專利名稱：人類全血中病毒基因組dna提取試劑盒及方法
技術領域：
該發(fā)明涉及一種從人類全血中提取病毒基因組DNA的試劑盒及利用該試劑盒從人類全血中提取病毒基因組DNA的方法。
背景技術：
病毒是一類個體微小，結構簡單，只含單一核酸，必須在活細胞內寄生并以復制方式增殖的非細胞型微生物。病毒在自然界分布廣泛，可感染人體細胞，在細胞內解體釋放出核酸分子，借細胞內環(huán)境的條件以獨特的生命活動體系進行復制，常引起人體發(fā)病。目前知道的DNA病毒有乙肝病毒，T2噬菌體，天花病毒，花椰菜花葉病毒等，本發(fā)明適用于所有的感染人類的血液中的病毒基因組DNA的提取，在已知的DNA病毒中，因為乙肝病毒對人類的影響和危害最大，傳染性最強，因此本發(fā)明尤其適用于乙肝病毒基因組DNA 的提取。目前臨床對于病毒的檢測方法主要有兩種I.血清學檢查(ELISA檢測)主要檢查患者血清特異性抗原抗體物質。如乙肝病毒檢測，主要檢測血液中HbsAg、HbsAb、HbeAg、HbeAb、HbeAb,這就是人們常說的“乙肝兩對半”檢查，反映機體HBV感染的免疫狀態(tài)。ELISA檢測，無法判定病毒感染的數量和復制狀態(tài)，檢測靈敏度相對較低，時有有漏檢發(fā)生。2. DNA檢查DNA檢測則是采用聚合酶鏈反應(PCR)技術，采用特異性引物，特異性擴增已知病毒基因組結構上的特異性片段的一種高效靈敏的方法。因該方法具有ELISA檢測所無法達到的高通量、快速和高靈敏性，因此具有廣闊的發(fā)展前景。以乙肝病毒DNA檢測為例，利用乙肝病毒基因組保守的C基因區(qū)上270bp基因片段，用PCR技術，可在數小時內可將極微量的HBV-DNA特定的分子片斷擴增至1x107 1x108倍，大大提高了 HBV的檢出率，聚合酶鏈反應(PCR)可直接檢測病毒核酸，是目前檢測HBV最敏感的技術。目前DNA檢查已有逐步取代血清學檢查(ELISA檢測)的趨勢，尤其是乙肝病毒的檢測，乙肝病毒DNA檢測已經成為臨床乙肝病毒診斷的主要方法之一。要進行病毒DNA檢查，首先第一步也是最關鍵的一步便是要提取人體血液中病毒基因組DNA。目前，提取乙肝病毒DNA的方法很多，有煮沸法、沉淀法、吸附法等，但這些方法有一個共同缺點首先必須對血液進行血漿和血清分離，用分離后的血清作為提取病毒DNA的標本，這將造成以下幾個問題1)步驟繁瑣，增加工作量；2)操作過程中易二次污染，造成假陽性結果；3)在分離時易造成病毒DNA的損失，對于微量病毒DNA檢測有影響，甚至檢測不到，形成假陰性結果。因此，不用進行血清和血漿分離，研發(fā)一種直接從人體全血中提取病毒DNA的試劑盒和方法意義重大。

發(fā)明內容
本發(fā)明的目的是提供一種從人類全血中快速、高效地提取病毒基因組DNA的試劑盒及其從人類全血中提取病毒基因組DNA的方法，用以解決在從血清中提取病毒DNA時引起的二次污染、DNA損失和步驟過多等缺陷。I.本發(fā)明所提供的人類全血中病毒基因組DNA提取試劑盒，包括以下試劑I)紅細胞裂解液含有碳酸氫鉀10mmol/L-12mmol/L,氯化銨135mmol/L~160mmol/L, PH 值為 8. O 的乙二胺四乙酸溶液(EDTA)O. Immol /T-Immol /I,；2)白細胞裂解液含有PH值為8. O的三羥甲基氨基甲烷溶液(Tris-HCl) 5-20mmol/L, PH 值為 8.0 的乙二胺四乙酸溶液(EDTA) 50-150mmol/L，十二烷基硫酸(SDS)O. 5-2% ；3)消化液含十二烷基硫酸(SDS) 1-5% ；4)純化液含飽和氯化鈉溶液6mol/L ;或含飽和醋酸鈉溶液5. 0-6. OmoI/L ；
5) DNA保存液為經過滅菌處理的PH值為8. 0-8. 5的Tris-HCl溶液，或PH值在7. 0-8. 5范圍內滅菌ddH20。
