專利名稱：：紅細(xì)胞膜抗原磁珠試劑盒及在血型抗體檢測(cè)方面的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明屬于生物
技術(shù)領(lǐng)域：
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背景技術(shù)：
：1900年Landsteiner發(fā)現(xiàn)了人類紅細(xì)胞的ABO血型抗原，這一劃時(shí)代的成果，開(kāi)啟了世人對(duì)臨床輸血的深入探討，并為今天的臨床安全輸血奠定了基礎(chǔ)。臨床輸血前進(jìn)行的血型血清學(xué)檢測(cè)概括為三類1、血型檢定；2、抗體篩檢和鑒定；3、交叉配血。血型檢定檢査確定受血者和獻(xiàn)血者的紅細(xì)胞血型，最主要是ABO血型和Rh血型。英國(guó)藥典特別強(qiáng)調(diào)檢測(cè)ABO血型不僅要檢測(cè)紅細(xì)胞表面抗原，而且必須還要檢測(cè)血清(或血漿)中抗體，即正反定型。也就是說(shuō)人類ABO血型表面抗原和血清(或血漿)中抗體要共同檢測(cè)，只有兩者結(jié)果相符時(shí)，即正反定型相符，才能正確判定人類ABO血型。人體內(nèi)ABO血型抗原不僅存在于紅細(xì)胞膜，而且更廣泛的存在于很多組織細(xì)胞膜和體液、分泌液中。人體內(nèi)ABO血型抗體最多是IgM類自然發(fā)生的抗體。在妊娠或輸ABO不相容血液后也可以產(chǎn)生IgG類免疫抗體。長(zhǎng)期以來(lái)，人們一直用人血清制備的抗A、抗B抗體來(lái)檢測(cè)人類ABO血型表面抗原。自從1975年Kohler和Milstein發(fā)明淋巴細(xì)胞雜交瘤技術(shù)后，單克隆抗體血型試劑逐漸取代了人血清抗體。此種單克隆抗體血型試劑在鑒定人紅細(xì)胞血型抗原，進(jìn)而判定人的血型等方面具有很多的優(yōu)點(diǎn)。然而在臨床實(shí)際工作中仍存在著許多的影響因素，例如個(gè)體差異、環(huán)境因素、藥物影響以及多種疾病等，主要是造成紅細(xì)胞表面抗原的抗原性減弱以至于破壞。如此，在進(jìn)行臨床輸血血型配合試驗(yàn)中就會(huì)出現(xiàn)假陰性或假陽(yáng)性的結(jié)果，并由此會(huì)造成臨床病人出現(xiàn)輸血反應(yīng)。隨著臨床輸血工作的不斷發(fā)展，如何更加準(zhǔn)確的進(jìn)行血型定型檢測(cè)就成為臨床的必需。臨床進(jìn)行血型檢測(cè)主要采用玻片法，試管法及微孔法，其本質(zhì)都為凝集技術(shù)。進(jìn)行正定型檢測(cè)是用血型單克隆抗體試劑檢測(cè)紅細(xì)胞上抗原，反定型檢測(cè)是用紅細(xì)胞試劑檢測(cè)血清中抗體。目前應(yīng)用的檢測(cè)紅細(xì)胞多為輸血單位自行配制，他們多采用保存液保存紅細(xì)胞。紅細(xì)胞保護(hù)液的成份及理化性質(zhì)的差異，會(huì)造成反定型用紅細(xì)胞試劑的質(zhì)量不穩(wěn)定，導(dǎo)致血清抗體檢測(cè)結(jié)果不準(zhǔn)確，甚至造成血型錯(cuò)判，嚴(yán)重影響臨床輸血安全，更影響反定型檢測(cè)方法的推廣。臨床進(jìn)行不規(guī)則抗體篩檢及鑒定主要采用試管抗人球蛋白技術(shù)及微珠凝膠抗人球蛋白技術(shù)。不規(guī)則抗體指不符合ABO血型系統(tǒng)Landsteiner法則的血型抗體，即抗A抗B以外的血型抗體，一般因?yàn)檩斞⑷焉锏劝l(fā)生同種免疫而產(chǎn)生，多屬于IgG類抗體。