一種檢測人抗釀酒酵母IgA類抗體的酶聯(lián)免疫試劑盒的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明提供一種定性檢測人抗釀酒酵母IgA類抗體的酶聯(lián)免疫試劑盒。該酶聯(lián)免疫試劑盒包括：包被釀酒酵母細胞壁甘露聚糖抗原的酶標板、酶標抗體、底物顯色液、濃縮洗滌劑、終止液、樣品稀釋液和陰陽性對照品。本發(fā)明還公開了一種應用上述酶聯(lián)免疫試劑盒檢測人抗釀酒酵母IgA類抗體的方法，它包括以下步驟：首先進行樣品前處理，然后用試劑盒進行檢測，最后分析檢測結(jié)果。本發(fā)明提供的檢測人抗釀酒酵母IgA類抗體的酶聯(lián)免疫試劑盒及檢測方法操作簡便、費用低廉、靈敏度高、能夠現(xiàn)場監(jiān)控且適合大量樣本篩查。
【專利說明】—種檢測人抗釀酒酵母IgA類抗體的酶聯(lián)免疫試劑盒
[0001]專利申請?zhí)?
技術領域
[0002]本發(fā)明涉及免疫學檢測領域，具體地說，涉及一種定性檢測人血清中抗釀酒酵母IgA類抗體的酶聯(lián)免疫試劑盒及其檢測方法。
【背景技術】
[0003]克羅恩病(又稱局限回腸炎、局限性腸炎、節(jié)段性腸炎和肉芽腫性腸炎)是一種自身免疫性腸粘膜疾病，它在慢性炎癥性腸病中有很高的復發(fā)率?？肆_恩病病變呈節(jié)段性分布，可累及口腔到肛門的各段消化道，多位于結(jié)腸和回腸，是一種全壁性炎癥?？肆_恩病的主要臨床表現(xiàn)包括疲勞、右下腹不明原因的疼痛、腹瀉(大多數(shù)伴有貧血)，同時可能伴有不明原因的發(fā)熱、惡心和嘔吐?？肆_恩病的發(fā)病過程呈現(xiàn)漸進式的特點。大約一半的克羅恩病患者中會出現(xiàn)腸外繼發(fā)的表現(xiàn)。這些腸外癥狀主要包括關節(jié)痛、關節(jié)炎、皮膚病、眼部發(fā)炎等，并且這些癥狀多數(shù)會隨著慢性炎癥性腸病的治療而消失。此外，克羅恩病的并發(fā)癥還包括機械性腸梗阻(約20?30%的患者會有此癥狀)，皮膚、腸、膀胱、陰道、肛門、直腸瘺，內(nèi)部及腹膜后膿腫，腸出血，中毒性巨結(jié)腸，小腸癌，骨質(zhì)疏松和膽結(jié)石等多種癥狀。在歐美國家人群中，克羅恩病的發(fā)病率為每10萬人中有150個人。每年新增的病例大約為每10萬人中有7-8人，且在過去20年中呈現(xiàn)出持續(xù)的增長?？肆_恩病在不同性別的人群中的發(fā)病率相當。其發(fā)病年齡主要集中在16-35歲和60歲以上的成年人，且在同一家庭的不同成員中的發(fā)病率呈上升趨勢，顯現(xiàn)了一定的遺傳相關性。目前，對于克羅恩病的治療主要包括了藥物治療(如糖皮質(zhì)激素類，TNF阻斷劑)，手術干預(如切除受累腸部位)，飲食及心理治療等方法。
[0004]抗釀酒酵母抗體是克羅恩病的一個血清學診斷的指標。1988年，Main等在慢性炎癥性腸病患者的血清中檢測到抗釀酒酵母抗體，他們認為更多的抗體與釀酒酵母的結(jié)合和克羅恩病中多種感染因素提示了次級免疫反應的失效，這種反應是胰腺分泌物介導的一種免疫系統(tǒng)的特異性反應?？贯劸平湍缚贵w可通過酶聯(lián)免疫法檢測?？贯劸平湍缚贵w與克羅恩病的疾病表型和嚴重性密切相關。在克羅恩病患者中，抗釀酒酵母抗體IgA和IgG類抗體陽性率為73%。因此，可以通過檢測抗釀酒酵母抗體來實現(xiàn)對克羅恩病的診斷。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明的目的之一是提供一種設計簡單，可簡化操作、提高分析靈敏度、成本低廉的人抗釀酒酵母IgA類抗體的定性酶聯(lián)免疫檢測方法。
