所詳細(xì)描述的本發(fā)明。
[0040] 實(shí)施例1試劑盒
[0041] 實(shí)驗(yàn)中原料及試劑：
[0043] -、抗CK-MB抗體偶聯(lián)發(fā)光微球，以醛基發(fā)光微球?yàn)槔?br>[0044] 1)將0 . lmg抗體加入到超濾管中，離心10分鐘，用HEPES緩沖液(pH7.4)重復(fù)洗滌6 次后，抗體稀釋到lmg/ml備用。取lmg發(fā)光微球，用HEPES緩沖液(pH7.4)重復(fù)清洗兩次，離 心，去除上清。
[0045] 2)將抗體溶液加入到發(fā)光微球(購自鉑金埃爾默公司）中，重懸。
[0046] 3)加入 2·5μ1 10%Tween20〇
[0047] 4)加入10μ1 400mMNaCNBH3,加入HEPES緩沖液將體積補(bǔ)足到200μ1。
[0048] 5) 37 °C震蕩反應(yīng)24-48小時(shí)。
[0049] 6)封閉：用800mMNa0H配制65mg/ml CM0溶液。加10μ1 CM0溶液到反應(yīng)體系中。
[0050] 7) 37 Γ震蕩反應(yīng)1小時(shí)。
[0051 ] 8)離心，去除上清。
[0052] 9)加入200ylTris-HCl(pH8.0)緩沖液重懸，離心，去除上清。重復(fù)一次。
[0053] 10)最后一次離心后用200μ1 PBS緩沖液(pH7-8)和牛血清白蛋白混合液重懸微 球，終濃度5mg/ml，使用前稀釋至所需濃度。
[0054]二、抗CK-MB抗體偶聯(lián)感光微球，以醛基感光微球?yàn)槔?br>[0055] 1)將0 . lmg抗體加入到超濾管中，離心10分鐘，用HEPES緩沖液(pH7.4)重復(fù)洗滌6 次后，抗體稀釋到lmg/ml備用。取lmg感光微球，用HEPES緩沖液(pH7.4)重復(fù)清洗兩次，離 心，去除上清。
[0056] 2)將抗體溶液加入到感光微球(購自鉑金埃爾默公司）中，重懸。
[0057] 3)加入 2·5μ1 10%Tween20〇
[0058] 4)加入10μ1 400mM NaCNBH3,加入HEPES緩沖液將體積補(bǔ)足到200μ1。
[0059] 5)37°C震蕩反應(yīng)24-48小時(shí)。
[0060] 6)封閉：用800mMNa0H配制65mg/ml CM0溶液。加10μ1 CM0溶液到反應(yīng)體系中。
[0061] 7)37°(：震蕩反應(yīng)1小時(shí)。
[0062] 8)離心，去除上清。
[0063] 9)加入200ylTris-HCl(pH8.0)緩沖液重懸，離心，去除上清。重復(fù)一次。
[0064] 10)最后一次離心后用200μ1 PBS緩沖液(pH7-8)和牛血清白蛋白混合液重懸微 球，終濃度5mg/ml，使用前稀釋至所需濃度。
[0065]三、試劑盒的制備 [0066]按所述用量量取各個(gè)組分：
[0068] 加入90ml蒸餾水溶解后調(diào)節(jié)pH到7.4,水補(bǔ)足到100ml，制成分析緩沖液。
[0069] 1)使用分析緩沖液稀釋偶聯(lián)CK-MB抗體的發(fā)光微球濃度為10-200μg/ml;
[0070] 2)使用分析緩沖液稀釋偶聯(lián)CK-MB抗體的感光微球濃度為10-200μg/ml。
[0071]實(shí)施例2試劑盒應(yīng)用
[0072]試劑盒使用方法，包括如下步驟：
[0073] 1)在試劑盒的反應(yīng)孔中加入樣品、抗CK-MB抗體偶聯(lián)的發(fā)光微球和抗CK-MB抗體偶 聯(lián)的感光微球，混合反應(yīng)5-60分鐘；
[0074] 2)激發(fā)光照射反應(yīng)孔，測(cè)量每個(gè)反應(yīng)孔發(fā)光量獲得光信號(hào)值。
[0075]本發(fā)明試劑盒方法學(xué)評(píng)價(jià)：
[0076] 1.線性