它是一種7S球蛋白，分子量小，分子長(zhǎng)度只250A與紅細(xì)胞相應(yīng)抗原結(jié)合后，在鹽水介質(zhì)中只能與紅細(xì)胞結(jié)合而不出現(xiàn)肉眼可見(jiàn)的凝集反應(yīng)，必須通過(guò)特殊的方法才能使致敏細(xì)胞發(fā)生凝集反應(yīng)，從而檢出此類抗體。如果受血者體內(nèi)存在有臨床意義的抗體，就會(huì)破壞輸入的含有相應(yīng)抗原的紅細(xì)胞，發(fā)生溶血性輸血反應(yīng)，影響紅細(xì)胞輸注的療效，重者危及患者生命。孕婦體內(nèi)如含有不規(guī)則抗體，則會(huì)引起新生兒溶血病，產(chǎn)生核黃疸等其他嚴(yán)重影響新生兒發(fā)育的綜合癥，給家庭和社會(huì)帶來(lái)沉重的負(fù)擔(dān)，甚至引起新生兒死亡。因此，開(kāi)展不規(guī)則抗體篩查是十分必要的。歐美等許多發(fā)達(dá)國(guó)家已將不規(guī)則抗體篩查作為常規(guī)檢測(cè)，在我國(guó)，衛(wèi)生行政部門還沒(méi)有相關(guān)的要求。臨床上，醫(yī)院及血站僅是對(duì)少數(shù)患者進(jìn)行抗體篩檢。對(duì)獻(xiàn)血者的抗體篩檢更是空白，存在極大的安全隱患。目前臨床進(jìn)行不規(guī)則抗體篩檢所使用的檢測(cè)細(xì)胞為紅細(xì)胞保存液保存的篩檢細(xì)胞，篩檢細(xì)胞是從O型獻(xiàn)血員中篩選抗原譜而得到，其獲得不易，保存期短，臨床并不常用，故往往l套試劑進(jìn)行少量標(biāo)本檢測(cè)后就會(huì)發(fā)生溶血，不能繼續(xù)使用，極大的浪費(fèi)。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的是用紅細(xì)胞膜抗原磁珠制作試劑盒并在血型抗體檢測(cè)方面的應(yīng)用。本發(fā)明試劑盒包括a、具有紅細(xì)胞血型抗原性的紅細(xì)胞膜抗原磁珠；b、96孔U型反應(yīng)板；c、紅細(xì)胞膜抗原磁珠稀釋液。本發(fā)明所述的紅細(xì)胞抗原磁珠稀釋液的制備配制低離子液取NaCl、甘氨酸于燒杯中，加入雙蒸餾水溶解后，加入KH2P04和Na2HP04，充分混勻，最后用NaOH調(diào)節(jié)PH至6.7;用低離子液配制濃度為1%的牛血清白蛋白液，即為紅細(xì)胞膜抗原磁珠稀釋液。本發(fā)明的試劑盒在血型抗體檢測(cè)方面的應(yīng)用。本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)是紅細(xì)胞膜抗原磁珠保存期長(zhǎng)，有利于對(duì)紅細(xì)胞稀有抗原的保存。應(yīng)用紅細(xì)胞膜抗原磁珠檢測(cè)不完全抗體時(shí)，洗滌過(guò)程不需離心；進(jìn)行ABO系統(tǒng)血型凡定型檢測(cè)時(shí)，檢測(cè)方法簡(jiǎn)便、易行；可同時(shí)對(duì)大量樣本進(jìn)行檢測(cè)，易于自動(dòng)化。具體實(shí)施例方式本發(fā)明的試劑盒包括a、具有紅細(xì)胞血型抗原性的紅細(xì)胞膜抗原磁珠；b、96孔U型反應(yīng)板；c、紅細(xì)胞膜抗原磁珠稀釋液。