[0006]本發(fā)明的另一目的在于提供一種定性檢測人抗釀酒酵母IgA類抗體的酶聯(lián)免疫試劑盒。
[0007]本發(fā)明試劑盒的檢測原理如下:
[0008]用釀酒酵母細胞壁甘露聚糖包被微孔板，制成固相載體，往包被抗原的微孔中分別加入樣本，孵育后洗滌，加入辣根過氧化物酶標記的酶標抗體，室溫孵育，經(jīng)過徹底洗滌后用底物四甲基聯(lián)苯胺(TMB)顯色。四甲基聯(lián)苯胺(TMB)在過氧化物酶的催化下轉(zhuǎn)化成藍色，并在終止液的作用下轉(zhuǎn)化成最終的黃色。顏色的深淺和樣品中的人抗釀酒酵母IgA類抗體呈正相關。用酶標儀在450nm波長下測定吸光度，與臨界值相比較，從而判定樣本中人抗釀酒酵母IgA類抗體的存在與否。
[0009]本發(fā)明的技術方案:本檢測試劑盒由1.酶標抗體溶液試劑瓶、2.底物顯色液試劑瓶、3.終止液試劑瓶、4.濃縮洗滌液試劑瓶、5.樣品稀釋液試劑瓶、6.陽性對照品試劑管、
7.陰性對照品試劑管、8.酶標板、9.盒體所組成。試劑瓶1-7和酶標板均放置在盒體內(nèi)。
[0010]酶標板是包被釀酒酵母細胞壁甘露聚糖抗原的96孔聚苯乙烯微量反應板。
[0011]本發(fā)明試劑盒中所涉及試劑的配制方法為:
[0012]a.酶標抗體溶液的配制:辣根過氧化物酶-羊抗人IgA抗體原液購自美國Life technologies公司(貨號:A18787)，用辣根過氧化物酶穩(wěn)定劑(購自美國Thermoscientific公司，貨號:37552)按I: 10000的比例配制成工作濃度灌裝入試劑瓶中；
[0013]b.底物顯色液的配制:單組份四甲基聯(lián)苯胺(TMB)底物顯色液購自湖州英創(chuàng)生物科技有限公司(貨號:TMB-S-004)，灌裝入試劑瓶中。
[0014]c.終止液的配制:2mol/L H2SO4溶液，灌裝入試劑瓶中。
[0015]d.濃縮洗滌液的配制(20XPBST):2.7M NaCl，94mM KCl,0.2M Na2HPO4,40mMNaH2PO4,1 % Tween-20,調(diào)pH值為7.4。灌裝入試劑瓶中。
[0016]e.樣品稀釋液的配制:含1% BSA、0.01%硫柳汞、pH7.4的PBS溶液(135mM NaCl,
4.7mM KCl，1mM Na2HPO4, 2mM NaH2PO4)，灌裝入試劑瓶中。
[0017]f.陽性對照品的配制:用辣根過氧化物酶穩(wěn)定劑按1: 200稀釋陽性血清，灌裝入試劑管中；
[0018]g.陰性對照品的配制:用辣根過氧化物酶穩(wěn)定劑按1: 200稀釋陰性血清，灌裝入試劑管中；
[0019]釀酒酵母細胞壁甘露聚糖包被的酶標板制備方法:釀酒酵母細胞壁甘露聚糖購自德國Sigma公司(貨號:M7504)，聚苯乙烯微量反應酶標板購自美國Corning公司(貨號:42592)。將釀酒酵母細胞壁甘露聚糖溶解于含0.01%硫柳汞的碳酸鹽緩沖液(15mM Na2CO3,34.9mM NaHCO3，調(diào)pH 9.6)中，終濃度為10ug/ml。取配制包被抗原溶液100 μ L，加入反應板孔中，4°C冰箱中放置12-16h，倒出孔內(nèi)液體，用洗滌液(含0.05 % Tween-20的PBS溶液，pH7.4)洗滌3次，將酶標板倒置在吸水紙上拍打，吸干，在已包被抗原的酶標板小孔中加 100 μ L 的封閉液(含 I % BSA、0.01 %硫柳汞、0.05% Tween-20 的 PBS 溶液，ρΗ7.4)，37°C恒溫培育lh，用洗滌液洗滌3次，將酶標板倒置在吸水紙上拍打，吸干，在室溫下放置Ih自然晾干后封裝。
