一種基于免疫磁珠富集沙門氏菌的方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種基于免疫磁珠富集沙門氏菌的方法，屬于微生物檢測領(lǐng)域。本發(fā)明中免疫磁珠富集沙門氏菌的方法具體包括：（1）將待測樣品用磷酸鹽緩沖液制成待測樣品勻液，吸取適量，加入到150～300μl磁珠中，37℃反應(yīng)30～60min；（2）將其置于磁鐵上作用2～3min，使磁鐵充分吸附后，棄去懸浮液，加入1ml的PBS重復(fù)洗滌3次；（3）將富集后的沙門氏菌在XLT4瓊脂培養(yǎng)基上培養(yǎng)24h，計(jì)數(shù)確定樣品中沙門氏菌的數(shù)量；該方法特異性強(qiáng)，準(zhǔn)確度高，檢測時(shí)間短，操作簡單，不需要大型儀器和特殊培訓(xùn)的專業(yè)人員，樣品不需要特殊前處理，可應(yīng)用于雞蛋、畜禽組織、飼料、水、畜禽糞樣中沙門氏菌的檢測。
【專利說明】一種基于免疫磁珠富集沙門氏菌的方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于微生物檢測【技術(shù)領(lǐng)域】，具體涉及一種基于免疫磁珠富集沙門氏菌的方法。

【背景技術(shù)】
[0002]沙門tMiSalmorwlla)是腸桿菌科中一種重要的人畜共患、革蘭氏陰性病原菌。動(dòng)物源性沙門氏菌易引起攝食者急性腹瀉，甚至暴發(fā)食物中毒，導(dǎo)致胃腸炎、傷寒及副傷寒，其中肉類和家禽類是沙門氏菌傳播的主要媒介。近年來，沙門氏菌在全球范圍內(nèi)引起的危害呈不斷上升趨勢，公共衛(wèi)生學(xué)上，具有十分重要的意義。
[0003]沙門氏菌的檢測難點(diǎn)在于含量低、干擾測定的基體成分復(fù)雜，給準(zhǔn)確測定造成了很大的困難。因此，在國標(biāo)的食品微生物檢測方法中，采用兩步增菌法以提高沙門氏菌的檢出率，如利用緩沖蛋白胨水(BPW)進(jìn)行預(yù)增菌后，采用亞硒酸鹽胱氨酸增菌液(SC)進(jìn)行選擇性增菌，并劃線于木糖賴氨酸脫氧膽鹽瓊脂(XLD)上。這個(gè)方法雖然能夠在一定程度上選擇性分離鑒定沙門氏菌，但是耗時(shí)長(約72h)，操作繁瑣，不利于快速檢測及推廣應(yīng)用。
[0004]免疫磁珠(Imrnunomagnetiebead, IMB)簡稱磁珠，它是20世紀(jì)70年代中期發(fā)展起來的一種新型免疫學(xué)技術(shù)，它以免疫學(xué)為基礎(chǔ)，滲透到病理、藥理、生理、微生物、生化及分子遺傳學(xué)等各個(gè)領(lǐng)域，其應(yīng)用日趨廣泛。近些年來已經(jīng)有免疫磁珠技術(shù)用于檢測細(xì)菌的報(bào)道，其主要特點(diǎn)是:分離速度快，效率高，可重復(fù)性好；操作簡單且不需要昂貴的設(shè)備；不會(huì)影響被分離物質(zhì)的生物學(xué)特性和功能。本發(fā)明采用沙門氏菌特異性免疫磁珠從樣品中富集微量沙門氏菌，樣品用量少且不會(huì)傷及細(xì)菌，與國標(biāo)中傳統(tǒng)分離培養(yǎng)法相比，省去了繁瑣耗時(shí)長的預(yù)增菌和選擇性增菌過程，直接對(duì)沙門氏菌進(jìn)行分離，節(jié)約了檢測時(shí)間42?48h。此外，由于免疫磁珠能夠識(shí)別性質(zhì)極為相似的其他菌株，如奇異變形桿菌，特異性吸附沙門氏菌，避免了樣品中的復(fù)雜成分對(duì)檢測結(jié)果的干擾，提高了檢測準(zhǔn)確性。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明旨在針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)不足，提供一種基于免疫磁珠的沙門氏菌富集方法。磁珠在合適的條件下與沙門氏菌特異性抗體進(jìn)行偶聯(lián)，制成沙門氏菌特異性免疫磁珠，將沙門氏菌特異性免疫磁珠加入到經(jīng)過前處理的待測樣品中，在一定條件下捕獲沙門氏菌。
