專利名稱：一種通過構(gòu)建短肽串聯(lián)體酵母表達(dá)質(zhì)粒制備活性小肽的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物工程技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種通過構(gòu)建短肽串聯(lián)體酵母表達(dá)質(zhì)粒來制備活性小肽的方法。
背景技術(shù)：
許多短肽分子量很小，由十幾或幾十個(gè)氨基酸殘基組成，卻是功能性完整的分子，有重要的無法替代的活性。短肽氨基酸數(shù)目少，利用化學(xué)方法合成具有一定優(yōu)勢，但是在多肽化學(xué)合成中，尤其是在活化步驟中，存在著氨基酸消旋化的可能，而且有些分子中含有較多修飾氨基酸殘基，給化學(xué)合成帶來很多麻煩。隨著分子生物學(xué)和基因工程技術(shù)的快速進(jìn)展，人們嘗試?yán)没蚬こ谭ㄖ苽湓S多有重要實(shí)用價(jià)值的生物制品；而且，基因工程方法具有周期短、操作簡單、成本低廉和蛋白質(zhì)產(chǎn)量高的優(yōu)點(diǎn)，在許多短肽的生產(chǎn)中仍具有重要應(yīng)用價(jià)值。由于這些短肽的相對分子質(zhì)量較小，在表達(dá)時(shí)易被宿主蛋白酶降解，利用融合蛋白表達(dá)技術(shù)有利于蛋白質(zhì)性質(zhì)的改良和后期純化，但由于在融合蛋白中短肽所占的比例不高，產(chǎn)量仍然較低。如果將短肽基因串聯(lián)起來，適當(dāng)增加拷貝數(shù)，可以提高表達(dá)量，這在一些短肽如抗菌肽、線性表位、心鈉素、血管緊張素酶抑制劑等的生產(chǎn)方面具有很好的應(yīng)用前景。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明旨在提高上述短肽表達(dá)量，提出一種通過構(gòu)建短肽串聯(lián)體酵母表達(dá)質(zhì)粒制備活性小肽的方法:(I)為使短肽能夠相互連接形成短肽串聯(lián)體，短肽序列需要進(jìn)行一定的修飾。經(jīng)過修飾的短肽5’端含有限制性同尾酶的酶切位點(diǎn)Tl，短肽3’端含有限制性同尾酶的酶切位點(diǎn)T2，其中Tl、T2為一對限制性同尾酶的酶切位點(diǎn)，如XhoI和Sail、XbaI和Nhel、BamHI和BglII等酶切位點(diǎn)。同時(shí)，為使最后表達(dá)出的短肽串聯(lián)體大分子蛋白能夠被分割成單個(gè)短肽蛋白，短肽兩端的酶切位點(diǎn)的內(nèi)側(cè)應(yīng)各含有一個(gè)蛋白切割位點(diǎn)，分別稱之為G1、G2，G1、G2為兩個(gè)不同的蛋白切割位點(diǎn)，均可被各自對應(yīng)的蛋白酶或化學(xué)試劑切割。常見的蛋白切割位點(diǎn)如甲硫氨酸(Met)可被溴化氰(CNBr)切割；天冬酰胺(Asn)-甘氨酸(Gly)可被羥胺(NH2OH)切割；C端的Lys或Arg可被羧肽酶B切割等等。為得到上述能夠用于構(gòu)建短肽串聯(lián)體經(jīng)過修飾的的單個(gè)短肽序列，我們采用SOE-PCR的方法，其具體操作步驟如下:首先，我們根據(jù)SOE-PCR方法設(shè)計(jì)上、下游引物的基本原則，將短肽序列D(氨基酸數(shù)目一般不大于100)的前半部分(短肽堿基數(shù)目的一半即可)命名為Dl，結(jié)合前面所述在其5’端依次加入修飾基因Tl、G1，我們就可以得到用于SOE-PCR的上游引物(5’-3’ ):T1及其保護(hù)堿基一Gl一Dl ;然后，將Dl序列后端的5_10個(gè)堿基和短肽序列D的后半部分合起來命名為D2，其互補(bǔ)序列為D2’(這樣Dl序列后端的5-10個(gè)堿基與D2’序列前端的5-10個(gè)堿基互為互補(bǔ)序列，在進(jìn)行SOE-PCR反應(yīng)時(shí)就能使上下游引物結(jié)合在一起)，結(jié)合前面所述在3’端依次加入修飾基因G2、T2的互補(bǔ)序列G2’、T2’，我們就可以得到用于3(^40 的下游引物(3’-5’):02’一62’一了2’及其保護(hù)堿基互補(bǔ)序列。