本發(fā)明優(yōu)選的試劑盒配方如下I)紅細胞裂解液含有碳酸氫鉀12mmol/L，氯化銨155mmol/L，PH值為8. O乙二胺四乙酸(EDTA)O. 15mmol/L ；2)白細胞裂解液含有PH值為8. O的三羥甲基氨基甲烷(Tri s-HCl) 15mmol/L,PH值為8. O乙二胺四乙酸(EDTA) 100mmol/L，十二烷基硫酸(SDS) 1.0% ；3)消化液含十二烷基硫酸(SDS) 1.5% ；4)純化液含飽和氯化鈉溶液6mol/L ;或含飽和醋酸鈉溶液6mol/L ；5) DNA保存液為經過滅菌處理的PH值為8. 5的Tris-HCl溶液，或PH值為8. O的滅菌ddH20.2.本發(fā)明所提供的從人類全血中提取病毒基因組DNA的方法包括以下步驟I)取O. I-Iml全血放入到2ml的離心管中，加入O. I-Iml紅細胞裂解液，上下翻轉，使沉淀物分散，8000-12000rpm離心l_2min。倒掉上層液，可見離心管底部有血色沉淀。2)離心管中加入O. I-Iml白細胞裂解液，上下翻轉，務必使沉淀物分散，旋轉，8000-12000rpm離心l_2min.盡量倒盡掉上清液，使離心管底部的沉淀不再殘留有白細胞裂解液。3)吸取蛋白酶K(10mg/ml)5-10ul加入到上面的離心管中，用槍頭反復吹打，使蛋白酶K與沉淀物均勻接觸后，加入60-300ul消化液，上下翻轉離心管，務必使沉淀物分散于消化液中。55-65°C水浴10-30分鐘。其間，取出離心管數次用力晃動幾下幫助內溶物溶解，
消化液變澄清。4)取出離心管，加入20-100ul純化液，上下翻轉離心管使溶液混勻，12000-14000rpm離心2_5min，把上清液吸出放入到裝有200_900ul無水乙醇的I. 5ml離心管中，輕輕上下翻轉10-20次，可見絮狀DNA析出。(如果血液量少小，DNA析出量微量，可能看不見絮狀DNA析出屬于正常現象)。I)把含DNA的無水乙醇溶液倒入純化柱中，8000-12000rpm離心l_3min，棄去濾
液，把純化柱放回收集管上。2)吸取40-100ul 70%乙醇于純化柱內，8000_12000rpm離心l_3min，棄去濾液，把純化柱放回收集管上，再離心2min.使吸附在濾膜上的DNA不再附有乙醇。3)將純化柱放入到一個干凈的I. 5ml離心管中。吸取30_50ul已溫熱到58_65°C的保存液，輕輕放入到濾膜的表面，純化柱在水浴58-65°C保溫10分鐘，12000-14000rpm離心2min，即可得到高純度病毒基因組DNA。將所述提取液置于_20°C環(huán)境中保存?zhèn)溆?。本發(fā)明思路為病毒入侵人體后，在細胞中進行復制并釋放到血液中，進入血液中的病毒，有的吸附在紅細胞的表面，有的侵入白細胞，大部分則存在于血漿中。傳統(tǒng)方法中，提取血液中的病毒DNA要先分離出血漿，再從血漿中分離出血清，從分離出來的血清中再用各種方法提取其中的病毒DNA。本發(fā)明設計的方法則利用人體血液基因組DNA含量高片段大網狀結構的特點，可以與病毒DNA互相纏繞在一起而被提取出來，而無需添加任何吸附增強劑(如糖原等)，尤其適用于及微量的病毒DNA提取。分離出病毒DNA可以直接進行PCR擴增檢測。本試劑盒原理為紅細胞裂解液可以起到快速裂解紅細胞的作用，使紅細胞膨脹破裂，釋放吸附在其表面的病毒，同時影響清除DNA提取的血紅蛋白。白細胞裂解液可以破壞白細胞和病毒結構，使血液DNA和病毒DNA同時釋放，并相互纏繞在一起而被沉淀下來。消化液中含十二烷基硫酸(SDS)，和蛋白酶K聯合作用，可以分解與DNA結合在一起的核蛋白，使DNA被游離釋放在消化液中。純化液的主要作用是利用鹽析原理清除溶液中的蛋 白質，無水乙醇可以使分散游離的DNA結合在一起，并有效增強DNA和吸附柱的吸附作用，70%乙醇沖洗則可以很好的清除吸附柱中多余的鹽分。