[0006]為實(shí)現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明采取的技術(shù)方案是:該用于富集沙門氏菌的特異性免疫磁珠的制備方法是以磁珠為載體，偶聯(lián)沙門氏菌特異性抗體，制備成能夠富集沙門氏菌的免疫磁珠。
[0007]一種用于富集沙門氏菌的特異性的免疫磁珠的制備方法，該方法以磁珠為載體，偶聯(lián)沙門氏菌特異性抗體，制備成能夠富集沙門氏菌的免疫磁珠；
具體方法是:
(I)取500μ1的磁性載體，置于離心管里，棄去保存液，加入0.01?0.1M ΡΗ6.0?7.4的PBS緩沖液； (2)向上述混合液中加入500μ1沙門氏菌特異性抗體，室溫下，在振蕩器上反應(yīng)6 h后，置于磁場中，分離上清液。
[0008]上述方法中所涉及的磁性載體的制備方法如下: (1)配置27%的卩6(:13*6!120溶液和卩6(:12(7.28 FeCl2.4H20+20 ml H20+4 ml HCl)溶液。
[0009](2)待FeC12溶液變?yōu)闇\綠色后，將27%的FeCl3* 6H20溶液29 ml加入到其中，并補(bǔ)水至100 ml，攪拌使其均勻；
(3)向上述混合溶液中加入40 ml氨水，劇烈攪拌20 min。將磁鐵置于燒杯底部，待溶液中磁性顆粒沉淀后，倒去上清液，再加入40ml 7jC，攪拌1min后，除去水；
(4)將油酸6g置于60°C水浴中加熱lOmin，然后將其加入已除去水的磁性顆粒中，并于60°C水浴中攪拌20min。移去多余油酸,加入10ml乙醇攪拌洗漆1min,洗2次；
(5)量取1ml辛烷，先用滴管向上述磁性顆粒中緩慢滴加辛烷約2ml，混勻，然后，每次緩慢滴加辛烷l_2ml，每次加完辛烷后，可將磁鐵置于燒杯底部，觀察是否出現(xiàn)磁流體現(xiàn)象，如出現(xiàn)，則制備成功，放入冰箱保存；如未出現(xiàn)，則繼續(xù)滴加辛烷，直至出現(xiàn)磁流體現(xiàn)象；
(6)取Iml磁流體，加入20ml丙酮，劇烈搖動(dòng)。將磁鐵置于燒杯底部,5min后移去上清，重復(fù)3次。60°C真空干燥20min，之后加入20ml甲苯，超聲Ih;
(7)取Iml4.65 mg/ml的磁顆粒,加入到含有20ml異丙醇、2ml去離子水和I ml氨水的混合物中，300rpm機(jī)械攪拌lOmin。之后,加入2ml正娃酸乙酯,室溫下,磁性攪拌24h。用乙醇洗滌數(shù)次，直至PH為7 ;
(8)稱取干燥的磁顆粒300mg,分散在600ml乙醇中，加入3ml去離子水,超聲20min。之后，加入120μ1 APTES (3-氨丙基三乙氧基娃燒),磁力攪拌7h。8000rpm離心30min,棄上清，將沉淀用超聲分散在乙醇中，磁分離5次。4°C冰箱保存，備用。
[0010]一種用于富集沙門氏菌的特異性的免疫磁珠的制備方法，所涉及的沙門氏菌特異性抗體制備方法具體如下:
(I)沙門氏菌外膜蛋白OmpC的克隆
采用煮沸法提取雞白痢沙門氏菌DNA模板，根據(jù)GenBank中雞白痢沙門氏菌基因序列，設(shè)計(jì)兩端含有限制性內(nèi)切酶Sac I和Hind III酶切位點(diǎn)的引物，引物序列(OmpC-F、OmpC-R)如下所示:
OmpC-F:5’ -CGAGCTCATGGTTAAAGTACTGTCCCTC-3’