[0077] 配制濃度為Ong/ml，10ng/ml，25ng/ml，50ng/ml，100ng/ml，250ng/ml，500ng/ml， 的CK-MB標(biāo)準(zhǔn)品溶液。在反應(yīng)孔中分別加入5μ1標(biāo)準(zhǔn)品、加入20μ1偶聯(lián)CK-MB抗體的發(fā)光微球 (終濃度l〇μg/ml)，加入20μ1偶聯(lián)CK-MB抗體的感光微球(終濃度10μg/ml)，室溫暗處溫育15 分鐘。溫育后，激發(fā)光照射反應(yīng)孔，測(cè)量每個(gè)反應(yīng)孔發(fā)光量獲得光信號(hào)值。
[0078] 如上用本發(fā)明所制備的CK-MB含量檢測(cè)試劑盒對(duì)其進(jìn)行檢測(cè)，繪制各檢測(cè)試劑盒 標(biāo)準(zhǔn)工作曲線（見附圖2)。從附圖2可以看出本發(fā)明所制備的檢測(cè)試劑盒能保持良好的線 性，CK-MB濃度為500ng/ml時(shí)方法無 Hook效應(yīng)。
[0079] 2.準(zhǔn)確度
[0080] 準(zhǔn)確性測(cè)量是指用已知量CK-MB標(biāo)準(zhǔn)品加入到正常人的血清標(biāo)本中，測(cè)量加入后 濃度值與加入的理論值進(jìn)行比較，計(jì)算CK-MB的回收率。檢測(cè)結(jié)果如下：
[0082] 3.精密度
[0083]選取3份不同濃度的標(biāo)本，分別按照本發(fā)明所述的方法重復(fù)測(cè)量20次。根據(jù)20次的 測(cè)量結(jié)果，計(jì)算平均偏差C.V. %值。
[0085] 4.分析靈敏度
[0086] 分析靈敏度的定義為:是指在統(tǒng)計(jì)學(xué)意義上能與零劑量區(qū)別的量。重復(fù)20次測(cè)量 零劑量點(diǎn)，計(jì)算其平均值(X)和標(biāo)準(zhǔn)差(SD)，以X+2SD的計(jì)算的濃度值即為該試劑盒的分析 靈敏度。本發(fā)明試劑盒的分析靈敏度為〇. 5ng/ml。
[0087] 5.特異性
[0088] 檢測(cè)本發(fā)明的氧通道化學(xué)發(fā)光免疫分析試劑在干擾性物質(zhì)(溶血、高血脂、高膽紅 素)存在的情況下檢測(cè)標(biāo)本的準(zhǔn)確性。將血紅蛋白溶液(5mg/ml)分別取適量加入到lml的 CK-MB陽性血清標(biāo)本中，使血清中血紅蛋白的含量分別為lmg/ml、0.5mg/ml。將甘油三酯溶 液(5mg/ml)分別取適量加入到lml的CK-MB陽性血清標(biāo)本中，使血清中甘油三酯的含量分別 為lmg/mL、0.5mg/ml。將膽紅素溶液(5mg/ml)分別取適量加入到lml的CK-MB陽性血清標(biāo)本 中，使血清中膽紅素的含量分別為50μg/ml、25μg/ml。對(duì)加入了血紅蛋白、甘油三酯和膽紅 素的CK-MB陽性標(biāo)本進(jìn)行測(cè)定，在反應(yīng)孔中每孔分別加入5μ1含加入了血紅蛋白、甘油三酯 和膽紅素的CK-MB陽性標(biāo)本，加入20μ1偶聯(lián)抗CK-MB抗體的發(fā)光微球(終濃度10μg/ml)，加入 20μ1偶聯(lián)CK-MB抗體的感光微球(終濃度10μg/ml)，室溫暗處溫育15分鐘。溫育后，激發(fā)光照 射反應(yīng)孔，測(cè)量每個(gè)反應(yīng)孔發(fā)光量獲得光信號(hào)值。將理論濃度與實(shí)測(cè)濃度的比值作為回收 率，回收率在95.69 % -104.16 %之間。表明CK-MB氧通道化學(xué)發(fā)光試劑在檢測(cè)血清樣本時(shí)不 受血紅蛋白、甘油三酯、膽紅素的干擾。
[0091] 6.相關(guān)性
[0092] 如圖3所示，與羅氏CK-MB化學(xué)發(fā)光試劑盒的相關(guān)性為:y = 0.9871x+0.7294，R2 = 0.9931
[0093]本發(fā)明與現(xiàn)有方法和產(chǎn)品相比，具有檢測(cè)靈敏度高、特異性好、成本較低，對(duì)檢測(cè) 儀器要求低的優(yōu)點(diǎn)。