得到上述引物之后，用SOE-PCR的方法就能得到經(jīng)過修飾的單個(gè)短肽序列，其序列構(gòu)成如下:Tl及其保護(hù)堿基一Gl一D一G2一Τ2及其保護(hù)堿基其中，T1、Τ2為限制性內(nèi)切酶的酶切位點(diǎn)，并且T1、Τ2互為同尾酶；T1、Τ2的保護(hù)堿基(在分子克隆實(shí)驗(yàn)中，有時(shí)我們會(huì)在待擴(kuò)增的目的基因片段兩端加上特定的酶切位點(diǎn)，用于后續(xù)的酶切和連接反應(yīng)，由于直接暴露在末端的酶切位點(diǎn)不容易直接被限制性核酸內(nèi)切酶切開，因此在設(shè)計(jì)PCR引物時(shí)，人為的在酶切位點(diǎn)序列的外側(cè)添加額外的堿基序列，即保護(hù)堿基，用來提高將來酶切時(shí)的活性。加入的保護(hù)堿基序列會(huì)在隨后的酶切反應(yīng)中被切除，因此在設(shè)計(jì)上下游引物時(shí)加入保護(hù)堿基并不會(huì)影響最后的短肽串聯(lián)體序列的蛋白表達(dá))；GU G2為蛋白切割位點(diǎn)，D為短肽序列(由于對短肽的修飾都是在短肽的兩端進(jìn)行，并不會(huì)改變短肽自身序列，因此該方案能夠適用于所有短肽)。(2)在構(gòu)建含有短肽串聯(lián)體的酵母表達(dá)質(zhì)粒時(shí)，由于酵母表達(dá)質(zhì)粒(如酵母表達(dá)質(zhì)粒pPICZa系列等)中通常不同時(shí)含有一對互為同尾酶的兩個(gè)限制性內(nèi)切酶的酶切位點(diǎn)(如酵母表達(dá)質(zhì)粒PPICZa只有XhoI酶切位點(diǎn)而沒有SalI酶切位點(diǎn)，只有XbaI酶切位點(diǎn)而沒有NheI酶切位點(diǎn))，因此直接構(gòu)建含有短肽串聯(lián)體的酵母表達(dá)質(zhì)粒操作性不強(qiáng)。我們的解決方法是:在酵母表達(dá)質(zhì)粒上只有兩個(gè)同尾酶之一 Tl的前提下，我們在酵母表達(dá)質(zhì)粒上選擇位置在Tl之后的任何一個(gè)其他酶切位點(diǎn)，我們稱之為R。然后我們在短肽串聯(lián)體T2之后引入酶切位點(diǎn)R (這樣整個(gè)短肽串聯(lián)體序列就能被包含在酶切位點(diǎn)Tl和R之間)，即酵母表達(dá)質(zhì)粒上有酶切位點(diǎn)Tl和R，而短肽串聯(lián)體上也有酶切位點(diǎn)Tl、R，這樣我們就能將短肽串聯(lián)體通過雙酶切的方法轉(zhuǎn)化進(jìn)酵母表達(dá)質(zhì)粒。因此在構(gòu)建含有短肽串聯(lián)體的酵母表達(dá)質(zhì)粒之前，我們需要先為短肽串聯(lián)體引入酶切位點(diǎn)R。在短肽串聯(lián)體中引入酶切位點(diǎn)R，具體步驟如下:選擇一種質(zhì) 粒X，其含有一對同尾酶Tl、T2酶切位點(diǎn)且同時(shí)含有酵母表達(dá)質(zhì)粒中也有的酶切位點(diǎn)R (如pBluescriptIISK+質(zhì)粒中不僅同時(shí)含有一對同尾酶Xho I和Sail，而且還含有pPICZa酵母表達(dá)質(zhì)粒中也有的Xba1、Sac I1、NotI)，將質(zhì)粒X用T1、T2進(jìn)行雙酶切，瓊脂糖凝膠電泳并回收目的條帶(被兩種酶切開的線性化質(zhì)粒X的長片段)。將上述回收的經(jīng)過雙酶切的質(zhì)粒X的長片段和步驟I得到的經(jīng)過修飾的單個(gè)短肽序列及限制性內(nèi)切酶Tl、限制性內(nèi)切酶Τ2及Τ4連接酶組成混合體系(質(zhì)粒X的長片段、經(jīng)過修飾的單個(gè)短肽序列、Tl、Τ2和Τ4連接酶的物質(zhì)的量之比依次為1:6:1:1:1，混合于IOX反應(yīng)緩沖液，其余體積由水補(bǔ)齊；10Χ反應(yīng)緩沖液組成為(10 X表示使用反應(yīng)緩沖液時(shí)要將其濃度稀釋10倍)，Tris-HCl (pH7.6) 660mmol/L，MgCl266mmol/L，DTT100mmol/L，ATPlmmol/L，NaCllmol/L)。先在37°C溫度條件下(雙酶切反應(yīng)適宜的溫度)雙酶切一定時(shí)間(Ih 2h)，接著將混合體系在16°C溫度條件下(連接酶適宜的溫度)連接一定時(shí)間(Ih 2h)。循環(huán)該過程數(shù)次(10次 20次)后，65°C終止反應(yīng)，醇沉，重懸得到含有不同倍數(shù)短肽串聯(lián)體的重組質(zhì)粒X(由于短肽與短肽之間、形成串聯(lián)體的短肽與質(zhì)粒之間是隨機(jī)連接，因此不同的重組質(zhì)粒含有的短肽串聯(lián)體倍數(shù)不同)。