OmpC-R:5’ -CCCAAGCTTGGTGGACATGTTTTTGTT-3’
以雞白痢沙門氏菌標(biāo)準(zhǔn)菌株(CVCC 533)模板，對(duì)OmpC基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增，其反應(yīng)體系(總 25μ L):5XMIX 10μ L，上游引物(20ymol/L):0.5μ L，下游引物(20ymol/L):0.5μ L，DNA模板:2μ L，ddH20:12μ L。瞬時(shí)離心后置PCR儀上擴(kuò)增。反應(yīng)條件為:95°C 5min ；94°Clmin，57°C lmin，72°C lmin，共30個(gè)循環(huán)；最后72 V lOmin。反應(yīng)結(jié)束后，用1%瓊脂糖凝膠電泳觀察鑒定PCR反應(yīng)產(chǎn)物。將純化后的PCR產(chǎn)物與PMD19-T載體連接。分別取PMD19-T載體0.8 μ?、克隆片段4.2 μ?、及5μ1 solut1nl，加入PCR薄壁管中，16 °C連接3 h。之后進(jìn)行轉(zhuǎn)化，并對(duì)陽性克隆子進(jìn)行驗(yàn)證。
[0011](2)原核表達(dá)質(zhì)粒pET32 a (+)_0mpC的構(gòu)建
將測序正確的陽性克隆PMD19-T-0mpC和pET_32a ( + )于含Amp的LB液體培養(yǎng)基中增菌培養(yǎng)12-16 h。陽性重組質(zhì)粒及表達(dá)載體進(jìn)行質(zhì)粒提取，采用I %瓊脂糖凝膠電泳檢測質(zhì)粒酶切的效果，電泳結(jié)束后凝膠成像系統(tǒng)分析。對(duì)提取到的質(zhì)粒PMD19-T-0mpC和pET_32a(+ )進(jìn)行雙酶切，將酶切產(chǎn)物PMD19-T-0mpC和pET-32a ( + )載體進(jìn)行連接，之后進(jìn)行轉(zhuǎn)化，從轉(zhuǎn)化平板上隨機(jī)挑取菌落，進(jìn)行雙酶切驗(yàn)證。
[0012](3) OmpC的誘導(dǎo)表達(dá)
將含有陽性質(zhì)粒BL21-pET32a-0mpC重組菌劃線接種于含有Amp (濃度為100 Pg/mL)的LB固體培養(yǎng)基，于37 °C恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12-24 h ;分別挑取新鮮單個(gè)菌落，無菌接種于5 mL Amp LB液體培養(yǎng)基中，37°C振蕩培養(yǎng)12-16 h，然后以I %的菌液量接種于LB/Amp液體培養(yǎng)基中，37°C振蕩培養(yǎng)4 h (菌液OD45tl達(dá)到0.6-1.0)時(shí)，取ImL未誘導(dǎo)的菌液另行培養(yǎng)，其余菌液加入IPTG至終濃度1.0 mmol/L,25 °C繼續(xù)劇烈振蕩培養(yǎng)4 h。同時(shí)做空載體對(duì)照，觀察表達(dá)情況；
取IPTG誘導(dǎo)后菌液5500rpm 15min，細(xì)胞洗滌后收集細(xì)胞。加入20mmol/L Tris-Cl(pH8.0)懸浮沉淀細(xì)胞，超聲波破碎，然后12000 rpm離心20min，分別保存上清和沉淀，力口Λ 100 μ L IX SDS凝膠加樣緩沖液,混勻后沸水浴5min, 12000 rpm離心I min,取上清于12%的SDS-PAGE電泳檢測重組蛋白的表達(dá)。
[0013](4)重組目的蛋白的純化:采用200mM的咪唑?qū)χ亟M目的蛋白進(jìn)行洗脫純化，之后取洗脫液10 μ?進(jìn)行電泳驗(yàn)證，觀察蛋白的純度。