[0020]本發(fā)明的定性檢測人抗釀酒酵母IgA類抗體的酶聯(lián)免疫試劑盒的檢測方法是將樣品溶液加入酶標板小孔中，同時設置空白、陰性和陽性對照孔，室溫培育30min，倒出孔內(nèi)液體，重復用洗滌液洗滌3次，將酶標板倒置在吸水紙上拍打；加入酶標抗體溶液于酶標板小孔中，室溫培育30min，用洗滌液重復洗3次，吸干；加入顯色溶液到待測酶標板小孔中，室溫恒溫培育15min，再加入終止液，立即顯黃色；用酶標儀在波長450m處測定吸收值。將樣品孔的吸收值減去空白孔的吸收值后，再與參考值進行比較，從而判斷樣品中是否檢測出人抗釀酒酵母IgA類抗體。
[0021]本發(fā)明所制備的酶聯(lián)免疫快速檢測試劑盒，具有簡便、快速、準確的特點，適用于血清樣品中人抗釀酒酵母IgA類抗體的檢測。
【附圖說明】
[0022]圖1為試劑盒檢測原理示意圖。
[0023]圖2為人抗釀酒酵母IgA類抗體的酶聯(lián)免疫試劑盒示意圖。
【具體實施方式】
[0024]實施例1試劑盒中各組分的制備
[0025]1.包被抗原的聚苯乙烯微量反應板:取10 μ g/ml濃度的包被抗原溶液100 μ L，加入到酶標板小孔中，搖勻，置4°C冰箱中放置12-16h。倒出孔內(nèi)液體，用洗滌液洗滌，重復3次，將酶標板倒置在吸水紙上拍打，吸干。在已包被抗原的酶標板小孔中加100 μ L封閉液，室溫培育lh，用洗滌液洗滌3次，將酶標板倒置在吸水紙上拍打，吸干，在室溫下放置Ih自然晾干后封裝。
[0026]2.酶標抗體溶液的配制:用辣根過氧化物酶穩(wěn)定劑按1: 10000的比例配制成工作濃度后，灌裝入試劑瓶中；
[0027]3.底物顯色液的配制:將購買的單組份四甲基聯(lián)苯胺(TMB)底物顯色液直接灌裝入試劑瓶中。
[0028]4.終止液的配制:將98%的濃硫酸(18.4mol/L)加入到超純水中配制成2mol/LH2SO4溶液，灌裝入試劑瓶中。
[0029]5.濃縮洗滌液的配制(20XPBST):按 2.7M NaCl、94mM KC1、0.2M Na2HP04、40mMNaH2PO4,1 % Tween-20, pH值7.4的配方配制濃縮洗滌液，灌裝入試劑瓶中。
[0030]6.樣品稀釋液的配制:配制含I % BSA,0.01 %硫柳汞、pH7.4的PBS溶液(135mMNaCl, 4.7mM KCl，1mM Na2HPO4, 2mM NaH2PO4)，灌裝入試劑瓶中。
[0031]7.陽性對照品的配制:用辣根過氧化物酶穩(wěn)定劑按1: 200的比例稀釋陽性血清，灌裝入試劑管中；
[0032]8.陰性對照品的配制:用辣根過氧化物酶穩(wěn)定劑按1: 200的比例稀釋陰性血清，灌裝入試劑管中。
[0033]將上述的試劑瓶、試劑管及酶標板裝入外包裝盒內(nèi)，組成人抗釀酒酵母IgA類抗體酶聯(lián)免疫檢測試劑盒。
[0034]實施例2試劑盒的檢測方法
[0035]實驗開始前，各試劑均應提前平衡至室溫(試劑不能直接在37°C溶解)；試劑或樣品稀釋時，均需混勻，混勻時盡量避免起泡。實驗前應對樣品進行稀釋，血清按1: 200比例稀釋，以使稀釋后的樣品符合試劑盒的檢測要求。
[0036]1.編號:將樣品對應微孔按序編號，每板應設陰性對照2孔、陽性對照2孔、空白對照2孔(空白對照孔不加樣品及酶標抗體溶液，其余各步操作相同)。
[0037]2.加樣:分別在陰、陽性對照孔中加入陰性對照、陽性對照各100 μ I。然后在待測樣品孔中加入用樣品稀釋液稀釋后的待測樣品100 μ I。加樣時，將樣品加于酶標板孔底部，盡量不觸及孔壁，輕輕晃動混勻。
[0038]3.溫育:室溫溫育30分鐘。
[0039]4.配液:將20倍濃縮洗滌液加蒸餾水稀釋至400ml后備用。