得到的重組質(zhì)粒上不僅有短肽串聯(lián)體，而且串聯(lián)體序列之后有酶切位點(diǎn)R，這樣我們就為短肽串聯(lián)體引入了酶切位點(diǎn)R。由于在短肽基因兩端引入了一對同尾酶的酶切位點(diǎn)，所以在雙酶切后進(jìn)行連接時(shí)，如果兩個(gè)短肽基因正向順次串聯(lián)，則在下一輪酶切時(shí)兩短肽間的連接處將不被切開；而如果兩短肽對向連接，則在下一輪酶切時(shí)兩短肽間的連接處將被切開。這樣，經(jīng)過若干輪的切連反應(yīng)后，將會(huì)只有正確構(gòu)建的順次串聯(lián)短肽的重組質(zhì)粒產(chǎn)生。步驟(2)的意義在于:構(gòu)建重組質(zhì)粒X的目的在于引入能夠把串聯(lián)體轉(zhuǎn)化進(jìn)酵母表達(dá)質(zhì)粒所必須的其他酶切位點(diǎn)。(3)將構(gòu)建好的重組質(zhì)粒X轉(zhuǎn)化到質(zhì)?？寺【曛?常用的克隆菌株有E.coliDH5a、BL21、JM109等)，小量提取質(zhì)粒，雙酶切并測序鑒定，保存含有所需串聯(lián)體個(gè)數(shù)的菌種，并提取含所需倍數(shù)的短肽串聯(lián)體的質(zhì)粒以進(jìn)行表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建。(4)將步驟3得到的含所需串聯(lián)體個(gè)數(shù)的重組質(zhì)粒和酵母表達(dá)質(zhì)粒分別用限制性內(nèi)切酶Tl、限制性內(nèi)切酶R進(jìn)行雙酶切反應(yīng)，瓊脂糖電泳，分別回收重組質(zhì)粒經(jīng)過雙酶切得到的串聯(lián)體片段及空酵母表達(dá)質(zhì)粒經(jīng)過雙酶切得到的長片段。(5)將回收的串聯(lián)體片段和酵母表達(dá)質(zhì)粒長片段加入到含有T4連接酶的連接體系(串聯(lián)體片段:酵母表達(dá)質(zhì)粒:T4連接酶的物質(zhì)的量之比依次為6:1:1，混合于IOX反應(yīng)緩沖液，其余體積由雙蒸水補(bǔ)齊)，在Τ4連接酶適宜的溫度條件連接一定時(shí)間(12h 16h)，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳、膠回收得到含有所需倍數(shù)(由于質(zhì)粒載體的最大插入片段約為10kb，因此根據(jù)短肽的大小便可確定所能夠建的短肽最大串聯(lián)倍數(shù)，然后根據(jù)表達(dá)的需要選擇合適的倍數(shù)，如一短肽大小為lOObp，那么理論上在質(zhì)粒載體上所能夠建的最大串聯(lián)倍數(shù)為100倍，然后根據(jù)表達(dá)的需要，一般可以為I 100倍，進(jìn)一步優(yōu)選為I 50倍，再進(jìn)一步優(yōu)選為I 16倍)短肽串聯(lián)體的表達(dá)質(zhì)粒。(6)將得到的酵母表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到質(zhì)?？寺【曛?，小量提取質(zhì)粒，雙酶切鑒定。(7)將經(jīng)過鑒定、構(gòu)建好的酵母表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化進(jìn)酵母菌GS115中，用濃度為100%的甲醇進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)。(8)取誘導(dǎo)表達(dá) 后的菌液，12000rpm離心2 3min，分別收集上清液和沉淀，根據(jù)所表達(dá)的短肽分泌方式初步確定串聯(lián) 短肽存在于上清液還是沉淀，之后將含有串聯(lián)短肽的上清液或沉淀選擇合適的方法進(jìn)行純化，最后用Gl和G2蛋白切割位點(diǎn)所對應(yīng)的蛋白酶或化學(xué)試劑切割將串聯(lián)短肽切割為目的短肽。本發(fā)明的特點(diǎn)是可以通過該方法用酵母菌高效表達(dá)多種小分子短肽，這些短肽有重要應(yīng)用價(jià)值；此外，利用串聯(lián)短肽質(zhì)粒的高效表達(dá)，產(chǎn)品開發(fā)成本極低。