[0014](5)免疫原的制備:取純化后的蛋白與等體積的弗氏完全佐劑和弗氏不完全佐劑進(jìn)行研磨，充分乳化后，然后免疫實(shí)驗(yàn)兔。
[0015](6)新西蘭兔的免疫:選購試驗(yàn)用兔，從兔耳緣靜脈采血，與雞白痢沙門氏菌進(jìn)行凝集實(shí)驗(yàn)，選擇不出現(xiàn)凝集沉淀反應(yīng)的兔子進(jìn)行實(shí)驗(yàn)；
分四次進(jìn)行免疫:第一次免疫時(shí)加氟氏完全佐劑，免疫劑量為Iml/只，免疫形式為腳墊和皮下多點(diǎn)注射；間隔14天后，進(jìn)行第二次免疫，加氟氏不完全佐劑，免疫劑量為0.5ml/只，免疫形式為皮下多點(diǎn)注射；間隔22天后，進(jìn)行第三次免疫，加氟氏不完全佐劑，免疫劑量為0.5ml/只，免疫形式為皮下多點(diǎn)注射；間隔25天后，進(jìn)行第四次免疫，不加佐劑，免疫劑量為0.2ml/只，免疫形式為耳緣靜脈注射。第四次免疫后采血提取抗體。
[0016](7)血清抗體效價(jià)測定
將待測兔血清按1:2 ；1:22 ；1:23......1:215梯度稀釋，采用玻片凝集法測定抗體效價(jià)。
[0017](8)飽和硫酸銨分級(jí)純化抗體
首先對(duì)血清進(jìn)行預(yù)處理，低溫高速離心(4°C, 12000rpm/min, 15_20min),可去除細(xì)胞殘?jiān)托☆w粒物質(zhì)。參考抗體理論與技術(shù)的抗體分離純化方法對(duì)制備的抗體進(jìn)行純化；
所得抗體即為沙門氏菌特異性抗體。
[0018]一種用于富集沙門氏菌的特異性免疫磁珠的應(yīng)用方法，是通過將沙門氏菌特異性免疫磁珠添加到各種待檢樣品中，在一定條件下達(dá)到分離或富集并檢測沙門氏菌的目的；
具體步驟是:
(I)將待測樣品用磷酸鹽緩沖液(0.0lM?0.1M，PH6.0?7.4)制成一定比例的待測樣品勻液，取100?200 μ?，加入到150?300μ1磁珠中，37°C反應(yīng)30?60min。
[0019](2)將其置于磁鐵上作用2?3min,使磁鐵充分吸附后,棄去懸浮液,加入Iml的
0.01?0.1M PH6.0?7.4的PBS重復(fù)洗滌3次。
[0020](3)將富集后的沙門氏菌在XLT4瓊脂培養(yǎng)基上37°C培養(yǎng)24h，計(jì)數(shù)，獲得樣品中沙門氏菌的數(shù)量。
[0021]在步驟(I)中所述待測樣品包括雞蛋、畜禽組織、飼料、水、畜禽糞樣。
[0022]在步驟(I)中所述的畜禽組織與磷酸鹽緩沖液的W:V比為1:9 ;飼料與磷酸鹽緩沖液的W:V比為1:9 ;畜禽糞樣與磷酸鹽緩沖液的W:V比為1:9 ;水與磷酸鹽緩沖液的體積比為1:9 ;蛋清蛋黃混合物與磷酸鹽緩沖液的體積比為1:9 ;蛋殼加入到50?10ml磷酸鹽緩沖液中。
[0023]本發(fā)明的有益效果是:
(I)提高檢測靈敏度和準(zhǔn)確度:利用沙門氏菌特異性免疫磁珠對(duì)沙門氏菌進(jìn)行富集，能夠捕獲樣品中微量沙門氏菌的同時(shí)，還能去除樣品中除目標(biāo)菌以外的其他成分，以防止對(duì)檢測準(zhǔn)確性的干擾，有效避免或減少假陽性。
[0024](2)縮短檢測時(shí)間:與沙門氏菌傳統(tǒng)分離培養(yǎng)法相比，利用免疫磁珠富集沙門氏菌，能夠有效代替檢測過程中的增菌步驟，檢測時(shí)間由72h縮短至25h。
[0025](3)操作簡便、應(yīng)用廣泛:本發(fā)明中用于富集沙門氏菌的特異性免疫磁珠的制備方法操作簡便，不需要大型儀器和特殊培訓(xùn)的專業(yè)人員，樣品不需要特殊前處理，可應(yīng)用于雞蛋、畜禽組織、飼料、水、畜禽糞樣中沙門氏菌的檢測。

