一種基于磁珠法的全血dna提取試劑盒及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，設(shè)及一種基于磁珠法的全血DNA提取試劑盒，可應(yīng)用 于多個(gè)物種全血DNA提取。本發(fā)明還設(shè)及應(yīng)用該試劑盒從全血樣本中提取DNA的方法。
【背景技術(shù)】 陽(yáng)00引基因組DNA中含有細(xì)胞中全部的遺傳信息，從全血中提取DNA是獲得生物基因組DNA較為簡(jiǎn)單的方法，也是進(jìn)行基因相關(guān)性研究的重要手段盒技術(shù)。DNA提取的質(zhì)量盒產(chǎn)量 直接影響著后續(xù)實(shí)驗(yàn)的準(zhǔn)確性。
[0003] 目前有多種全血DNA提取試劑盒可應(yīng)用于多種領(lǐng)域，但傳統(tǒng)的提取技術(shù)需要進(jìn)行 沉淀、離屯、等操作，并需要大量的生物樣本，導(dǎo)致使用當(dāng)前的全血DNA提取試劑盒進(jìn)行提取 存在諸多缺點(diǎn)，如提取過(guò)程復(fù)雜、樣本處理時(shí)間長(zhǎng)、樣本處理丟失大量DNA、提取步驟易錯(cuò)、 易造成樣本交叉污染、需多種儀器等。
[0004] 磁珠法屬于固相抽提法，是采用磁珠為載體的分離技術(shù)。由于磁珠法提取核算 操作簡(jiǎn)單，快速，重復(fù)性好，能從血液、動(dòng)物組織、食品、病原微生物等樣本中分離出DNA和 RNA，可應(yīng)用在疾病控制中屯、、臨床疾病診斷、輸血安全、法醫(yī)學(xué)鑒定、環(huán)境微生物檢測(cè)、食品 安全檢測(cè)、畜牧業(yè)和分子生物學(xué)研究等多種領(lǐng)域。相比傳統(tǒng)的DNA提取方法，磁珠法無(wú)需 離屯、和大量檢材，也無(wú)需接觸酪/氯仿等有毒試劑，且操作簡(jiǎn)單方便，很容易實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化操 作，基于磁珠法的核酸提取具備傳統(tǒng)DNA提取無(wú)法比擬的優(yōu)勢(shì)，是未來(lái)核酸提取發(fā)展的重 要方向。為更有效的配合磁珠法使用，需要研發(fā)適用于磁珠法的新型全血DNA提取試劑盒。

【發(fā)明內(nèi)容】

[00化]本發(fā)明的目的在于克服上述現(xiàn)有全血基因組DNA提取試劑盒的缺陷，提供一種基 于磁珠法的全血DNA提取試劑盒及其應(yīng)用，該試劑盒具有操作簡(jiǎn)單快速、使用安全、提取效 率高、制造成本低的優(yōu)點(diǎn)，提取得到的高濃度、搞純度DNA可供科研和臨床檢測(cè)之用。為了 實(shí)現(xiàn)上述技術(shù)目的，本發(fā)明試劑盒的技術(shù)方案為： 本發(fā)明提供一種全血基因組DNA提取的試劑盒，所述試劑盒中的試劑包括細(xì)胞裂解 液、結(jié)合液、洗涂液和核酸洗脫液，所述洗涂液包括洗涂液I和洗涂液II;所述細(xì)胞裂解液 含有鹽酸脈、乙二胺四乙酸、Ξ徑甲基氨基甲燒、氯化鋼和曲拉通X-100 ;所述結(jié)合液含有 聚乙二醇-8000和氯化鋼；所述洗涂液包括洗涂液I和洗涂液II，其中：所述洗涂液I含有 鹽酸脈、乙二胺四乙酸、Ξ徑甲基氨基甲燒、氯化鋼和乙醇；所述洗涂液II含有乙醇；所述 核酸洗脫液含有乙二胺四乙酸和Ξ徑甲基氨基甲燒。