圖1:實(shí)施例所述的抗菌肽凝膠電泳圖:其中M:核酸maker, I:SOE-PCR得到的抗菌肽。圖2:實(shí)施例1所述的表達(dá)質(zhì)粒pPICZa-T經(jīng)過雙酶切的凝膠電泳圖；其中M:核酸maker, 1:單倍體抗菌肽(makerlOO對應(yīng)位置)。圖3:實(shí)施例2、3、4所述的表達(dá)質(zhì)粒pPICZa-4T、pPICZa-8T、pPICZa_16T經(jīng)過雙酶切的凝膠電泳圖；其中Ml:核酸maker，I:4倍抗菌肽串聯(lián)體(maker400對應(yīng)位置)，2:8倍抗菌肽串聯(lián)體(maker750對應(yīng)位置)，3:16倍抗菌肽串聯(lián)體(maker2000與1000中間對應(yīng)位置)，M2:核酸 maker。圖4:實(shí)施例1所述的表達(dá)質(zhì)粒pPICZa-T的基因測序圖譜。圖5:實(shí)施例2所述的表達(dá)質(zhì)粒pPICZa_4T的基因測序圖譜。
圖6:實(shí)施例3所述的表達(dá)質(zhì)粒pPICZa_8T的基因測序圖譜，由于本測序圖譜中序列較長，因此將該圖譜分為圖6a、圖6b兩個(gè)圖譜。
具體實(shí)施例方式本發(fā)明結(jié)合以下抗菌肽為實(shí)例作進(jìn)一步說明，該實(shí)例不應(yīng)解釋為對本發(fā)明的限制。實(shí)施例1(I)為使抗菌肽兩端各含有一個(gè)同尾酶和一個(gè)蛋白切割位點(diǎn)，因此，在設(shè)計(jì)抗菌肽上、下游引物時(shí)分別引入了 Xho I和Sal I兩種同尾酶的酶切位點(diǎn)。同時(shí)，分別在酶切位點(diǎn)內(nèi)側(cè)于氨基端引入了溴化氰(CNBr)蛋白切割位點(diǎn)甲硫氨酸(Met)的密碼子(ATG);于羧基端引入了羥胺(NH20H)的蛋白切割位點(diǎn)(天冬酰胺(Asn) -甘氨酸(Gly))的密碼子AATGGA?？咕牡幕蚓幋a序列為(其核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示；其氨基酸序列如SEQ ID NO:2 所示):aagtggaagtccttcctgaagaccttcaagtccgctgctaagactgttctgcatactgctctgaaggctatttcctcc ；上游引物(5，-3’):tcgactcgagatgaagtggaagtccttcctgaagaccttcaagtccgctgctaagactgttctg ；下游引物(3’-5’):ctgacttctagagtcgactccattaggaggaaatagccttcagagcagtatgcagaacagtcttag ；

使用上述引物通過SOE-PCR的方法得到經(jīng)過修飾的抗菌肽全長基因如下:tcgactcgagatgaagtggaagtccttcctgaagaccttcaagtccgctgctaagactgttctgcatactgctctgaaggctatttcctccaatgga^tcgactctagaagtcag ；其中5’端有下劃線的CtCRaR是限制性內(nèi)切酶Xho I識別位點(diǎn)，粗體顯示的atg是溴化氰(CNBr)蛋白切割位點(diǎn)；3’端有下劃線的Rtcgac是限制性內(nèi)切酶SalI識別位點(diǎn)，粗體顯示的aatgga是羥胺(NH20H)的蛋白切割位點(diǎn)，其核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示。(2)將 pBluescriptIISK+ 空質(zhì)粒用 Xho I 和 Sal I 在 50 μ L 體系、37°C條件下進(jìn)行雙酶切，瓊脂糖電泳并回收用于構(gòu)建短肽串聯(lián)體重組質(zhì)粒的目的條帶(被兩種酶切開的線性化pBluescriptIISK+質(zhì)粒長片段)。根據(jù)各自的濃度將雙酶切后的pBluescriptIISK+空質(zhì)粒、步驟⑴得到的SOE-PCR產(chǎn)物、Xho 1、Sal I和T4連接酶按適當(dāng)?shù)谋壤?pBluescriptIISK+空質(zhì)粒、SOE-PCR產(chǎn)物、Xho 1、Sal I和T4連接酶物質(zhì)的量之比依次為