紅細(xì)胞膜抗原磁珠的制備1、紅細(xì)胞抗原的制備(1)取新鮮血細(xì)胞，離心去上清，取壓積血細(xì)胞進(jìn)入下一步處理；(2)在壓積血細(xì)胞中加入SDS，然后置于室溫；(3)離心去上清，留沉淀物并向沉淀物中加入蒸餾水；2、磁性粒子的制備(1)將FeCl2和FeCl:,加入到蒸餾水中進(jìn)行溶解；(2)在劇烈攪拌的條件下，將氫氧化鈉加入到上述金屬鹽溶液中，使其水解為金屬?gòu)?fù)合氧化物，從而得到四氧化三鐵顆粒溶液；3、細(xì)胞膜抗原包被磁性粒子將步驟2.1獲得的紅細(xì)胞膜抗原加入步驟2.2獲得的四氧化三鐵顆粒溶液中，再加入聚乙二醇，進(jìn)行孵育，離心后棄上清，留沉淀，再在沉淀中加入低滲磷酸鹽緩沖液洗滌，即得細(xì)胞膜抗原包被的磁性粒子。96孔U型反應(yīng)板制備用pH9.6，0.05M碳酸鹽緩沖液將將純化的血小板單克隆抗體配制成10ug/ml濃度，按100ul/孔加入反應(yīng)孔中，置4。C冰箱中包被過(guò)夜，次日取出，用含有0.05%吐溫的pH7.2，0.01M磷酸鹽緩沖液洗滌5次，拍干，置-2(TC保存?zhèn)溆?。本發(fā)明所述的紅細(xì)胞抗原磁珠稀釋液的制備配制低離子液取NaC10.875g，甘氨酸9g于500ml燒杯中，加入400ml雙蒸熘水溶解后，加入5.65ml0.15MKH2PO4和4.35ml0.15MNa2HP04，充分混勻后定容至500ml，最后用NaOH調(diào)節(jié)PH至6.7。用低離子液配制濃度為1%的牛血清白蛋白液，即為紅細(xì)胞膜抗原磁珠稀釋液。本發(fā)明的試劑盒在血型抗體檢測(cè)方面的應(yīng)用。實(shí)施例lABO系統(tǒng)血型反定型檢測(cè)用已知的A型紅細(xì)胞、B型紅細(xì)胞如具體實(shí)施方式制備A紅細(xì)胞膜抗原磁珠、B紅細(xì)胞膜抗原磁珠。由于紅細(xì)胞膜抗原磁珠上包被有A抗原及B抗原，故可代替新鮮紅細(xì)胞用于ABO系統(tǒng)血型反定型檢測(cè)。A型人血清巾含有抗B抗體，B型人血清中含有抗A抗體，AB型人血清中不含有抗體，O型人血清中含有抗AB抗體。AB0血型系統(tǒng)抗體多為自然發(fā)生的抗體，為IgM類抗體，紅細(xì)胞膜抗原磁珠能夠與血清中的相應(yīng)IgM抗體發(fā)生特異性免疫反應(yīng)，形成肉眼可見(jiàn)的凝集。依據(jù)反應(yīng)后的格局判定血型。ABO血型表現(xiàn)性反應(yīng)格局表<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>反應(yīng)程序向標(biāo)記好的反應(yīng)板屮分別加入待檢血清25ul，然后加入紅細(xì)胞膜抗原磁珠50ul，混勻，置程控磁化振蕩器上，按設(shè)定好的程序反應(yīng)，反應(yīng)結(jié)束后，取出反應(yīng)板，對(duì)照反應(yīng)格局判度結(jié)果。實(shí)施例2紅細(xì)胞不規(guī)則抗體的篩檢用已知特異性的抗體檢測(cè)紅細(xì)胞，確定篩檢細(xì)胞的抗原譜如下<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>將上述篩檢細(xì)胞如具體實(shí)施方式制備篩檢細(xì)胞膜磁珠，篩檢細(xì)胞膜抗原磁珠表面具有新鮮篩檢細(xì)胞上全部抗原，可用于臨床進(jìn)行IgG抗體的篩檢。IgG抗體一般因?yàn)檩斞⑷焉锏劝l(fā)生同種免疫而產(chǎn)生。它是一種7S球蛋白，分子量小，分子長(zhǎng)度只250A與紅細(xì)胞相應(yīng)抗原結(jié)合后，在鹽水介質(zhì)中只能與紅細(xì)胞結(jié)合而不出現(xiàn)肉眼可見(jiàn)的凝集反應(yīng)，必須通過(guò)加入抗人球蛋白試劑后才能使致敏細(xì)胞發(fā)生凝集反應(yīng)，從而檢出此類抗體。