DNA保存液提供了一種弱堿性環(huán)境，可以高效快速的將吸附膜上的DNA洗脫下來。需要特別說明的是通過該方法得到的不是單一的病毒DNA，而是病毒DNA和血液DNA相互纏繞著被一起提取出來，而這正是該方法的優(yōu)勢所在。技術優(yōu)勢與其它方法相比，本發(fā)明的技術優(yōu)勢主要表現在I.簡化了操作步驟，提高了工作效率，所有提取工作在45分鐘左右即可完成，而其他方法則需要2小時以上。2.不用對血液進行預處理，直接使用患者全血進行病毒DNA提取，因此減少二次污染機會，在臨床檢測中提高了檢測的準確度，使結果更加真實可信。3.如果血液中病毒含量很低時，傳統(tǒng)方法則采用培養(yǎng)和濃縮的方法，或添加吸附增強劑(如糖原等)，本發(fā)明利用了血液基因組DNA和病毒基因組DNA相互纏繞的特性，極微量的病毒DNA也可被吸附纏繞而被提取出來，大大提高了檢測的靈敏度，尤其適用于極微量的病毒DNA檢測。4.本發(fā)明使用的試劑中不含苯、氯仿等有毒物質，對人體無危害。5.本發(fā)明所提取出來的DNA純度高片段大，可以直接進行PCR擴增檢測。
具體實施例方式下列實施例是進一步對本發(fā)明的說明，不應當當做對本發(fā)明的限制。以血液中乙肝病毒DNA的提取為例說明如下按以下配方制作人類全血病毒DNA提取試劑盒I.紅細胞裂解液含有碳酸氫鉀10mmol/L，氯化銨150mmol/L，PH值為8. O乙二胺四乙酸(EDTA)O. lmmol/L ；2.白細胞裂解液含有PH值為8. O的三羥甲基氨基甲(Tris-HCl) 20mmol/L，PH值為8. O乙二胺四乙酸(EDTA) 50mmol/L，十二烷基硫酸(SDS) 1.0% ；
3.消化液含十二烷基硫酸(SDS) 2. 0% ；4.純化液含飽和氯化鈉溶液6mol/L ；5. DNA保存液為經過滅菌處理的PH值為8. 5的Tris-HCl溶液；6.吸附柱玻璃纖維膜吸附柱；7.預配液無水乙醇、70%乙醇和蛋白酶K(10mg/ml)。按以下程序進行操作提取血液中的乙肝病毒DNA I.取Iml全血放入到2ml的離心管中，加入Iml紅細胞裂解液，上下翻轉，使沉淀物分散，8000rpm離心2min。倒掉上層液，可見離心管底部有血色沉淀。
2.在離心管中加入Iml白細胞裂解液。上下翻轉，務必使沉淀物分散，旋轉，8000rpm離心2min.盡量倒盡掉上清液，使離心管底部的沉淀不再殘留有白細胞裂解液。3.吸取蛋白酶K IOul加入到上面的離心管中，用槍頭反復吹打，使蛋白酶K與沉淀物均勻接觸后，加入300ul消化液，上下翻轉離心管，務必使沉淀物分散于消化液中。58°C水浴10分鐘。其間，取出離心管數次用力晃動幾下幫助內溶物溶解，消化液變澄清。4.取出離心管，加入IOOul純化液，上下翻轉離心管使溶液混勻，13000rpm離心3min，把上清液吸出放入到裝有900ul無水乙醇的I. 5ml離心管中，輕輕上下翻轉20次，可見絮狀DNA析出。(如果血液量少小，DNA析出量微量，可能看不見絮狀DNA析出屬于正?，F象)。5.把上面有絮狀DNA的無水乙醇溶液倒入純化柱中，8000rpm離心2min. DNA便附
著在濾漠上，棄濾液，把純化柱放回收集管上。6.吸取IOOul 70%乙醇于純化柱內，8000rpm離心2min，棄去濾液。把純化柱放回收集管上，13000rpm再離心2min.使吸附在濾膜上的DNA不再附有乙醇。7.把純化柱放入到一個干凈的I. 5ml離心管中。吸取50ul已溫熱到58°C的保存液，輕輕放入到濾膜的表面，純化柱在水浴58°C保溫10分鐘，13000rpm離心2min，保存液中即含有所提取的乙肝病毒DNA。-20°C低溫保存。
權利要求