I:6:1:1:1)混合在特制的 IOX 反應(yīng)緩沖液(Tris-HCl (pH7.6) 660mmol/L,MgCl266mmol/L，DTT100mmol/L，ATPlmmol/L，NaCllmol/L)中，其余體積由雙蒸水補(bǔ)齊?；旌象w系先在37°C酶切l(wèi)h，接著將混合體系在22°C接lh。循環(huán)該過程10次后，65°C止反應(yīng)，醇沉，重懸分別含有不同倍數(shù)抗菌肽串聯(lián)體的pBluescriptIISK+重組質(zhì)粒,濃度為100mg/mL。(3)將得到的pBluescriptIISK+重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化進(jìn)大腸桿菌DH5 α中，在氨節(jié)青霉素濃度為100mg/L的平板上挑單菌落，小量提取質(zhì)粒、雙酶切并測序鑒定。保存所需菌種(其質(zhì)粒中含有單倍體抗菌肽，即I倍體抗菌肽)，并從中提取質(zhì)粒以進(jìn)行表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建。(4)將pBluescriptIISK+重組質(zhì)粒和空酵母表達(dá)質(zhì)粒pPICZa分別用Xho I和XbaI兩種限制性內(nèi)切酶進(jìn)行雙酶切，瓊脂糖凝膠電泳，分別回收重組質(zhì)粒經(jīng)過雙酶切得到的單倍體抗菌肽片段(其核苷酸序列如SEQ ID N0:4所示)及空酵母表達(dá)質(zhì)粒pPICZa經(jīng)過雙酶切得到的長片段。(5)根據(jù)各自的濃度將回收的單倍體抗菌肽串聯(lián)體片段和雙酶切后的空表達(dá)質(zhì)粒長片段加入含有T4連接酶的連接體系(串聯(lián)體片段:質(zhì)粒:T4連接酶的物質(zhì)的量之比依次為6:1:1，混合于IOX反應(yīng)緩沖液，其余體積由雙蒸水補(bǔ)齊)，在連接酶適宜的溫度條件下(37°C)連接一定時(shí)間(12h 16h)，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳、膠回收得到含有單倍體抗菌肽的表達(dá)質(zhì)粒pPICZa-T,濃度為110mg/mL。(6)將得到的表達(dá)質(zhì)粒pPICZa-T轉(zhuǎn)化進(jìn)Ε.coli DH5a中，在zeocin濃度為50mg/L的平板上挑單菌落，小量提取質(zhì)粒、雙酶切鑒定。(7)將構(gòu)建好的含有單倍體抗菌肽的表達(dá)質(zhì)粒pPICZa-T電轉(zhuǎn)化到酵母菌GS115中，用濃度為100%的甲醇進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)。(8)取誘導(dǎo)表達(dá)后的菌液，12000rpm離心2 3min，分別收集上清液和沉淀，因抗菌肽為分泌表達(dá)，因此目的蛋白存在于上清液，取上清液經(jīng)鎳柱純化抗菌肽，再先后用CNBr和NH2OH將抗菌肽切割為目的短肽，凝膠層析純化后凍干保存。經(jīng)質(zhì)譜分析得到的抗菌肽分子量為2892，薄層掃描得其純度為94%，產(chǎn)率為6mg/L發(fā)酵液。

實(shí)施例2(I)如實(shí)施例1步驟(I)。(2)如實(shí)施例1步驟⑵。(3)將得到的pBluescriptIISK+重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化進(jìn)大腸桿菌DH5 α中，在氨節(jié)青霉素濃度為100mg/L的平板上挑單菌落，小量提取質(zhì)粒、雙酶切并測序鑒定。保存所需菌種(其質(zhì)粒中含有正確串聯(lián)的4倍抗菌肽串聯(lián)體)，并從中提取含4倍抗菌肽串聯(lián)體的質(zhì)粒以進(jìn)行表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建。(4)將pBluescriptIISK+重組質(zhì)粒和空酵母表達(dá)質(zhì)粒pPICZa分別用Xho I和XbaI兩種限制性內(nèi)切酶進(jìn)行雙酶切，瓊脂糖凝膠電泳，分別回收重組質(zhì)粒經(jīng)過雙酶切得到的4倍抗菌肽串聯(lián)體片段(其核苷酸序列如SEQ ID NO: 5所示)及空酵母表達(dá)質(zhì)粒pPICZa經(jīng)過雙酶切得到的長片段。(5)根據(jù)各自的濃度將回收的4倍抗菌肽串聯(lián)體片段和雙酶切后的空表達(dá)質(zhì)粒長片段加入含有T4連接酶的連接體系(串聯(lián)體片段:質(zhì)粒:T4連接酶的物質(zhì)的量之比依次為6:1:1，混合于10Χ反應(yīng)緩沖液，其余體積由雙蒸水補(bǔ)齊)，在連接酶適宜的溫度條件下(37°C)連接一定時(shí)間(12h 16h)，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳、膠回收得到含有4倍串聯(lián)體抗菌肽串聯(lián)體的表達(dá)質(zhì)粒pPICZa-4T，濃度為135mg/mL。