【具體實(shí)施方式】
[0026]下面通過實(shí)施例對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步詳細(xì)說明，這些實(shí)施例僅用來說明本發(fā)明，并不限制本發(fā)明的范圍。
[0027]一、沙門氏菌特異性免疫磁珠的制備:
實(shí)施例1、
取500μ1的磁性載體，置于離心管里，棄去保存液，加入0.0lM PH 7.4的PBS緩沖液；然后加入500μ1沙門氏菌特異性抗體，室溫下，在振蕩器上反應(yīng)6h后，置于磁場中，分離上清液。
[0028]實(shí)施例2
取500μ1的磁性載體，置于離心管里，棄去保存液，加入0.1M ΡΗ6.0的PBS緩沖液；然后加入500μ1沙門氏菌特異性抗體，室溫下，在振蕩器上反應(yīng)6 h后，置于磁場中，分離上清液。
[0029]二、沙門氏菌特異性抗體對(duì)樣品中沙門氏菌富集的應(yīng)用:
實(shí)施例1
將雞蛋打開，把蛋清、蛋黃倒入無菌容器中，充分混勻，吸取25mL混合物至盛有225mL
0.0lM PH 7.4 PBS緩沖液的無菌錐形瓶中，充分混勻，制成1:10的樣品勻液。取200 μ?樣品勻液，加入到300μ1磁珠中，37°C反應(yīng)30min。將其置于磁鐵上作用2?3min，使磁鐵充分吸附后，棄去懸浮液，加入Iml的0.0lM PH7.4的PBS重復(fù)洗滌3次。將富集后的沙門氏菌在XLT4瓊脂培養(yǎng)基上37°C培養(yǎng)24h，計(jì)數(shù)確定樣品中沙門氏菌的數(shù)量。
[0030]實(shí)施例2
將雞蛋打開，去掉蛋清、蛋黃，用無菌0.0lM PH 7.4 PBS緩沖液沖洗蛋殼內(nèi)膜2?3次，輕輕捏碎雞蛋殼后，將其移入盛有50mL 0.0lM PH 7.4 PBS緩沖液的無菌均質(zhì)杯內(nèi)，lOOOOr/min均質(zhì)I?2分鐘，制成樣品勻液。取200 μ?樣品勻液，加入到300μ1磁珠中，37°C反應(yīng)30min。將其置于磁鐵上作用2?3min，使磁鐵充分吸附后，棄去懸浮液，加入Iml的0.0lM PH7.4的PBS重復(fù)洗滌3次。將富集后的沙門氏菌在XLT4瓊脂培養(yǎng)基上37°C培養(yǎng)24h，計(jì)數(shù)確定樣品中沙門氏菌的數(shù)量。
[0031]實(shí)施例3
將雞蛋打開，去掉蛋清、蛋黃，用無菌0.0lM PH 7.4 PBS緩沖液沖洗蛋殼內(nèi)膜2?3次，輕輕捏碎雞蛋殼后，將其移入盛有10mL 0.0lM PH 7.4 PBS緩沖液的無菌均質(zhì)杯內(nèi)，10000r/min均質(zhì)I?2分鐘，制成樣品勻液。取200 μ?樣品勻液，加入到300μ1磁珠中，37°C反應(yīng)30min。將其置于磁鐵上作用2?3min，使磁鐵充分吸附后，棄去懸浮液，加入Iml的0.0lM PH7.4的PBS重復(fù)洗滌3次。將富集后的沙門氏菌在XLT4瓊脂培養(yǎng)基上37°C培養(yǎng)24h，計(jì)數(shù)確定樣品中沙門氏菌的數(shù)量。
[0032]實(shí)施例4
稱取25g畜禽組織類樣品至盛有225mL 0.0lM PH 7.4 PBS緩沖液的無菌均質(zhì)杯內(nèi)，10000r/min均質(zhì)I?2分鐘，制成1:10的樣品勻液。取200 μ?樣品勻液，加入到300μ1磁珠中，37°C反應(yīng)30min。將其置于磁鐵上作用2?3min，使磁鐵充分吸附后，棄去懸浮液，力口入Iml的0.0lM PH7.4的PBS重復(fù)洗滌3次。將富集后的沙門氏菌在XLT4瓊脂培養(yǎng)基上37°C培養(yǎng)24h，計(jì)數(shù)確定樣品中沙門氏菌的數(shù)量。