反應(yīng)程序向標(biāo)記好的反應(yīng)板中分別加入待檢血清50ul，然后加入篩檢紅細(xì)胞膜抗原磁珠50ul，混勻，置37。C水浴箱中孵育30分鐘，置程控磁化振蕩器上，用洗液洗滌3次，200ul/次，最后一次徹底去上清，每孔加入50ul抗人球蛋白試劑，混勻，按設(shè)定好的程序反應(yīng)，反應(yīng)結(jié)束后，取出反應(yīng)板，觀察結(jié)果。若為陽(yáng)性反應(yīng)則表明待檢者血清中含與篩檢細(xì)胞抗原相對(duì)應(yīng)的抗體。若為陰性反應(yīng)則表明待檢者血清中不含有與篩檢細(xì)胞抗原相對(duì)應(yīng)的抗體。實(shí)施例3紅細(xì)胞不規(guī)則抗體的鑒定用已知特異性抗體檢測(cè)10人份或10人份以上o型紅細(xì)胞，確定其抗原譜，將其作為紅細(xì)胞譜細(xì)胞。作為譜細(xì)胞的紅細(xì)胞要求，應(yīng)用其能夠鑒定出臨床最常見(jiàn)的有臨床意義的同種異型抗體。將紅細(xì)胞譜細(xì)胞如具體實(shí)施方式制備成譜細(xì)胞膜磁珠，譜細(xì)胞膜抗原磁珠表面具有新鮮紅細(xì)胞譜細(xì)胞上全部抗原，可用于臨床進(jìn)行IgG抗體的鑒定。反應(yīng)程序向標(biāo)記好的反應(yīng)板中分別加入待檢血清50ul，然后加入譜紅細(xì)胞膜抗原磁珠50ul，混勻，置37"C水浴箱中孵育30分鐘，置程控磁化振蕩器上，用洗液洗滌3次，200ul/次，最后一次徹底去上清，每孔加入50ul抗人球蛋白試劑，混勻，按設(shè)定好的程序反應(yīng)，反應(yīng)結(jié)束后，取出反應(yīng)板，通過(guò)與紅細(xì)胞譜細(xì)胞格局觀察結(jié)果。權(quán)利要求1、一種紅細(xì)胞膜抗原磁珠試劑盒，其特征是a、具有紅細(xì)胞血型抗原性的紅細(xì)胞膜抗原磁珠；b、96孔U型反應(yīng)板；c、紅細(xì)胞膜抗原磁珠稀釋液。2、根據(jù)權(quán)利要求1所述的紅細(xì)胞膜抗原磁珠試劑盒，其特征在于所述的紅細(xì)胞抗原磁珠稀釋液的制備配制低離子液取NaCl、甘氨酸于燒杯中，加入雙蒸餾水溶解后，加入KH2P04和Na2HP04，充分混勻，最后用NaOH調(diào)節(jié)PH至6.7;用低離子液配制濃度為1%的牛血清白蛋白液，即為紅細(xì)胞膜抗原磁珠稀釋液。3、權(quán)利要求1所述的試劑盒在血型抗體檢測(cè)方面的應(yīng)用。全文摘要一種紅細(xì)胞膜抗原磁珠試劑盒及在血型抗體檢測(cè)方面的應(yīng)用，屬于生物
技術(shù)領(lǐng)域：
。本發(fā)明的目的是用紅細(xì)胞膜抗原磁珠制作試劑盒并在血型抗體檢測(cè)方面的應(yīng)用。本發(fā)明試劑盒包括紅細(xì)胞膜抗原磁珠、96孔U型反應(yīng)板、紅細(xì)胞膜抗原磁珠稀釋液。本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)是紅細(xì)胞膜抗原磁珠保存期長(zhǎng)，有利于對(duì)紅細(xì)胞稀有抗原的保存。文檔編號(hào)G01N33/80GK101387648SQ200810051319公開(kāi)日2009年3月18日申請(qǐng)日期2008年10月24日優(yōu)先權(quán)日2008年10月24日發(fā)明者墅周,孔維臣,孫玉昌,宇張,景維東,東李,勇李,楊文沖,段生寶,軍童,馬學(xué)嚴(yán)申請(qǐng)人:勇李