(6)將得到的表達(dá)質(zhì)粒pPICZa_4T轉(zhuǎn)化進(jìn)Ε.coli DH5a中，在zeocin濃度為50mg/L的平板上挑單菌落，小量提取質(zhì)粒、雙酶切鑒定。(7)將構(gòu)建好的含有4倍串聯(lián)體抗菌肽串聯(lián)體表達(dá)質(zhì)粒pPICZa_4T電轉(zhuǎn)化到酵母菌GSl 15中，用濃度為100%的甲醇進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)。(8)取誘導(dǎo)表達(dá)后的菌液，12000rpm離心2 3min，分別收集上清液和沉淀，因抗菌肽為分泌表達(dá)，因此目的蛋白存在于上清液，取上清液經(jīng)鎳柱純化串聯(lián)抗菌肽，再先后用CNBr和NH2OH將串聯(lián)抗菌肽切割為目的短肽，凝膠層析純化后凍干保存。經(jīng)質(zhì)譜分析得到的抗菌肽分子量為2892，薄層掃描得其純度為93%，產(chǎn)率為19mg/L發(fā)酵液。
實(shí)施例3(I)如實(shí)施例1步驟(I)0(2)如實(shí)施例1步驟⑵。(3)將得到的pBluescriptIISK+重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化進(jìn)大腸桿菌DH5 α中，在氨節(jié)青霉素濃度為100mg/L的平板上挑單菌落，小量提取質(zhì)粒、雙酶切并測序鑒定。保存所需菌種(其質(zhì)粒中含有正確串聯(lián)的8倍抗菌肽串聯(lián)體)，并從中提取含8倍抗菌肽串聯(lián)體的質(zhì)粒以進(jìn)行表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建。(4)將pBluescriptIISK+重組質(zhì)粒和空酵母表達(dá)質(zhì)粒pPICZa分別用Xho I和XbaI兩種限制性內(nèi)切酶進(jìn)行雙酶切，瓊脂糖凝膠電泳，分別回收重組質(zhì)粒經(jīng)過雙酶切得到的8倍抗菌肽串聯(lián)體片段(其核苷酸序列如SEQ ID NO:6所示)及空酵母表達(dá)質(zhì)粒pPICZa經(jīng)過雙酶切得到的長片段。(5)根據(jù)各自的濃度將回收的8倍抗菌肽串聯(lián)體片段和雙酶切后的空表達(dá)質(zhì)粒長片段加入含有T4連接酶的連接體系(串聯(lián)體片段:質(zhì)粒:T4連接酶的物質(zhì)的量之比依次為6:1:1，混合于IOX反應(yīng)緩沖液，其余體積由雙蒸水補(bǔ)齊)，在連接酶適宜的溫度條件下(37°C)連接一定時(shí)間(12h 16h)，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳、膠回收得到含有8倍串聯(lián)體抗菌肽串聯(lián)體的表達(dá)質(zhì)粒pPICZa-8T，濃度為115mg/mL。(6)將得到的表達(dá)質(zhì)粒pPICZa_8T轉(zhuǎn)化進(jìn)Ε.coli DH5a中，在zeocin濃度為50mg/L的平板上挑單菌落，小量提取質(zhì)粒、雙酶切鑒定。(7)將構(gòu)建好的含有8倍串聯(lián)體抗菌肽串聯(lián)體表達(dá)質(zhì)粒pPICZa_8T電轉(zhuǎn)化到酵母菌GSl 15中，用濃度為100%的甲醇進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)。(8)取誘導(dǎo) 表達(dá)后的菌液，12000rpm離心2 3min，分別收集上清液和沉淀，因抗菌肽為分泌表達(dá)，因此目的蛋白存在于上清液，取上清液經(jīng)鎳柱純化串聯(lián)抗菌肽，再先后用CNBr和NH2OH將串聯(lián)抗菌肽切割為目的短肽，凝膠層析純化后凍干保存。經(jīng)質(zhì)譜分析得到的抗菌肽分子量為2892，薄層掃描得其純度為96%，產(chǎn)率為39mg/L發(fā)酵液。實(shí)施例4(I)如實(shí)施例1步驟(I)0(2)如實(shí)施例1步驟⑵。(3)將得到的pBluescriptIISK+重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化進(jìn)大腸桿菌DH5 α中，在氨節(jié)青霉素濃度為100mg/L的平板上挑單菌落，小量提取質(zhì)粒、雙酶切并測序鑒定。