[0033]實(shí)施例5
吸取25mL待測水樣至盛有225mL 0.0lM PH 7.4 PBS緩沖液的無菌錐形瓶中，充分混勻，制成1:10的樣品勻液。取200 μ?樣品勻液，加入到300μ1磁珠中，37°C反應(yīng)30min。將其置于磁鐵上作用2?3min，使磁鐵充分吸附后，棄去懸浮液，加入Iml的0.0lM PH7.4的PBS重復(fù)洗滌3次。將富集后的沙門氏菌在XLT4瓊脂培養(yǎng)基上37°C培養(yǎng)24h，計(jì)數(shù)，獲得樣品中沙門氏菌的數(shù)量。
[0034]實(shí)施例6
稱取25g飼料(粉狀飼料、顆粒料)至盛有225mL 0.0lM PH 7.4 PBS緩沖液的無菌均質(zhì)杯內(nèi)，10000r/min均質(zhì)I?2分鐘，制成1:10的樣品勻液。取200μ1樣品勻液，加入到300μ1磁珠中，37°C反應(yīng)30min。將其置于磁鐵上作用2?3min，使磁鐵充分吸附后，棄去懸浮液，加入Iml的0.0lM PH7.4的PBS重復(fù)洗滌3次。將富集后的沙門氏菌在XLT4瓊脂培養(yǎng)基上37°C培養(yǎng)24h，計(jì)數(shù)，獲得樣品中沙門氏菌的數(shù)量。
[0035]實(shí)施例7
稱取25g畜禽糞樣至盛有225mL 0.0lM PH 7.4 PBS緩沖液的無菌均質(zhì)杯內(nèi)，1000r/min均質(zhì)I?2分鐘，制成1:10的樣品勻液。取200 μ?樣品勻液，加入到300μ1磁珠中，37°C反應(yīng)30min。將其置于磁鐵上作用2?3min，使磁鐵充分吸附后，棄去懸浮液，加入Iml的0.0lM PH7.4的PBS重復(fù)洗滌3次。將富集后的沙門氏菌在XLT4瓊脂培養(yǎng)基上37°C培養(yǎng)24h，計(jì)數(shù)，獲得樣品中沙門氏菌的數(shù)量。
【權(quán)利要求】
1.一種基于免疫磁珠富集沙門氏菌的方法，其特征是:用于制備所述免疫磁珠的特異性抗體為沙門氏菌外膜蛋白免疫新西蘭兔獲得。
2.一種基于免疫磁珠富集沙門氏菌的方法，其特征在于按如下步驟進(jìn)行: (1)將待測樣品用磷酸鹽緩沖液(0.011?0.11，？冊丨0?7.4)制成一定比例的待測樣品勻液，吸取100?200耵，加入到150?300耵磁珠中，371反應(yīng)30?600111 ； (2)將其置于磁鐵上作用2?30111，使磁鐵充分吸附后，棄去懸浮液，加入101的？83(0.011?0.11，？冊丨0?7.4)重復(fù)洗滌2?3次； (3)將富集后的沙門氏菌在乂114瓊脂培養(yǎng)基上371培養(yǎng)2處，計(jì)數(shù)確定樣品中沙門氏菌的數(shù)量； 在步驟(1)中所述的畜禽組織與磷酸鹽緩沖液的I ^比為1:9 ；飼料與磷酸鹽緩沖液的評(píng)比為1:9 ；畜禽糞樣與磷酸鹽緩沖液的I ^比為1:9 ；水與磷酸鹽緩沖液的體積比為1:9 ；蛋清蛋黃混合物與磷酸鹽緩沖液的體積比為1:9 ；蛋殼加入到50?10001磷酸鹽緩沖液中。
3.根據(jù)權(quán)利要求書2所述的一種基于免疫磁珠富集沙門氏菌的方法，其特征在于:所檢測樣品為雞蛋、畜禽組織、飼料、水、畜禽糞樣。
【文檔編號(hào)】G01N33/553GK104459126SQ201410772937
【公開日】2015年3月25日 申請日期:2014年12月16日 優(yōu)先權(quán)日:2014年12月16日
【發(fā)明者】王紅寧, 劉必慧, 張安云, 雷昌偉, 丁夢蝶, 張冬冬, 楊永強(qiáng) 申請人:四川大學(xué)