[0094]本發(fā)明的原理(見附圖1)是通過在均相條件下將偶聯(lián)了抗CK-MB抗體的帶有酞菁 染料的感光微球1，包被有二甲基噻吩、蒽等活性分子且?guī)в袖B螯合物、偶聯(lián)了抗CK-MB抗體 的發(fā)光微球2混合。此時(shí)偶聯(lián)了抗CK-MB抗體感光微球1和偶聯(lián)了抗CK-MB抗體的發(fā)光微球2 迅速有效地識(shí)別檢測(cè)樣本3的目標(biāo)分子而形成免疫夾心復(fù)合物。在激光(波長為680nm)的照 射下，感光微球上的光敏劑將周圍環(huán)境中的氧氣轉(zhuǎn)化為更為活躍的單線態(tài)氧。單線態(tài)氧擴(kuò) 散至發(fā)光微球，與其上的化學(xué)發(fā)光劑反應(yīng)，進(jìn)一步激活了同樣在發(fā)光微球上的熒光基團(tuán)，使 之發(fā)出熒光，波長為615nm。單線態(tài)氧的半衰期為4ys，在溶液中的擴(kuò)散距離為200nm左右。如 果生物分子不存在相互作用，單線態(tài)氧無法擴(kuò)散到發(fā)光微球，則不會(huì)有熒光信號(hào)產(chǎn)生。 [0095] 實(shí)施例3
[0096]與實(shí)施例1基本相同，不同之處僅在于所用發(fā)光微球?yàn)轸然l(fā)光微球，所用感光微 球?yàn)轸然泄馕⑶颍?br>[0097]經(jīng)過實(shí)施例2方法學(xué)進(jìn)行驗(yàn)證，其線性、準(zhǔn)確度、精密度、分析靈敏度、特異性和相 關(guān)性與實(shí)施例1結(jié)果基本相同。
[0098] 實(shí)施例4
[0099] 與實(shí)施例1基本相同，不同之處僅在于所用發(fā)光微球?yàn)榘被l(fā)光微球，所用感光微 球?yàn)榘被泄馕⑶颍?br>[0100] 經(jīng)過實(shí)施例2方法學(xué)進(jìn)行驗(yàn)證，其線性、準(zhǔn)確度、精密度、分析靈敏度、特異性和相 關(guān)性與實(shí)施例1結(jié)果基本相同。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種一步均相CK-MB檢測(cè)試劑盒，其特征在于，包括： (1) 抗CK-MB抗體偶聯(lián)的發(fā)光微球試液； (2) 抗CK-MB抗體偶聯(lián)的感光微球試液； (3) 分析緩沖液； 以及能夠接收和發(fā)射光的反應(yīng)孔。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一步均相CK-MB檢測(cè)試劑盒，其特征在于，所述抗CK-MB抗體為 針對(duì)CK-MB不同表位的單克隆抗體或多克隆抗體。3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一步均相CK-MB檢測(cè)試劑盒，其特征在于，所述發(fā)光微球表面 活性基團(tuán)為醛基、羧基或氨基，發(fā)光微球帶有發(fā)光化合物和鑭系元素化合物的高分子，發(fā)光 微球大小為100-300nm;所述感光微球表面活性基團(tuán)為醛基、羧基或氨基，感光微球帶有光 激發(fā)產(chǎn)生單線態(tài)氧的染料，感光微球大小為100-300nm。4. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的一步均相CK-MB檢測(cè)試劑盒，其特征在于，所述發(fā)光化合物為 二氧雜環(huán)己烯或二甲基噻吩的衍生物，鑭系元素化合物為Eu(TTA) 3/TOPO或Eu(TTA)3/Phen; 所述染料為酞箐染料或葉綠素。5. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一步均相CK-MB檢測(cè)試劑盒，其特征在于，所述抗CK-MB抗體偶 聯(lián)的發(fā)光微球，其中發(fā)光微球與抗CK-MB抗體的質(zhì)量比為（1-100): 1;所述抗CK-MB抗體偶聯(lián) 的發(fā)光微球試液的濃度為10_200μg/ml。6. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一步均相CK-MB檢測(cè)試劑盒，其特征在于，所述抗CK-MB抗體偶 聯(lián)的感光微球，其中感光微球與抗CK-MB抗體的質(zhì)量比為（1-100): 1;所述抗CK-MB抗體偶聯(lián) 的感光微球試液的濃度為10-200μg/ml。7. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一步均相CK-MB檢測(cè)試劑盒，其特征在于，所述反應(yīng)孔為微孔 板、微流控試劑盤、反應(yīng)杯或反應(yīng)管;所述分析緩沖液的制備，包括如下步驟 :將HEPES0.1-2g、BSA 0.1-5g、Casein 0.1-5g、NaCl 0.5-3g、Triton X-100 0.01-lml加入蒸餾水溶解 后，制成分析緩沖液。8. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一步均相CK-MB檢測(cè)試劑盒，其特征在于，所述抗CK-MB抗體偶 聯(lián)的發(fā)光微球試液或抗CK-MB抗體偶聯(lián)的感光微球試液主要由以下步驟制成： (1) 將抗體加入到超濾管中，離心，用HEPES緩沖液(pH7.4)重復(fù)洗滌，抗體稀釋到lmg/ ml備用;取發(fā)光微球或者感光微球，用HEPES緩沖液(pH7.4)重復(fù)清洗兩次，離心，去除上清； (2) 將抗體溶液加入到發(fā)光微球或感光微球中，重懸； (3) 加入 10%Tween20; (4) 加入400mM NaCNBH3，加入HEPES緩沖液將體積補(bǔ)足； (5) 37°C震蕩反應(yīng)24-48小時(shí)； (6) 封閉：用800mMNa0H配制65mg/ml CMO溶液，加到反應(yīng)體系中； (7) 37°C震蕩反應(yīng)； (8) 尚心，去除上清； (9) 加入Tr i s-HCl (pH8.0)緩沖液重懸，離心，去除上清，重復(fù)一次； (10) 最后一次離心后用roS緩沖液和牛血清白蛋白混合液重懸微球，終濃度5mg/ml，使 用前稀釋至所需濃度。9. 權(quán)利要求1-8任一項(xiàng)所述一步均相CK-MB檢測(cè)試劑盒在檢測(cè)CK-MB含量中的應(yīng)用。10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的應(yīng)用，其特征在于，檢測(cè)方法包括以下步驟： (1) 在試劑盒的反應(yīng)孔中加入樣品、抗CK-MB抗體偶聯(lián)的發(fā)光微球試液和抗CK-MB抗體 偶聯(lián)的感光微球試液，混合反應(yīng)5-60分鐘； (2) 激發(fā)光照射反應(yīng)孔，測(cè)量每個(gè)反應(yīng)孔發(fā)光量獲得光信號(hào)值； (3) 繪制CK-MB濃度與光信號(hào)值的標(biāo)準(zhǔn)曲線，利用步驟(2)測(cè)得的光信號(hào)值，通過標(biāo)準(zhǔn)曲 線計(jì)算CK-MB含量。
【文檔編號(hào)】G01N33/577GK106093411SQ201610419940
【公開日】2016年11月9日
【申請(qǐng)日】2016年6月13日 公開號(hào)201610419940.3, CN 106093411 A, CN 106093411A, CN 201610419940, CN-A-106093411, CN106093411 A, CN106093411A, CN201610419940, CN201610419940.3
【發(fā)明人】李明明, 黃寶福, 淳林
【申請(qǐng)人】南京普朗醫(yī)療設(shè)備有限公司