保存所需菌種(其質(zhì)粒中含有正確串聯(lián)的16倍抗菌肽串聯(lián)體)，并從中提取含16倍抗菌肽串聯(lián)體的質(zhì)粒以進(jìn)行表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建。(4)將pBluescriptIISK+重組質(zhì)粒和空酵母表達(dá)質(zhì)粒pPICZa分別用Xho I和Xba I兩種限制性內(nèi)切酶進(jìn)行雙酶切，瓊脂糖凝膠電泳，分別回收重組質(zhì)粒經(jīng)過雙酶切得到的16倍抗菌肽串聯(lián)體片段(其核苷酸序列如SEQ ID NO: 7所示)及空酵母表達(dá)質(zhì)粒pPICZa經(jīng)過雙酶切得到的長片段。(5)根據(jù)各自的濃度將回收的16倍抗菌肽串聯(lián)體片段和雙酶切后的空表達(dá)質(zhì)粒長片段加入含有T4連接酶的連接體系(串聯(lián)體片段:質(zhì)粒:T4連接酶的物質(zhì)的量之比依次為6:1:1，混合于10Χ反應(yīng)緩沖液，其余體積由雙蒸水補(bǔ)齊)，在連接酶適宜的溫度條件下(37°C)連接一定時(shí)間(12h 16h)，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳、膠回收得到含有16倍串聯(lián)體抗菌肽串聯(lián)體的表達(dá)質(zhì)粒pPICZa-16T，濃度為120mg/mL。(6)將得到的表達(dá)質(zhì)粒pPICZa_16T轉(zhuǎn)化進(jìn)E.coli DH5a中，在zeocin濃度為50mg/L的平板上挑單菌落，小量提取質(zhì)粒、雙酶切鑒定。(7)將構(gòu)建好的含有16倍串聯(lián)體抗菌肽串聯(lián)體表達(dá)質(zhì)粒電轉(zhuǎn)化到酵母菌GS115中，用濃度為100%的甲醇進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)。(8)取誘導(dǎo)表達(dá)后的菌液，12000rpm離心2 3min，分別收集上清液和沉淀，因抗菌肽為分泌表達(dá)，因此目的蛋白存在于上清液，取上清液經(jīng)鎳柱純化串聯(lián)抗菌肽，再先后用CNBr和NH2OH將串聯(lián)抗菌肽切割為目的短肽，凝膠層析純化后凍干保存。經(jīng)質(zhì)譜分析得到的抗菌肽分子量為2892，薄層掃描得其純度為94%，產(chǎn)率為67mg/L發(fā)酵液。無需進(jìn)一步詳細(xì)闡述，相信采用前面所公開的內(nèi)容，本領(lǐng)域技術(shù)工作人員可最大限度的應(yīng)用本發(fā)明。因此， 前面的優(yōu)選具體實(shí)施方案應(yīng)理解為僅是舉例說明，而非以任何方式限制本發(fā)明的范圍。
權(quán)利要求
1.一種通過構(gòu)建短肽串聯(lián)體酵母表達(dá)質(zhì)粒制備活性小肽的方法，其步驟如下: (1)將短肽序列D的前半部分命名為D1，在其5’端依次加入修飾基因Tl、Gl，得到上游引物:T1及其保護(hù)堿基一Gl一Dl ;然后，將Dl序列后端的5 10個(gè)堿基和短肽序列D的后半部分合起來命名為D2，其互補(bǔ)序列為D2’，在3’端依次加入修飾基因G2、T2的互補(bǔ)序列G2’、T2’，得到下游引物:D2’一G2’一Τ2’及其保護(hù)堿基互補(bǔ)序列； 用SOE-PCR的方法得到經(jīng)過修飾的單個(gè)短肽序列，其序列構(gòu)成如下: Tl及其保護(hù)堿基一Gl一D一G2一T2及其保護(hù)堿基 其中，Tl、T2為限制性內(nèi)切酶的酶切位點(diǎn)，并且Tl、T2互為同尾酶；G1、G2為蛋白切割位點(diǎn)，D為短肽序列； (2)選擇質(zhì)粒X，其含有一對同尾酶T1、T2酶切位點(diǎn)且同時(shí)含有酵母表達(dá)質(zhì)粒中也有的酶切位點(diǎn)R，將質(zhì)粒X用Tl、Τ2進(jìn)行雙酶切，瓊脂糖凝膠電泳并回收目的條帶；將上述回收的經(jīng)過雙酶切的質(zhì)粒X的長片段和步驟(I)得到的經(jīng)過修飾的單個(gè)短肽序列及限制性內(nèi)切酶Tl、限制性內(nèi)切酶Τ2、Τ4連接酶組成混合體系，先在37°C溫度條件下雙酶切Ih 2h，接著將混合體系在16°C溫度條件下連接Ih 2h ;循環(huán)該過程數(shù)次后，65°C終止反應(yīng)，醇沉，重懸得到含有不同倍數(shù)短肽串聯(lián)體的重組質(zhì)粒X ;得到的重組質(zhì)粒上不僅有短肽串聯(lián)體，而且串聯(lián)體序列之后有酶切位點(diǎn)R，這樣我們就為短肽串聯(lián)體引入了酶切位點(diǎn)R ； (3)將構(gòu)建好的重組質(zhì)粒X轉(zhuǎn)化到質(zhì)?？