1.一種人類全血中病毒基因組DNA提取試劑盒，其特征在于包括以下試劑 紅細胞裂解液、白細胞裂解液、消化液、純化液、DNA保存液。
2.根據權利要求I所述一種人類全血中病毒基因組DNA提取試劑盒，其特征在于各試劑分別為 1)紅細胞裂解液含有碳酸氫鉀12mmol/L，氯化銨155mmol/L，PH值為8.O乙二胺四乙酸(EDTA)O. 15mmol/L ； 2)白細胞裂解液含有PH值為8.0的三羥甲基氨基甲烷(Tris-HCl)15mmol/L，PH值為8. 0乙二胺四乙酸(EDTA) 100mmol/L，十二烷基硫酸(SDS) 1.0% ； 3)消化液含十二烷基硫酸(SDS)1.5% ； 4)純化液含飽和氯化鈉溶液6mol/L;或含飽和醋酸鈉溶液6mol/L ； 5)DNA保存液為經過滅菌處理的PH值為8. 5的Tri s-HCl溶液，或PH值為8. 0的滅菌 ddH20。
3.根據權利要求I和2所述的試劑盒提取人類外周血液中病毒基因組DNA的方法，其特征在于包括以下步驟 1)取0.I-Iml全血放入到2ml的離心管中，加入0. I-Iml紅細胞裂解液，上下翻轉，使沉淀物分散，8000-1200()rpm離心l_2min。倒掉上層液，可見離心管底部有血色沉淀。
2)離心管中加入0.I-Iml白細胞裂解液，上下翻轉，務必使沉淀物分散，旋轉，8000-12000rpm離心l_2min.盡量倒盡掉上清液，使離心管底部的沉淀不再殘留有白細胞裂解液。
3)吸取蛋白酶K(10mg/ml)5-10ul加入到上面的離心管中，用槍頭反復吹打，使蛋白酶K與沉淀物均勻接觸后，加入60-300ul消化液，上下翻轉離心管，務必使沉淀物分散于消化液中。55-65°C水浴10-30分鐘。其間，取出離心管數次用力晃動幾下幫助內溶物溶解，消化液變澄清。
4)取出離心管，加入20-100ul純化液，上下翻轉離心管使溶液混勻，12000-14000rpm離心2-5min，把上清液吸出放入到裝有200_900ul無水乙醇的I. 5ml離心管中，輕輕上下翻轉10-20次，可見絮狀DNA析出。(如果血液量少小，DNA析出量微量，可能看不見絮狀DNA析出屬于正?，F象)。
5)把含DNA的無水乙醇溶液倒入純化柱中，8000-12000rpm離心l_3min,棄去濾液,把純化柱放回收集管上。
6)吸取40-100ul70%乙醇于純化柱內，8000-12000rpm離心l_3min，棄去濾液，把純化柱放回收集管上，再離心2min.使吸附在濾膜上的DNA不再附有乙醇。
7)將純化柱放入到一個干凈的I.5ml離心管中。吸取30-50ul已溫熱到58_65°C的保存液，輕輕放入到濾膜的表面，純化柱在水浴58-65°C保溫10分鐘，12000-14000rpm離心2min,即可得到高純度病毒基因組DNA。于_20°C保存?zhèn)溆谩?br> 全文摘要
本發(fā)明涉及一種人類全血中病毒基因組DNA提取試劑盒及其方法。該發(fā)明的特征在于試劑盒包括紅細胞裂解液、白細胞裂解液、消化液、純化液及DNA保存液。本發(fā)明采用兩種裂解液分別處理含有病毒細胞的血液樣品，在裂解血液細胞的同時，可以高效徹底地裂解其中的各種病毒細胞，使病毒DNA釋放出來，與血液基因組DNA相互纏繞在一起而被提取出來.用該試劑盒提取病毒DNA時，不用事先對血液進行血漿和血清分離，只需取新鮮或冰凍的0.1至1ml抗凝全血即可提取高純度微量病毒的DNA，并可以完全解鏈和高效地被擴增.本發(fā)明適用于所有科研單位和從事分子遺傳學研究的實驗室及開展臨床基因診斷技術的醫(yī)療單位、血站以及疾病控制中心使用。
文檔編號C12N15/10GK102676498SQ20111006420
公開日2012年9月19日 申請日期2011年3月15日 優(yōu)先權日2011年3月15日
發(fā)明者張瓊, 繆林 申請人:張瓊, 繆林