[0006] 優(yōu)選地，在所述細(xì)胞裂解液中，鹽酸脈的濃度為2-lOmol/L，乙二胺四乙酸的濃度 為5-20mmol/l，S徑甲基氨基甲燒的濃度為2〇-8〇111111〇1/1，氯化鋼的濃度為100-500mmol/ L曲拉通X-100的濃度為1%-5% (v/v)，余量皆為去離子水；使用氨氧化鋼和鹽酸調(diào)節(jié)所述 細(xì)胞裂解液的抑值為7. 0-9. 0。更為優(yōu)選地，所述鹽酸脈的濃度為6mol/l，所述乙二胺四 乙酸的濃度為lOmmol/l，所述Ξ徑甲基氨基甲燒的濃度為50mmol/l、所述氯化鋼的濃度為 200mmol/l，所述曲拉通X-100的濃度為4% (v/v)，細(xì)胞裂解液的抑值調(diào)節(jié)為8. 0。
[0007] 優(yōu)選地，在所述結(jié)合液中，聚乙二醇-8000的濃度為40-50mmol/l，氯化鋼的濃度 為5mol/L。更為優(yōu)選地，所述聚乙二醇-8000的濃度為50mmol/L。
[0008] 優(yōu)選地，在所述洗涂液I中，鹽酸脈的濃度為2-lOmol/l，乙二胺四乙酸的濃度為 5-20mmol/l，S徑甲基氨基甲燒的濃度為2〇-8〇111111〇1/1，氯化鋼的濃度為100-500mmol/l， 乙醇的體積比濃度為50%-70%，余量皆為去離子水；使用氨氧化鋼和鹽酸調(diào)節(jié)所述洗涂液 I的抑值為7. 0-9. 0。更為優(yōu)選地，所述鹽酸脈的濃度為6mol/l，所述乙二胺四乙酸的濃 度為lOmmol/l，所述Ξ徑甲基氨基甲燒的濃度為50mmol/l，所述氯化鋼的濃度為200mmol/ L，所述乙醇的濃度為50% (v/v)，洗涂液I的抑值調(diào)節(jié)為8. 0。
[0009] 優(yōu)選地，在所述洗涂液II中，乙醇的濃度為50%-100% (v/v)。更為優(yōu)選地，所述乙 醇的濃度為75% (v/v)。
[0010] 優(yōu)選地，在所述核酸洗脫液中，Ξ徑甲基氨基甲燒的濃度為5-15mmol/l，乙二胺四 乙酸的濃度為1. 0-1. 5mmol/L。更為優(yōu)選地，所述Ξ徑甲基氨基甲燒的濃度為8111111〇1/1，所 述乙二胺四乙酸的濃度為1. 3mmol/L。
[0011] 本發(fā)明還提供兩種上述試劑盒的應(yīng)用方法，方法一的技術(shù)方案為，包括如下步 驟： ① 在EP管中加入抗凝全血、細(xì)胞裂解液和蛋白酶K，56°C水浴解育30分鐘； ② 再加入磁珠、結(jié)合液和無(wú)水乙醇，結(jié)合時(shí)間10分鐘； ③ 使用磁鐵將磁珠吸附至管壁，棄去EP管內(nèi)所有液體； ④ 在EP管中加入洗涂液I，混勻后，使用磁鐵將磁珠吸附至管壁，棄去管內(nèi)所有液體； ⑥在EP管中加入洗涂液II，混勻后，使用磁鐵將磁珠吸附至管壁，棄去管內(nèi)所有液體， 該步驟重復(fù)一次； ⑧在EP管中加入核酸洗脫液，于65°C水浴下洗脫5分鐘，使用磁鐵將磁珠吸附至管壁， 將洗脫液轉(zhuǎn)移至新的EP管內(nèi)，-20°C保存?zhèn)溆茫?其中：步驟①中加入的裂解液與全血的體積比為1:1-1:5 ;步驟②中加入的磁珠與結(jié) 合液的體積比為1:10-1:20 ;步驟④與步驟⑥中加入的洗涂液I和洗涂液II分別與裂解液 的體積比為5:1-10:1 ;步驟⑧中核酸洗脫液與細(xì)胞裂解液的體積比為1:1-1:5。