寺【曛?，小量提取質(zhì)粒，雙酶切并測序鑒定，保存含有所需串聯(lián)體個(gè)數(shù)的菌種，并提取含所需倍數(shù)的短肽串聯(lián)體的質(zhì)粒以進(jìn)行表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建； (4)將步驟(3)得到的含所需串聯(lián)體個(gè)數(shù)的重組質(zhì)粒和酵母表達(dá)質(zhì)粒分別用限制性內(nèi)切酶Tl、限制性內(nèi)切酶R進(jìn)行雙酶切反應(yīng)，瓊脂糖電泳，分別回收重組質(zhì)粒經(jīng)過雙酶切得到的串聯(lián)體片段及空酵 母表達(dá)質(zhì)粒經(jīng)過雙酶切得到的長片段； (5)將回收的串聯(lián)體片段和酵母表達(dá)質(zhì)粒長片段加入到含有T4連接酶的連接體系，在T4連接酶適宜的溫度條件連接12h 16h，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳、膠回收得到含有所需倍數(shù)短妝串聯(lián)體的表達(dá)質(zhì)粒； (6)將得到的酵母表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到質(zhì)?？寺【曛校×刻崛≠|(zhì)粒，雙酶切鑒定； (7)將經(jīng)過鑒定、構(gòu)建好的酵母表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化進(jìn)酵母菌GS115中，進(jìn)行100%甲醇誘導(dǎo)表達(dá)； (8)取誘導(dǎo)表達(dá)后的菌液，離心2 3min，分別收集上清液和沉淀，之后將含有串聯(lián)短肽的上清液或沉淀選擇合適的方法進(jìn)行純化，最后用Gl和G2蛋白切割位點(diǎn)所對應(yīng)的蛋白酶或化學(xué)試劑切割將串聯(lián)短肽切割為目的短肽，從而制備得到活性小肽。
2.如權(quán)利要求1所述的一種通過構(gòu)建短肽串聯(lián)體酵母表達(dá)質(zhì)粒制備活性小肽的方法，其特征在于:步驟(2)中質(zhì)粒X的長片段、經(jīng)過修飾的單個(gè)短肽序列、T1、T2和Τ4連接酶的物質(zhì)的量之比依次為1:6:1:1:1。
3.如權(quán)利要求1所述的一種通過構(gòu)建短肽串聯(lián)體酵母表達(dá)質(zhì)粒制備活性小肽的方法，其特征在于:步驟(3)中質(zhì)粒克隆菌株為Ε.coli DH5a、BL21或JM109。
4.如權(quán)利要求1所述的一種通過構(gòu)建短肽串聯(lián)體酵母表達(dá)質(zhì)粒制備活性小肽的方法，其特征在于:步驟⑶中短肽串聯(lián)體的倍數(shù)為I 16倍。
5.如權(quán)利要求1所述的一種通過構(gòu)建短肽串聯(lián)體酵母表達(dá)質(zhì)粒制備活性小肽的方法，其特征在于:步驟(5)中串聯(lián)體片段、酵母表達(dá)質(zhì)粒、T4連接酶的物質(zhì)的量之比依次為6:·1:1。
全文摘要
一種通過構(gòu)建短肽串聯(lián)體酵母表達(dá)質(zhì)粒制備活性小肽的方法，屬于生物工程技術(shù)領(lǐng)域。用SOE-PCR的方法擴(kuò)增得到短肽的全長基因；將若干短肽的基因定向串聯(lián)起來；將得到的串聯(lián)基因構(gòu)建到酵母菌的表達(dá)載體中，進(jìn)而轉(zhuǎn)化酵母菌；誘導(dǎo)表達(dá)串聯(lián)多肽并切割成目的短肽。本發(fā)明的特點(diǎn)是可以通過該方法用酵母菌高效表達(dá)多種小分子短肽，這些短肽有重要應(yīng)用價(jià)值；此外，利用串聯(lián)短肽質(zhì)粒的高效表達(dá)，產(chǎn)品開發(fā)成本極低。
文檔編號C12N15/81GK103194483SQ20131015008
公開日2013年7月10日 申請日期2013年4月19日 優(yōu)先權(quán)日2013年4月19日
發(fā)明者施維, 趙昊, 張桂榮, 李全順, 于洋, 林雪貞 申請人:吉林大學(xué)