[0040]5.洗滌:棄去酶標板內(nèi)液體，倒扣吸水紙上，輕拍幾次吸干液體。每孔加洗滌液200 μ 1，洗板3次，每次浸泡1-2分鐘，倒扣吸水紙上，輕拍幾次吸干溶液。
[0041 ] 6.加酶:每孔加酶標抗體溶液100 μ I，空白孔除外。
[0042]7.溫育:操作同3。
[0043]8.洗滌:操作同5。
[0044]9.顯色:每孔加入四甲基聯(lián)苯胺(TMB)顯色液100 μ 1，輕輕震蕩混勻，室溫避光顯色15分鐘。
[0045]10.終止:每孔加入終止液100 μ 1，終止反應(此時藍色立轉(zhuǎn)黃色)。終止液的加入順序應盡量與四甲基聯(lián)苯胺(TMB)顯色液的加入順序相同。為了保證實驗結(jié)果的準確性，底物反應時間到后應盡快加入終止液。
[0046]11.測定:選擇450nm波長依序測量各孔的吸光度(0D值)。測定應在加終止液后15分鐘以內(nèi)進行。
[0047]本發(fā)明試劑盒提供的檢測結(jié)果分析過程為:
[0048]1.試驗有效性:
[0049](I)試劑空白標準:空白對照孔平均吸光度值< 0.1 ;
[0050](2)陽性對照品標準:(陽性對照孔平均吸光度值-空白對照孔平均吸光度值)彡1.00 ;
[0051](3)陰性對照品標準:(陰性對照孔平均吸光度值-空白對照孔平均吸光度值)彡0.3o
[0052]2.臨界值計算:臨界值=(陰性對照孔平均吸光度值-空白對照孔平均吸光度值)+0.33。
[0053]3.檢測結(jié)果的解釋:
[0054](I)當(樣品平均吸光度值-空白對照孔平均吸光度值)彡臨界值，結(jié)果為陰性，血清樣本中未檢測出人抗釀酒酵母IgA類抗體；
[0055](2)當(樣品平均吸光度值-空白對照孔平均吸光度值)>臨界值，結(jié)果為陽性，血清樣本中檢測出人抗釀酒酵母IgA類抗體。
【主權項】
1.一種用于定性檢測人抗釀酒酵母IgA類抗體的酶聯(lián)免疫試劑盒，其特征在于它包含以下組分:(I)包被了釀酒酵母細胞壁甘露聚糖抗原的酶標板；(2)酶標抗體溶液；(3)底物顯色液；⑷濃縮洗滌液；(5)終止液；(6)樣品稀釋液；(7)陽性對照品；(6)陰性對照品O2.如權利要求1所述的試劑盒，其特征在于所述酶標抗體為羊抗人抗體，其標記酶為辣根過氧化物酶，酶標抗體溶液為用辣根過氧化物酶穩(wěn)定劑按1: 10000比例稀釋酶標抗體原液而成。3.如權利要求1所述的試劑盒，其特征在于所述濃縮洗滌液為pH值7.4，0.01mol/L的含有0.8%?1.2%吐溫20、0.1%硫柳汞防腐劑的磷酸鹽緩沖液，所述百分含量為質(zhì)量百分含量；終止液為2mol/L的硫酸；樣品稀釋液為pH值7.4,0.01mol/L的含有I %牛血清白蛋白、0.1 %硫柳汞防腐劑的磷酸鹽緩沖液，所述百分含量為質(zhì)量百分含量。4.一種定性檢測樣品中人抗釀酒酵母IgA類抗體的方法，包括步驟:(I)樣品前處理；(2)用權利要求1?3之任一所述的試劑盒進行檢測；(3)分析檢測結(jié)果。5.如權利要求4所述的方法，其中試劑盒檢測為向包被有釀酒酵母細胞壁甘露聚糖抗原的酶標板微孔中加入樣品溶液，溫育后洗滌拍干，再加入酶標抗體，溫育后洗滌拍干，顯色、終止，用酶標儀測定吸光度值。
【文檔編號】G01N33/535GK105987996SQ201510066294
【公開日】2016年10月5日
【申請日】2015年2月9日
【發(fā)明人】徐安龍, 張廣獻, 梁東, 荊琛峰, 周靖宇, 吳赟, 張鴻運, 覃偉恒, 吳松青, 嚴萬兩
【申請人】東莞博捷生物科技有限公司, 東莞中山大學研究院, 廣東中大南海海洋生物技術工程中心有限公司