[0012] 優(yōu)選地，所述EP管容量為加入的試劑為：10μL濃度lOmg/mL的蛋白酶K，抗 凝全血100μ以細(xì)胞裂解液200μ以磁珠20μ以結(jié)合液100μ以無(wú)水乙醇300μ以洗涂液I 和洗涂液II各600μ以核酸洗脫液100μL。
[0013] 方法二的技術(shù)方案為，包括如下步驟： ① 96孔反應(yīng)板1排和7排加入細(xì)胞裂解液、蛋白酶Κ、結(jié)合液和無(wú)水乙醇； ② 所述96孔反應(yīng)板2排和8排加入磁珠和去離子水； ③ 所述96孔反應(yīng)板3排和9排加入洗涂液I; ④ 所述96孔反應(yīng)板4-5排和10-11排加入洗涂液II; ⑥所述96孔反應(yīng)板6排和12排加入核酸洗脫液； ⑧所述96孔反應(yīng)板1排和7排加入全血，運(yùn)行核酸提取儀，結(jié)束后將96孔反應(yīng)板6排 和12排中的核酸洗脫液轉(zhuǎn)移至新的ΕΡ管內(nèi)，-20°C保存?zhèn)溆茫?其中：所述96孔反應(yīng)板單孔內(nèi)的液體總體積小于1.OmL;步驟①中加入的細(xì)胞裂解液 為200μk300μL，結(jié)合液為50-100μL，無(wú)水乙醇的體積為200-400μL;步驟②中加入的 磁珠為20-100μ以且用300-600μL去離子水與其混勻；步驟③與步驟④中加入的洗涂液 I和洗涂液II分別為500μ心700μL;步驟⑥中加入的核酸洗脫液為50-300μL。更為優(yōu)選 地，細(xì)胞裂解液、結(jié)合液、無(wú)水乙醇的體積比為2:1:3,兩種洗涂液與細(xì)胞裂解液的體積比均 為3:1，核酸洗脫液與細(xì)胞裂解液的體積比為1:4,細(xì)胞裂解液與全血的體積比為2:1。因 96孔反應(yīng)板為8X12孔，當(dāng)所述96孔反應(yīng)板使用1排至12排時(shí)，使用核酸提取儀最多可一 次性處理16個(gè)全血樣本。
[0014] 優(yōu)選地，加入的試劑為：10μL濃度lOmg/mL的蛋白酶Κ，全血100 細(xì)胞裂解液 200μ以磁珠20μL和去離子水600μ以結(jié)合液100μ以洗涂液I和洗涂液II各600μ以核 酸洗脫液50μL。
[0015] 本發(fā)明技術(shù)方案中，待提取的全血無(wú)需進(jìn)行預(yù)處理，細(xì)胞裂解液直接與全血混合 裂解全血中的所有細(xì)胞，再利用磁珠法對(duì)裂解出的核酸進(jìn)行純化。本發(fā)明試劑盒可應(yīng)用于 多個(gè)物種全血DNA的提取，包括人類、曬齒類、鳥類等多種生物；提取過(guò)程既可W手工完成， 也可W應(yīng)用于全自動(dòng)核酸提取儀自動(dòng)完成；使用本發(fā)明試劑盒提取的全血DNA可應(yīng)用于 PCR擴(kuò)增、基因突變篩查、基因分型、基因測(cè)序等科研或法醫(yī)鑒定或臨床診斷的分析。
[0016] 與傳統(tǒng)的全血DNA提取技術(shù)相比，本發(fā)明技術(shù)方案的有益效果為： 1. 無(wú)需對(duì)全血進(jìn)行預(yù)處理，直接將全血與細(xì)胞裂解液混合并裂解全血中的所有細(xì)胞， 大大節(jié)省了全血基因組DNA提取的時(shí)間； 2. 結(jié)合液使得磁珠發(fā)揮更大的核酸結(jié)合能力，盡可能多的吸附血細(xì)胞釋放的核酸，從 而可獲取高濃度的核酸溶液； 3. 使用兩種洗涂液可W洗去全血樣本中絕大部分的蛋白、酪類、多糖等雜質(zhì)，最大限度 的減少雜質(zhì)的污染，從而獲得更高純度的核酸溶液； 4. 使用本發(fā)明的技術(shù)方案提取全血DNA，可有效的減少提取過(guò)程中核酸的損失，大大增 加提取效率，且提取過(guò)程中不使用有毒試劑和有機(jī)溶劑，可大幅降低對(duì)實(shí)驗(yàn)人員的身體傷 害； 5. 本發(fā)明試劑盒應(yīng)用于核酸提取儀，可一步完成全血DNA的提取，并可同時(shí)進(jìn)行1-16 個(gè)全血樣本的DNA提取，實(shí)現(xiàn)核酸提取的自動(dòng)化。
【附圖說(shuō)明】
[0017] 圖1為本發(fā)明實(shí)施例2中使用方法一提取的人類全血基因組DNA的瓊脂糖凝膠電 泳條帶； 圖2為本發(fā)明實(shí)施例3中使用方法二提取過(guò)程中使用的96孔反應(yīng)板立體圖； 圖3為圖2所示96孔反應(yīng)板在方法二提取過(guò)程中各排注入試劑的示意圖； 圖4為本發(fā)明實(shí)施例3中使用方法二提取的人類全血基因組DNA的瓊脂糖凝膠電泳條 帶。
【具體實(shí)施方式】
[0018] W下結(jié)合附圖通過(guò)實(shí)施例對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步說(shuō)明，W便更好地理解本發(fā)明。
[0019] 實(shí)施例1 :全血基因組DNA提取試劑盒中試劑的配制 (1) 細(xì)胞裂解液的配制：先在容量瓶中加入少量去離子水，加入濃度為6mol/L的鹽酸 脈、加入濃度為lOmmol/L的乙二胺四乙酸、加入濃度為50mmol/L的Ξ徑甲基氨基甲燒、加 入濃度為200mmol/L的氯化鋼、加入濃度為4% (v/v)的曲拉通X-100,加入去離子水至所需 體積，使用氨氧化鋼和鹽酸調(diào)節(jié)抑值，使所述細(xì)胞裂解液的抑值為8. 0,高壓蒸汽滅菌10 分鐘； (2) 結(jié)合液的配制：先在容量瓶中加入少量去離子水，加入濃度為50mmol/L的聚乙二 醇-8000,濃度為5mol/L的氯化鋼，加入去離子水至所需體積，高壓蒸汽滅菌10分鐘； (3)洗涂液I的配制：加入濃度為6mol/L的鹽酸脈、加入濃度為lOmmol/L的乙二胺四 乙酸、加入濃度為50mmol/L的Ξ徑甲基氨基甲燒、加入濃度為200mmol/L的氯化鋼，加入去 離子水至所需體積，使用氨氧化鋼和鹽酸調(diào)節(jié)抑值，使所述洗涂液I的抑值為8.0,高壓蒸 汽滅菌10分鐘； (4) 洗涂液II的配制：采用75%乙醇； (5) 核酸洗脫液的配制：加入濃度為8mmol/L的Ξ徑甲基氨基甲燒，加入濃度為 1. 3mmol/L的乙二胺四乙酸，加入去離子水至所需體積，高壓蒸汽滅菌10分鐘； 除上